Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe
1 de diciembre de 2017
Los protocolos presentados describen cómo realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe de las muestras de suero de los receptores de la vacuna de influenza. El primer ensayo determina las concentraciones óptimas de antígeno viral por hemaglutinación. El segundo ensayo cuantifica los títulos de anticuerpos específicos de la gripe por inhibición de la hemaglutinación.
El objetivo general de este ensayo de inhibición de hemaglutinación es medir los títulos de anticuerpos contra virus específicos de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la vacinología sobre la inmunidad mediada por vacunas y la protección dentro de diferentes poblaciones y entre diversos grupos de edad y pacientes. Las principales ventajas de esta técnica son su precisión y la posibilidad de determinar rápidamente el título de anticuerpos neutralizantes presentes.
Aunque este método puede proporcionar información sobre los títulos de anticuerpos humanos, también puede aplicarse a otros sistemas, como los títulos de anticuerpos en suero de ratón o también en sobrenadantes de cultivo. Comience etiquetando placas de microtitulación de 96 pocillos con la información experimental adecuada. Luego gire la placa en orientación vertical y use una pipeta multicanal para agregar 25 microlitros de PBS a cada pocillo, excepto al primer pocillo de la fila de titulación inferior trasera.
Agregue 50 microlitros de la solución de antígeno recién preparada de interés al primer pocillo de la fila de titulación posterior, seguido por la adición de 25 microlitros de muestras de suero tratadas con RDE a los primeros pocillos de las diez filas superiores. Agregue 25 microlitros del antisuero apropiado al primer pocillo de la fila 11 como control positivo. Luego transfiera 25 microlitros del primer pocillo de cada fila a sus pocillos sucesivos para realizar diluciones seriadas, dobles.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces en cada paso de dilución, descartando los últimos 25 microlitros de los pozos finales. A continuación, añadir 25 microlitros de la solución de antígeno a cada pozo de las filas uno a once y 25 microlitros de PBS únicamente a cada pozo de la fila de titulación posterior. Agitar cuidadosamente la placa 10 veces sobre cada uno de los cuatro lados para mezclar.
Luego, cubra la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de solución de glóbulos rojos a cada pocillo y mezcle la placa con golpecitos adicionales. Luego, vuelva a cubrir la placa e incube los glóbulos rojos según la especie utilizada, como se indica en la tabla.
Después de agregar los glóbulos rojos a la placa, respete el tiempo de incubación adecuado según el tipo de sangre utilizado en el ensayo. Una incubación demasiado corta o demasiado larga conducirá a una interpretación incorrecta de los resultados. Al final de la incubación, evalúe la hemaglutinación inclinando la placa 90 grados durante 25 segundos y registre los resultados para cada pocillo, mientras la placa aún esté inclinada, en un esquema impreso de la placa de 96 pocillos.
En este experimento, se evaluó la respuesta de anticuerpos inducida por la vacuna en 26 voluntarios sanos que recibieron una vacuna inactivada trivalente contra la influenza que contenía las cepas influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 y B/Massachusetts/O2/2012 antes de la temporada de influenza 2015. Se observó una respuesta inmunitaria cruzada contra las cepas virales A/H3N2/Switzerland/2013 y A/H3N2/Texas/2012, con títulos geométricos medios de inhibición de hemaglutinación significativamente más bajos y una seroprotección inducida menor contra la influenza A/H3N2/Switzerland/2013 en comparación con la influenza A/H3N2/Texas/2012. Después de la vacunación, los títulos de anticuerpos contra ambas cepas aumentaron, aunque la cepa A/H3N2/Switzerland/2013 no estuviera presente en la vacuna.
La hemaglutinina viral demuestra un potencial dependiente de la especie para la hemaglutinación de eritrocitos. Es de interés que la sangre de hámster dorado no hemaglutina adecuadamente con el virus de la influenza B, y que la sangre de pavo tiene potencial para la hemaglutinación con títulos altos y baja reactividad cruzada. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en tres horas si se realiza correctamente.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar tratar el suero con EDR para inactivar cualquier inhibidor inespecífico y la unión inespecífica durante la hemaglutinación del virus. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA para responder preguntas adicionales sobre el papel de inmunoglobulinas específicas frente al patógeno. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología viral profundizaran en el entendimiento de la inmunidad relacionada con las vacunas en pacientes sanos e inmunosuprimidos dentro de diferentes grupos de edad.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar títulos de anticuerpos específicos frente a cepas de influenza a gran escala. No olvide que trabajar con antígenos virales, sangre animal y muestras de suero humano puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en un laboratorio BSL2, al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta protocolos para realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación con el fin de cuantificar títulos de anticuerpos específicos contra la influenza a partir de muestras de suero. El método es crucial para comprender la inmunidad mediada por vacunas en diferentes poblaciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Vacunología
- Inmunología
- Serología
Antecedentes
- El ensayo de inhibición de hemaglutinación mide las respuestas de anticuerpos contra la influenza.
- Proporciona información sobre la eficacia de las vacunas y la inmunidad poblacional.
- Este método puede aplicarse a diversos tipos de muestras, incluyendo suero humano y de ratón.
- Comprender los títulos de anticuerpos es esencial para evaluar el rendimiento de las vacunas.
Objetivo del estudio
- Cuantificar los títulos de anticuerpos específicos contra la influenza en personas vacunadas.
- Evaluar la respuesta inmunitaria en diferentes grupos demográficos.
- Proporcionar un método rápido y preciso para la determinación de títulos.
Métodos Utilizados
- Etiquetado de placas microtituladoras de 96 pocillos con información experimental.
- Uso de una pipeta multicanal para añadir PBS a los pocillos.
- Realización de hemaglutinación para determinar las concentraciones óptimas de antígeno viral.
- Llevado a cabo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar títulos de anticuerpos.
Resultados principales
- El ensayo cuantifica con precisión los títulos de anticuerpos contra la influenza.
- Demuestra la presencia de anticuerpos neutralizantes en muestras de suero.
- Los resultados pueden orientar el desarrollo de vacunas y las estrategias de salud pública.
- El método es adaptable a diversos tipos de muestras y poblaciones.
Conclusiones
- El ensayo de inhibición de hemaglutinación es una herramienta confiable para medir las respuestas inmunitarias.
- Esta técnica mejora la comprensión de la inmunidad inducida por vacunas.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otras infecciones virales y poblaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de títulos de anticuerpos específicos contra la influenza es esencial para evaluar la inmunidad inducida por vacunas y orientar las evaluaciones de inmunogenicidad en el desarrollo preclínico y clínico. El ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI) proporciona un método estandarizado y rápido para medir las respuestas de anticuerpos neutralizantes en diversas poblaciones, apoyando decisiones basadas en datos sobre continuar o no continuar en el avance de la cadena de desarrollo de vacunas. Al permitir el análisis de reactividad cruzada entre cepas y la optimización de eritrocitos específicos por especie, este ensayo aumenta la confianza predictiva en estudios de inmunología traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza las respuestas inmunitarias mediadas por vacunas mediante la cuantificación de títulos de anticuerpos específicos para cada cepa, lo que apoya la desactivación mecanicista de dianas antigénicas.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de la hemaglutinina como un antígeno clave de la influenza mediante la inhibición de la aglutinación viral.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Estandariza las concentraciones de antígeno mediante la titulación de hemaglutinación (HA), asegurando entradas reproducibles para el cribado posterior de inhibición de hemaglutinación (HI).
- Valor operativo: Permite el cribado de sueros a alto rendimiento mediante diluciones seriadas al doble en formato de 96 pocillos, mejorando la escalabilidad del ensayo.
- Valor científico: Minimiza la reactividad cruzada mediante la selección empírica de glóbulos rojos de animales (por ejemplo, de cobaya, de pavo), aumentando la especificidad del ensayo para el virus de la influenza B y cepas heterólogas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mide la seroprotección inducida por la vacuna y los títulos medios geométricos (GMT) en cohortes sanas, proporcionando biomarcadores traslacionales de inmunogenicidad.
- Valor operativo: Permite la comparación multifuncional de las respuestas inmunitarias entre grupos de edad y poblaciones de pacientes mediante puntos de corte estandarizados de títulos.
- Valor científico: Detecta respuestas inmunitarias cruzadas frente a cepas no incluidas en la vacuna (por ejemplo, A/H3N2/Switzerland/2013), lo que aporta información para el diseño de vacunas de amplio espectro.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo de IH se integra en el flujo de trabajo de inmunogenicidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica, proporcionando datos cuantitativos de anticuerpos que orientan la selección de antígenos, la optimización de adyuvantes y los estudios de determinación de dosis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre la eficacia de vacunas mediante la medición de la inhibición funcional de la hemaglutinación por anticuerpos.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles de títulos a partir de diluciones seriadas, lo que permite la evaluación confiable de compuestos o candidatos a vacunas.
- Análisis: Genera títulos finales y medias geométricas que permiten la comparación estadística de las respuestas inmunitarias entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta con la continuidad preclínica al evaluar la inmunogenicidad en modelos animales (por ejemplo, suero de ratón) antes de los ensayos en humanos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de serología aplicable a múltiples cepas de influenza y formatos de vacunas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la inmunidad inducida por vacunas mediante la medición de títulos de anticuerpos neutralizantes como un correlato de protección.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad del ensayo mediante la preparación estandarizada del antígeno, suero tratado con RDE y tiempos de incubación con eritrocitos específicos para cada especie.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar precozmente una inmunogenicidad insuficiente, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos vacunales según la amplitud del título cruzado entre cepas y las tasas de seroprotección.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología y serología para manipular antígenos virales, preparar suero tratado con RDE e interpretar los puntos finales de hemaglutinación.
- Depende del acceso a instalaciones que cumplan con el nivel de bioseguridad BSL2 para la manipulación segura de virus de la influenza y productos sanguíneos humanos/animales.
- Necesita la estandarización de fuentes de eritrocitos (por ejemplo, conejillo de indias, pavo, humano grupo O) para minimizar la reactividad cruzada y asegurar la aglutinación específica por especie.
- Requiere controles precisos de tiempo durante la incubación de eritrocitos para evitar lecturas falsas negativas o falsas positivas de hemaglutinación.
- Se limita a la medición de la actividad funcional de los anticuerpos; no cuantifica clases de inmunoglobulinas no neutralizantes ni no funcionales sin ensayos complementarios (por ejemplo, ELISA).
