Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe

El objetivo general de este ensayo de inhibición de la hemaglutinación es medir los títulos de anticuerpos contra virus específicos de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la vacunología sobre la inmunidad y la protección mediadas por vacunas en diferentes poblaciones y en varios grupos de edad y pacientes. Las principales ventajas de esta técnica son que es precisa y que permite la determinación rápida de la presencia de anticuerpos neutralizantes.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los títulos de anticuerpos humanos, también se puede aplicar a otros sistemas, como los títulos de anticuerpos para suero de ratón, también a los sobrenadantes de cultivo. Comience etiquetando placas de microtitulación de 96 pocillos con la información experimental adecuada. A continuación, gire la placa en orientación vertical y utilice una pipeta multicanal para añadir 25 microlitros de PBS a cada pocillo, excepto al primer pocillo de la fila de valoración inferior posterior.

Agregue 50 microlitros de la solución de antígeno recién preparada de interés al primer pocillo de la fila de valoración posterior, seguido de la adición de 25 microlitros de muestras de suero tratadas con RDE a los primeros pocillos de las diez filas superiores. Añadir 25 microlitros del antisuero adecuado al primer pocillo de la 11ª fila como control positivo. Transfieren 25 microlitros desde el primer pocillo de cada fila a sus pocillos sucesivos para realizar diluciones en serie y dobles.

Pipetear hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces para cada paso de dilución, desechando los últimos 25 microlitros de los últimos pocillos. A continuación, agregue 25 microlitros de la solución de antígeno a cada pocillo de las filas del uno al 11 y 25 microlitros de PBS solo a cada pocillo de la fila de valoración posterior. Golpee el plato con cuidado 10 veces en los cuatro lados para mezclar.

A continuación, cubra el plato durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de solución de glóbulos rojos a cada pocillo y mezcle la placa con más golpecitos. A continuación, vuelva a tapar la placa e incube los glóbulos rojos según la especie utilizada como se indica en la tabla.

Después de agregar los glóbulos rojos a la placa, respete el tiempo de incubación adecuado para el tipo de sangre utilizada en el ensayo. Una incubación demasiado corta o demasiado larga dará lugar a una interpretación incorrecta de los resultados. Al final de la incubación, evalúe la hemaglutinación inclinando la placa 90 grados durante 25 segundos y marque los resultados para cada pocillo, mientras la placa aún está inclinada, en un esquema impreso de la placa de 96 pocillos.

En este experimento, se evaluó la respuesta de anticuerpos inducida por la vacuna en 26 voluntarios sanos que recibieron una vacuna trivalente inactivada contra la influenza que contenía influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 y B/Massachusetts/O2/2012 antes de la temporada de influenza del 24 2015. Se observó una respuesta inmunitaria de reacción cruzada para las cepas de los virus A/H3N2/Switzerland/2013 y A/H3N2/Texas/2012, con títulos de inhibición de la hemaglutinación media geométrica significativamente más bajos y seroprotección inducida contra la gripe A/H3N2/Suiza/2013 en comparación con la gripe A/H3N2/Texas/2012. Después de la vacunación, los títulos de anticuerpos contra ambas cepas aumentaron, a pesar de que la cepa A/H3N2/Suiza/2013 no estaba presente en la vacuna.

La hemaglutinina viral demuestra un potencial dependiente de la especie para la hemaglutinación de eritrocitos. De interés, la sangre de conejillo de indias no se hemaglutina adecuadamente con la influenza B y la sangre de pavo tiene el potencial de hemaglutinación con títulos altos y una baja reactividad cruzada. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en las tres horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar suero con RDE para inactivar cualquier inhibidor inespecífico y unión inespecífica durante la hemaglutinación del virus. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA para responder preguntas adicionales sobre el papel de las inmunoglobulinas específicas de patógenos individuales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología viral avanzaran en nuestra comprensión de la inmunidad relacionada con las vacunas en pacientes sanos e inmunodeprimidos dentro de diferentes grupos de edad.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de inhibición de la hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la cepa de influenza a gran escala. No olvide que trabajar con antígenos virales, sangre animal y muestras de suero humano puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como trabajar en un laboratorio BSL2 mientras se realiza este procedimiento.