Un método de aislamiento de grado clínico novedoso para Stromal células de riñón humano perivasculares

El objetivo general de este método de aislamiento de grado clínico es aislar células estromales perivasculares de riñón humano, o kPSC, para el tratamiento terapéutico celular de diversas enfermedades renales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como la idoneidad de los kPSC humanos para la terapia celular de enfermedades renales y trasplantes. Las principales ventajas de esta técnica son que es clínica y que puede utilizarse para generar un número suficiente de kPSC para fines de terapia celular.

Ellen Lievers, una técnica en nuestro laboratorio, demostrará la prueba funcional de las kPSC. Antes de comenzar el procedimiento de aislamiento de células renales, conecte una bandeja de perfusión esterilizada a un baño de agua en posición vertical. Una vez que la bandeja de perfusión se haya calentado con el agua, cambie la bandeja a la posición horizontal, manteniéndola conectada al baño de agua, y luego coloque un tubo L/S 25 en la bomba.

Coloque las pinzas de cultivo en un extremo del tubo y deje que el tubo descanse en el fondo de la bandeja. Coloque gasa estéril encima del tubo para evitar obstrucciones y conecte un adaptador luer al otro extremo del tubo; luego agregue aproximadamente 100 mililitros de medio a la bandeja e inicie el lavado del tubo L/S 25 a una velocidad de bomba de 100 mililitros por minuto. Para aislar las células renales, transfiera el riñón desde las bolsas estériles dobles hacia la bandeja de perfusión estéril y use tijeras y tracción suave para eliminar el tejido adiposo perirrenal y la cápsula renal.

Una vez localizada la arteria renal en el parche aórtico, utilice la espiga accesoria para canular la arteria renal y asegure la espiga con una brida esterilizada. Con la bomba encendida, conecte el extremo del tubo de la bomba al conector luer. Luego, lave el riñón con el medio contenido en la bandeja a un flujo de 100 mililitros por minuto.

A continuación, agregue 20 mililitros de colagenasa y 2,5 mililitros de DNAsa a la bandeja de perfusión, y permita que las enzimas digieran el riñón, girando suavemente el órgano de vez en cuando a mano hasta que se ablande y el líquido de perfusión comience a enturbiarse. La duración de la digestión con colagenasa es crítica; si es demasiado corta, se formarán agregados celulares, mientras que si es demasiado larga, provocará muerte celular. Al final de la perfusión enzimática, masajee suavemente el riñón hasta obtener una suspensión celular, y retire el material no digerido y la espiga.

Añada 50 mililitros de suero humano normal a la suspensión celular y, con la bomba a baja velocidad de flujo, coloque el tubo conectado al riñón por encima de varios tubos de recolección de 50 mililitros para permitir que la suspensión celular drene desde la bandeja de perfusión hacia los tubos de recolección. Una vez recolectadas todas las células, centrifugue las suspensiones celulares y lave los pellet dos veces con medio de lavado suplementado con 10% de suero humano normal. Después del segundo lavado, re suspenda los pellet en un volumen igual de medio de cultivo celular al del volumen de los pellet celulares.

Para cultivar las células renales crudas, agregue aproximadamente un mililitro de suspensión celular a 24 mililitros de medio de cultivo celular alfa-MEM con lisado de plaquetas al 5 % por matraz de cultivo celular T 175, e incube los matraces a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Después de dos días, retire el sobrenadante y los restos celulares, y alimente las células con 25 mililitros de medio de cultivo celular fresco. Cuando las células estén confluentes, aísle la fracción positiva para NG2 mediante separación celular magnética, según los protocolos estándar.

Luego siembre cuatro veces 10 a la tercera células positivas para NG2 por centímetro cuadrado en un matraz de cultivo celular de tamaño adecuado, y coloque el matraz en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células alcancen una confluencia del 90 al 100 %, recopile el sobrenadante y lave las células adherentes dos veces con PBS. Desprenda las células con el volumen adecuado de tripsina según el tamaño del matraz, deteniendo la reacción con el sobrenadante reservado después de cinco minutos.

Resuspenda suavemente las células, luego transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de tamaño adecuado para la centrifugación, y siembre las células nuevamente a una densidad de cuatro veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado. A veces, después del enriquecimiento de NG2, las células dejan de proliferar o comienzan a crecer en estructuras tridimensionales. Esto puede resolverse tratando las células con tripsina y sembrándolas nuevamente.

Después de cuatro a cinco pasajes, siembre las cPSC en una placa de seis pocillos a una concentración de dos veces 10 a la quinta células por dos mililitros de medio por pocillo, y siembre cinco veces 10 a la quinta células epiteliales tubulares proximales en dos mililitros de medio para células epiteliales tubulares proximales por pocillo en una placa de seis pocillos separada. Coloque ambas placas en el incubador de cultivo celular durante 48 horas, recogiendo al final del periodo de incubación el sobrenadante de las cPSC, luego retire el sobrenadante de las células epiteliales tubulares proximales y utilice una punta de pipeta amarilla para hacer un rasguño en la monocapa celular en el fondo de cada pocillo. Lave las células rayadas con PBS y añada el medio condicionado proveniente de los cultivos de células estromales vasculares renales.

Luego, capture imágenes de la herida a las cuatro, ocho, 12 y 24 horas en la misma posición marcada mediante un microscopio invertido de campo claro para evaluar el porcentaje de cierre a lo largo del tiempo. Las células estromales perivasculares renales son células adherentes al plástico, de forma fusiforme, que son positivas para los marcadores de células estromales y perivasculares, y negativas para los marcadores CD31, CD34, CD45 y HLA-DR. Típicamente, se puede obtener una población homogénea de células estromales perivasculares renales en el pase cuatro, alcanzando las células la senescencia alrededor del pase nueve a 10.

En este ensayo representativo de rasguño de herida, para evaluar la capacidad funcional de las kPSC, cuando se añadió medio acondicionado de una cultura de células estromales perivasculares renales, la herida se cerró significativamente más rápido que en los pocillos cultivados con el medio de control. Una vez dominada la técnica de aislamiento primario, esta tomará aproximadamente dos horas; se necesitará de uno a dos meses para generar una población homogénea de kPSC. Durante la realización de este procedimiento, es importante detener el tratamiento con colagenasa tan pronto como el riñón se vuelva blando y los líquidos sean menos transparentes.

Además de los procedimientos demostrados aquí, estas técnicas también podrían utilizarse para el aislamiento de células estromales perivasculares de otros órganos sólidos. Las cPSC aisladas con esta técnica pueden emplearse para estudiar el potencial regenerativo de estas células en varios modelos diferentes de enfermedad renal y trasplante. Después de ver este video, debería ser capaz de aislar y cultivar cPSC de manera clínicamente calificada.

No olvide que trabajar con material humano conlleva el riesgo de transmisión de virus; siempre tome precauciones como realizar pruebas para VIH, hepatitis B y hepatitis C al realizar este procedimiento.