Name: Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda ecocardiografía e histología para evaluar la morfología cardíaca en modelos transgénicos de ratón. Este protocolo económico permite examinar la función cardíaca en condiciones fisiológicas y patológicas.

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El trabajo fue apoyado por el gobierno francés (Agencia Nacional de investigación, ANR) a través del programa de "Inversiones para el futuro" LABEX SIGNALIFE (referencia ANR-11-LABX-0028-01) y por donaciones a K. W. D. de la Asociación pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France y Plan de cáncer Inserm. D. B. y a. V. recibieron becas de la Fundación pour la Recherche Médicale y de la ciudad de Niza, respectivamente. La ecocardiografía transesofágica y el transductor fueron amablemente proporcionados por Philips. Agradecemos A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, Martres A., A. Biancardini y S. M. Wagner por su ayuda técnica especializada.

los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo en cumplimiento de las leyes de bienestar animal francés e institucionales pertinentes, directrices y políticas. Que hayan sido aprobados por el Comité de ética francés (Comité Institutionnel d &#39; l Ethique Pour &#39; animales de laboratorio; número NCE/2012-106).
 1. ecocardiografía <ol><li>determinar el peso del cuerpo del ratón con una balanza de laboratorio estándar mientras sujeta suavemente por la cola para asegurar la colocación apropiada.</li>
	<li>Anestesiar el animal por la inyección intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26. 
	Nota: Puede utilizarse cualquier otro tipo de anestesia si se utiliza el mismo protocolo durante todo el estudio. Ventajas y desventajas serán discutidos abajo.</li>
	<li>Poner el ratón de nuevo en su jaula y esperar hasta que sea insensible, muestra respiración constante y pie posterior reflejos están ausentes. Para probar esto, apriete ligeramente un pie y observe si la pierna todavía se retrae.</li>
	<li>Afeitar el lado izquierdo del tórax y la axila izquierda con una afeitadora roedor comercial. 
	Nota: El uso de una máquina de afeitar roedor dedicado permite la eliminación completa del pelo del ratón fino para evitar interferencias en la medición ecocardiográfica. Soluciones o cremas de eliminación de pelo comerciales deben evitarse, ya que son generalmente perfumadas, que perturbarán el animal después que despierta. Evite afeitar excesivo, ya que aumenta la pérdida de calor.</li>
	<li>Poner el animal para dormir en una almohadilla caliente situada a 40-42 ° C en una posición superficial de lado izquierdo, con la cabeza a las 12 o &#39; reloj y la cola en 6 o &#39; reloj. Fijar el brazo izquierdo, pierna izquierda y la cola con cinta de.</li>
	<li>Aplicar previamente calentado ecocardiografía gel en el pecho depilado y la cabeza del transductor de.</li>
	<li>Coloque el transductor paraesternal izquierda, encaminándolo hacia el lado derecho del cuello para obtener una vista de dos dimensiones (2D) paraesternal eje largo a nivel del músculo papilar. Gire el transductor 90° para obtener una vista de eje corto a nivel de músculo papilar. Utilice un ajuste de la profundidad mínima y un zoom para maximizar la imagen calidad y velocidad de fotogramas. Ajustar la velocidad de barrido al máximo.
	<ol><li>Para obtener estos ajustes, diferentes zoom y configuración de opciones de profundidad puede usarse, dependiendo de la máquina y el software. Grabar imágenes de modo M guiado por 2D en eje corto ven el 27. Consulte la figura 1A y B 27. 
		Nota: tenga cuidado de no aplicar demasiada presión en el pecho, ya que puede causar bradicardia.</li>
	</ol></li> <li>Serie de registro por lo menos 3 de 3 corazón cine beat bucles para cada animal. 
	Nota: Para el software de la ecocardiografía transesofágica utilizado en este estudio, presione el &#34; adquirir/Save &#34; el botón sólo una vez. Esta metodología es específica a la ecocardiografía transesofágica con este software en particular. Otros paquetes de software se pueden utilizar con máquinas diferentes.</li>
	<li>Después de exitosas grabaciones, limpie la ecocardiografía del gel del tórax de ratón, cojín de calentamiento y transductor. Retire la cinta de las extremidades y la cola.</li>
	<li>Deja el ratón bajo observación en la almohada, cubierta con papel para evitar la innecesaria exposición y calor pérdida de luz, hasta que despierta arriba</li>
	<li>Puso el animal de nuevo en su caja.</li>
	<li>Analizar registró imágenes modo M paraesternal eje corto para determinar dimensiones de (LV) ventriculares izquierdas y función. Medir el espesor de la pared anterior de la LV en sístole y diástole (LVAWs y LVAWd), el LV telesistólico y telediastólico diámetros internos (LVIDs y LVIDd) y el espesor de la pared posterior del LV (LVPW) en sístole y diástole (LVPWs y LVPWd) utilizando el identificación de la interfaz de tejido sanguíneo en las imágenes almacenadas.</li>
	<li>Medir las dimensiones de la diastólicas en el momento de las aparente dimensiones diastólicas máximas LV y LV telesistólico dimensiones en el momento de la excursión sistólica más anterior de la pared posterior del LV. Toque la pantalla táctil en el &#34; analizar &#34; icono y luego en el &#34; LVAWd &#34; icono. Coloque la pinza electrónica en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior de la LV en diástole.</li>
	<li>Coloque la pinza electrónica en la interfase entre la pared anterior del LV y la cavidad del LV para obtener el espesor de pared anterior diastólico LV; el software cambiará directamente a la medición diastólica final interna LV.</li>
	<li>Coloque la pinza en la interfaz entre la cavidad del LV y la pared posterior del LV para obtener el diámetro telediastólico interno LV; cambiará el software a la medida de espesor de pared posterior de LV.</li>
	<li>Coloque la pinza en la interfase entre la pared posterior de la LV y el pericardio para obtener el espesor de la pared posterior diastólica de LV. Dimensiones sistólica del LV, toque la pantalla táctil en el &#34; LVAWs &#34; icono y posición de la pinza electrónica en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior del LV en sístole.</li>
	<li>Coloque la pinza electrónica en la interfase entre la pared anterior del LV y la cavidad del LV para obtener el espesor de pared anterior sistólica del LV. Repita el proceso como se describe anteriormente para el diámetro telesistólico interno de LV y el espesor de pared posterior sistólica del LV. Utilizar la Convención de punta aprobada por la sociedad americana de ecocardiografía para trazar los bordes endocárdico y epicárdico 13 , 27. 
	Nota: Los parámetros de la función contráctil del LV se calculan automáticamente usando las medidas anteriores. LV (FS) del acortamiento fraccional se define como FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La fracción de eyección del LV (EF) se calcula con la fórmula de Teicholz modificada, donde EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Consulte la figura 1A y B.</li>
	<li>Almacenar los datos en discos compactos o sticks de memoria USB y hacer copias de seguridad.</li>
	<li>Importación, analizar y exportar los datos utilizando el software correspondiente. 
	Nota: Después de estas mediciones iniciales, el experimento puede hacer una pausa. Si se realiza una comparación directa entre animales knockout y hermanos de camada de tipo salvaje, proceder con el análisis histológico 6. Para Cre-ERT2; líneas de ratón de LOX/lox, continúe al día siguiente con la inducción de tamoxifeno por inyección i.p., como se describe 5 , 24. Si la inducción experimental de infarto de miocardio por ligadura de la arteria coronaria izquierda 5 , 28, podría realizar la cirugía inmediatamente después de las mediciones ecocardiográficas, cuando los ratones están bajo anestesia. De lo contrario, un retardo mínimo de una semana entre las dos rondas de la anestesia debe mantenerse para limitar la tasa de letalidad postoperatoria.</li>
</ol> 2. Preparación de muestras de corazón para la evaluación histológica <ol><li>sacrificar a los animales por dislocación cervical. Medir su peso corporal. Desinfectar el pecho y el abdomen mediante una torunda de alcohol al 70%.</li>
	<li>Hacer una incisión transversal en la piel 1 cm distal del esternón. Con unas pinzas embotadas, retirar la piel del tórax, en la dirección de la cabeza. Sostener el esternón ligeramente con unas pinzas finas y abra el diafragma insertando el extremo despuntado de tijeras finas.</li>
	<li>Cortar las costillas en ambos lados paralelo al esternón. Mover el esternón en dirección a la cabeza. Coloque el corazón en el tórax. Mantenga el tronco vascular del corazón con las pinzas finas y cortar por debajo con unas tijeras finas.</li>
	<li>Abre el cofre y suprimir el entero corazón fuera del tórax, medir el peso del corazón y establecer un corazón peso proporción 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 
	<li>Fijar el corazón en 2 mL de solución de formalina tamponada neutra 10% en tubos de 15 mL durante la noche a 4 ° C. 
	PRECAUCIÓN: peligro! Trabajo con soluciones de formalina debe realizarse en una campana de vapores químicos; Use guantes y gafas de seguridad. 
	Nota: Como la composición del tampón para soluciones de formalina varía con los diferentes proveedores, utilizar el mismo proveedor durante todo el estudio.</li>
	<li>Al día siguiente, cortar los corazones en el plano transversal, en el centro y transferirlas en cassettes para inclusión en parafina, que se realiza en el laboratorio de patología, utilizando un aparato automatizado empotrar.</li>
	<li>Realizar seccionamiento.
	<ol><li>Bloques de parafina de sección en un grosor de 3 μm utilizando un micrótomo y flotar en un agua de 40 ° C baño que contiene agua destilada.</li>
		<li>La transferencia de las secciones en diapositivas. Deje que los portaobjetos se seque durante la noche en una incubadora de 37 ° C y almacenarlos a 4 ° C hasta que esté listo para uso. 
		Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí hasta que el usuario esté listo para la tinción (paso 3).</li>
	</ol></li> <li>Deparaffinize y rehidratar el tejido correderas.
	<ol><li>Coloque los portaobjetos en tinción frascos con insertos de vidrio en un horno de 55 ° C durante 10 minutos derretir la parafina.</li>
		<li>Desparafinizar el portaobjetos en dos cambios de 200 mL de xileno o sustituto de xileno durante 5 minutos. 
		PRECAUCIÓN: Altamente inflamable y tóxico. Trabajar en una campana de vapores químicos; Use guantes y gafas de seguridad.</li>
		<li>Transfiera los portaobjetos a 200 mL de alcohol al 100%. Hacer dos cambios de 3 minutos cada uno y una vez la transferencia a través de 200 mL de alcohol 95% por 3 minutos 
		PRECAUCIÓN: Altamente inflamable! Mantener alejado de fuentes de ignición; no fumar.</li>
		<li>Enjuague dos veces en 200 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos y continúe con el paso 3, 4 o 5.</li>
	</ol></li></ol> 3. Hematoxilina y eosina <ol><li>enjuague los portaobjetos con las secciones en agua destilada.</li>
	<li>Teñir los núcleos con solución de hematoxilina durante 8 min.</li>
	<li>Enjuague en agua corriente durante 10 minutos</li>
	<li>Tinción con solución de eosina durante 2 min.</li>
	<li>Deshidratar tres veces por 2 min en 100% de etanol (EtOH). Claro tres veces por 2 minutos xileno o sustituto de xileno. Monte en un medio de montaje con xileno.</li>
	<li>Fotografía las diapositivas y mida el diámetro del cardiomiocito a nivel del núcleo en secciones longitudinales del tabique interventricular. Medir por lo menos 100 células por tramo y tres por corazón.</li>
</ol> 4. Tinción de WGA <ol><li>incubar los portaobjetos de paso 2.7 con tetramethylrhodamine (u otros tintes fluorescentes)-conjugado WGA (1: 100 en PBS) durante 60 min a temperatura ambiente en cámara húmeda.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Monte con fluorescencia media con DAPI de montaje. Almacenar a 4 ° C en la oscuridad antes del análisis. 
	PRECAUCIÓN: Use protección ocular y guantes resistentes a productos químicos compatibles.</li>
	<li>Fotografiar las diapositivas.
	<ol><li>Uso un microscopio equipado con fluorescencia epi-iluminación y filtro establece para DAPI y tetramethylrhodamine (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la abertura al máximo y el brillo a la exposición.</li>
		<li>Acquire separado imágenes con 400 aumentos para el azul y el rojo canales. Abra las imágenes en ImageJ. Ajustar el brillo y contraste si fuera necesario (imagen &#62; ajuste &#62; brillo/contraste).</li>
		<li>Set cada imagen a 8 bits (imagen de &#62; tipo &#62; 8 bits). Superposición de las imágenes de DAPI y WGA. Utilizar el canal azul para DAPI y el canal rojo para WGA; Establezca los canales verdes y gris en ninguno (imagen &#62; Color &#62; combinar canales) 31.</li>
	</ol></li> <li>Determinar los diámetros de cardiomiocitos en el nivel del núcleo en secciones transversales del septo interventricular.
	<ol><li>Definir la escala de las imágenes en ImageJ. Para ello, fotografiar un objeto de tamaño conocido (por ejemplo, una cámara del hemocitómetro en el mismo aumento como las secciones de corazón; paso 4.4).</li>
		<li>Utilice la herramienta de línea recta a trazar una línea desde el principio hasta el final de la estructura conocida (analizar &#62; ajustar escala). 
		Nota: La distancia en píxeles se mostrará automáticamente; la unidad de longitud y distancia conocida debe introducirse. Proceder con las mediciones de cardiomiocitos en el nivel del núcleo.</li>
		<li>Trazar una línea recta de la membrana positivo WGA por el núcleo positivo DAPI para el sitio opuesto de la membrana celular de WGA-positivo (analizar &#62; medida). En la ventana resultados, asegúrese de que los valores de longitud tienen un significativo número de lugares decimales (analizar &#62; establecer medidas &#62; lugares decimales).</li>
		<li>Medir por lo menos 100 células por tramo y tres por el corazón. Exportar los resultados a Excel (haga clic en resultados &#62; archivo &#62; guardar como &#62; .csv) 6 , 31.</li>
	</ol></li></ol> 5. Inmunotinción de PECAM-1 <ol><li>realizar antígeno desenmascaramiento.
	Buffer <ol><li>añadir 1.600 mL de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6.0) en una olla a presión. Coloque la olla a presión sobre la placa y convertirlo en potencia. No fije la tapa de la olla a presión en este punto; simplemente apoyarlo en la parte superior. 
		PRECAUCIÓN: Caliente!</li>
		<li>Una vez que este hirviendo el buffer de citrato de sodio, transfiera los portaobjetos de paso 2.5 a la olla a presión. Asegure la tapa de la olla a presión. En cuanto la olla ha alcanzado la presión, espere 7 minutos. Cuando han transcurrido 7 minutos, apagar la placa y coloque la olla a presión en un tanque vacío. Activar la válvula de liberación de presión y deje correr agua fría sobre la olla. Una vez que se ha presurizado, abra la tapa y deje correr agua fría en la olla por 5 min lugar las diapositivas en 200 mL de PBS. 
		Nota: Como alternativa, microondas desenmascaramiento del antígeno podría utilizarse, aunque aumenta el riesgo de sobrecalentamiento.</li>
	</ol></li> <li>Uso 0.3% peróxido de hidrógeno en metanol a bloque actividad de peroxidasa endógena por 5 min enjuague los portaobjetos tres veces durante 2 minutos cada uno en 200 mL de PBS. 
	PRECAUCIÓN: Inflamable y tóxico!</li>
	<li>Incube los portaobjetos durante 15 min en suero bloqueo normal diluido (5% de suero normal de cabra en PBS) que también contiene un bloque de avidina (4 gotas en 1 mL).</li>
	<li>Cuidadosamente el líquido de las secciones de toque e incubar con el anticuerpo de Pecam-1 de conejo, diluido 1:50 en PBS con suero normal de cabra de 2,5% y 4 gotas de bloque de biotina por mL. Incube los portaobjetos durante la noche en cámara húmeda a 4 ° C.</li>
	<li>Lave los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS. Incubar las secciones con biotinilado cabra anti-conejo IgG anticuerpo diluido 1: 200 en PBS con suero de cabra normal 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS.</li>
	<li>Incubar a tsecciones de con un sistema basado en avidina/biotina peroxidasa durante 20 min (reactivo A y reactivo B necesidad combinadas 30 minutos antes de usar). Lavar los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS.</li>
	<li>Disolver 1 3,3 &#39;-diaminobenzidina (DAB) y peróxido de hidrógeno de 1 urea tableta en 5 mL de agua destilada doble. Incubar las secciones con solución de DAB por aproximadamente 3 minutos, cuidadosamente monitoreo desarrollo de color. Detener la reacción de color lavando suavemente el portaobjetos en 200 mL de PBS. 
	PRECAUCIÓN: Cancerígeno; guantes resistentes a químicos!</li>
	<li>Contratinción los núcleos de 6 minutos con hematoxilina. Lavar en el chorro del grifo durante 2 min deshidratar tres veces de 2 minutos cada uno en 200 mL de alcohol al 100%. Claro tres veces durante 2 minutos cada uno en 200 mL de xileno o sustituto de xileno. Monte en un medio de montaje con xileno.</li>
	<li>Fotografía las diapositivas (por lo menos diez campos con 40 aumentos del septo interventricular de cada corazón) y medir la densidad de área de Pecam-1 usando el libremente disponible de software ImageJ 31. Use el plugin de 32 color deconvolución para DAB y hematoxilina y ajustar el contraste de la imagen al mismo nivel. 
	Nota: en caso de que el color marrón y púrpura/azul tienen una superposición espectral significativa, que puede causar dificultades con deconvolución de color, uno podría tratar de diferentes marcas de hematoxilina en solución para obtener coloración nuclear transparente, de color azul. Alternativamente, podría realizar inmunofluorescencia o conteo manual de los tubos capilares.</li>
</ol>

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<li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+versus+venous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se han desarrollado diferentes métodos para evaluar la estructura cardiaca y la función en los ratones, incluyendo ecocardiografía, poner en contraste-realzado MRI, micro CT y PET scan. Debido a su eficacia y simplicidad, la ecocardiografía es la técnica más ampliamente utilizada para el análisis funcional en ratones11. En general, debido al pequeño tamaño del corazón y el de alta frecuencia del ritmo cardíaco en ratones, transductores con una frecuencia de &#62; debe utilizarse 10 MHz, aunque se ...

Una gran variedad de modelos de ratón modificados genéticamente están disponibles, y el número de los estudios farmacológicos en ratones es alta1,2. Ecocardiografía y MRI son métodos utilizados para la caracterización fenotípica de la función cardiaca y la morfología de estos modelos de mouse3. El protocolo presentado pretende analizar la función cardiaca y morfología en ratones adultos. Combina ecocardiográfica, histológicos, immunohistochemical y. La examinación ecocardiográfica es ampliamente utilizada en ratones4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachón et al. 11 identificó 205 estudios publicados en circulación, la Investigación de circulación, Revista americana de fisiología - fisiología circulatoria y corazóne Investigación Cardiovascular entre 2012 y 2015 utilizan la examinación ecocardiográfica en animales.
La ecocardiografía se utiliza para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, así como para analizar la función cardiaca en hipertrofia inducida por sobrecarga crónica, isquemia miocárdica y cardiomiopatía modelos en ratones (revisados en12). Equipo de ecocardiografía mejorada permite la medida estándar de ventricular izquierda (LV) sistólicas y diastólicas dimensiones, Doppler tisular, ecografía de contraste miocárdico y la evaluación de la función regional del VI y reserva coronaria 12. idealmente, la examinación ecocardiográfica debe realizarse en ratones conscientes para evitar los efectos negativos de la anestesia sobre la función contráctil, control reflejo autonómico, y ritmo cardíaco11. Sin embargo, este enfoque está limitado por la necesidad de entrenar a los animales; dificultades para mantener la temperatura corporal estable; artefactos de movimiento; estrés; frecuencias cardíacas muy altas; y el requisito de al menos dos investigadores para llevar a cabo el experimento, especialmente si un gran número de animales está bajo investigación. Curiosamente, un estudio reciente divulgó ningunas diferencias en parámetros ecocardiográficos en animales entrenados y no entrenados19. Realizamos las mediciones ecocardiográficas en ratones anestesiados. Protocolos de anestesia diferentes se discutirá a continuación.
Aunque la ecocardiografía de resolución estándar (&#62; 10 MHz) es suficiente para medir LV sistólico y diastólicas dimensiones y función cardiaca en ratones adultos, el método es limitado en su descripción de los fenómenos estructurales subyacentes. Por lo tanto, combinamos las mediciones en vivo con histológicos y análisis immunohistological para medir, por ejemplo, la densidad diámetro y buque de cardiomiocitos. Otras investigaciones histológicas e immunohistological, tales como la determinación de la proliferación, la examinación de apoptosis, medidas del tamaño del infarto, la determinación de la fibrosis y la expresión del marcador específico, también se pueden realizar en el mismo tipo de procesado del tejido, pero no son objeto del presente Protocolo. La combinación de en vivo la examinación ecocardiográfica con análisis histológicos ofrece ideas adicionales sobre alteraciones estructurales subyacentes. En un paso adicional, podemos completar estas medidas con investigaciones moleculares y ultraestructurales. Análisis histológicos no sólo completan la examinación ecocardiográfica pero también se convierten en indispensables cuando la resolución de la ecocardiografía no es suficiente. Esto es especialmente el caso en modelos de ratones modificados genéticamente que son letales embrionarios23,24.

<table><tbody><tr><td>Aglutinina de germen de trigo (WGA) tetrametilrodamina conjugada</td><td>Life Technologies, Sondas moleculares</td><td>W849</td><td></td></tr><tr><td>Cabra biotinilada Anticuerpo IgG</td><td>Vectorlabs</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de bloqueo de avidina/biotina</td><td>Vectorlabs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidasa, estándar)</td><td>Vectorlabs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidina comprimidos Sigma</td><td></td><td>D4168</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Pecam-1 (CD31)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Gel de transmisión por ultrasonidos, Gel Aquasonic 100</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ultrasonido lineal, L15-7io</td> Ecocardiógrafo <td>Philips Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, IE33 xMATRIX</td><td>Microscopio Philips Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Leica DMi8</td> Juego de filtros de fluorescencia <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td> Juego de filtros <td>Leica</td><td>11525304</td><td></td></tr><tr><td>TxR Cámara</td> digital <td>Leica</td><td>11525310</td><td></td></tr><tr><td>, SPOT RT3 Color Slider</td><td>Spot Software</td> de imagen para imágenes<td></td><td></td></tr><tr><td>, SPOT 5.2 Software avanzado y básico</td><td>Computadora de imágenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>puntuales Tijeras finas</td><td>Dell</td><td></td> Herramientas de ciencia fina 14028-10 <td></td></tr><tr><td>Tijeras grandes</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora de roedores</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-0243</td><td></td></tr><tr><td>casetes para incrustación de parafina</td><td>Sakura</td><td>4155F</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra</td><td>Sakura</td><td>8727</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sakura</td><td>8733</td><td></td></tr><tr><td>Parafina TEK III</td><td>Sakura</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>aparato de inclusión automatizado, Tissue-Tek VIP</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>estación de inclusión en parafina Tissue-Tek TEC 5</td><td>Sakura</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>hojas de micrótomo,Accu-Edge S35</td><td>Sakura</td><td>4685</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopía, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>1408</td><td></td></tr><tr><td>cajas portaobjetos</td><td>Sakura</td><td>3958</td><td></td></tr><tr><td>solución de eosina</td><td>Sakura</td><td>8703</td><td></td></tr><tr><td>solución de hematoxilina</td><td>Sakura</td><td>8711</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo, RM2125RT</td><td>Leica</td><td>720-1880 (VWR)</td><td></td></tr><tr><td>baño de agua, Leica HI1210</td><td>Leica</td><td>720-0113(VWR)</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>ACRO444220050</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 ml</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>placa de vidriera</td><td>VWR</td><td>MARI4220004</td><td></td></tr><tr><td>frascos de tinción</td><td>VWR</td> Incubadora de <td>MARI4200005</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Binder</td><td>9010-0012</td><td></td></tr><tr><td>DAB y tabletas de peróxido de hidrógeno urea, SIGMAFAST 3,3&prime;-Tabletas de diaminobenzidina Sigma</td><td></td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific 70011044</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Un creciente número de modelos de ratón modificados genéticamente se ha convertido en disponible en los últimos años. Por otra parte, el número de los estudios farmacológicos realizados en ratones es alta. Caracterización fenotípica de estos modelos de ratón también requiere el examen de la morfología y la función cardiaca. La ecocardiografía y la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) son métodos utilizados para caracterizar la función cardiaca y morfología en ratones. Equipo ecocardiográfico y MRI especializado para uso en pequeños roedores es costoso y requiere un espacio dedicado. Este protocolo describe mediciones cardiacas en ratones usando un sistema ecocardiográfico clínico con una sonda vascular humano 15 MHz. Las mediciones se realizan en ratones adultos anestesiados. Al menos tres secuencias de imágenes se registran y se analizan para cada animal en modo M en la vista de eje corto paraesternal. Luego, la examinación histológica cardíaca se lleva a cabo, y cardiomiocitos diámetros se determinan con hematoxilina-aglutinina eosina o germen de trigo (WGA)-tinción de secciones de la parafina. Densidad del barco es determinada morfométricamente immunostaining de Pecam-1. El protocolo ha sido aplicados con éxito a los estudios farmacológicos y diferentes genética los modelos animales bajo las condiciones iniciales, así como después de infarto experimental por la ligadura permanente de la izquierda (anterior) de la arteria coronaria descendente CHAVAL). En nuestra experiencia, investigación ecocardiográfica se limita a los animales anestesiados y es factible en ratones adultos pesa por lo menos 25 g.

En la figura 1, representante ecocardiográficas grabaciones demuestran la utilidad de la ecocardiografía para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente. Puede identificar fácilmente la diferencia entre un ratón con función cardíaca normal (figura 1A) y un animal con un ventrículo izquierdo dilatado y función reducida de la LV (figura 1B). Figura 2</stro...

La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.

Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

El objetivo general de este examen ecocardiográfico combinado con investigaciones histológicas es examinar la función y la morfología cardíacas en diferentes modelos de ratones transgénicos bajo condiciones basales y fisiopatológicas. Para comenzar, mientras sostiene ligeramente a un ratón por la cola, utilice una balanza de laboratorio estándar para determinar el peso corporal del animal. Después de anestesiar al ratón según el protocolo descrito, presione ligeramente un pie trasero y observe si la pata se retrae.Utilice una afeitadora comercial para roedores para afeitar el lado izquierdo del tórax y la axila izquierda. Coloque al animal sobre una almohadilla tibia ajustada a 40-42 grados Celsius en posición lateral izquierda, con la cabeza a las 12 en punto y la cola a las 6 en punto. Luego, use cinta adhesiva para fijar el brazo izquierdo, la pata izquierda y la cola.Aplique gel para ecocardiografía precalentado sobre el pecho afeitado y la cabeza del transductor. A continuación, coloque el transductor ecocardiográfico en posición paraesternal izquierda, dirigiéndolo hacia el lado derecho del cuello para obtener una vista bidimensional longitudinal paraesternal a nivel del músculo papilar. Luego gire el transductor 90 grados en sentido horario para obtener una vista transversal.Establezca una profundidad mínima y un zoom para maximizar la calidad de la imagen y la velocidad de cuadro. Ajuste la velocidad de barrido al máximo. Registre imágenes en modo M con guía 2-D en vista de acceso corto.Registre al menos tres series de tres semilazos cardíacos para cada animal. Después de obtener grabaciones exitosas, retire la cinta de las extremidades y la cola. Limpie el gel de ecocardiografía del calentador del tórax del ratón y del transductor.Deje al ratón bajo observación sobre la almohadilla calefactora, cubierto con tejido para evitar la exposición innecesaria a la luz y la pérdida de calor hasta que despierte. Luego devuelva al animal a la jaula. Analice las imágenes registradas en modo M desde la vista de acceso corto para determinar las dimensiones y la función del ventrículo izquierdo o VI.Utilizando la identificación de la interfaz sangre-tejido en las imágenes almacenadas, mida el grosor de la pared anterior del VI en sístole y diástole, los diámetros internos del VI en sístole final y diástole final, y el grosor de la pared posterior del VI en sístole y diástole. Mida las dimensiones diastólicas en el momento del aparente tamaño máximo del VI en diástole y las dimensiones del VI en sístole final al final de la excursión sistólica más anterior de la pared posterior del VI. Toque la pantalla táctil sobre el icono de análisis y luego sobre el icono LVAWd.Coloque el calibrador electrónico en la interfaz entre la cavidad del ventrículo derecho y la pared anterior del VI en diástole. A continuación, coloque el calibrador electrónico en la interfaz entre la pared anterior del VI y la cavidad del VI para obtener el grosor diastólico de la pared anterior del VI. Coloque el calibrador en la interfaz entre la cavidad del VI y la pared posterior del VI para obtener el diámetro interno y diastólico del VI.Coloque el calibre en la interfaz entre la pared posterior del VI y el pericardio para obtener el grosor diastólico de la pared posterior del VI. Para las dimensiones sistólicas del VI, toque la pantalla táctil en el icono LVAWs y coloque el calibre electrónico en la interfaz entre la cavidad del ventrículo derecho y la pared anterior del VI en sístole. Coloque el calibre electrónico en la interfaz entre la pared anterior del VI y la cavidad del VI para obtener el grosor sistólico de la pared anterior del VI.Coloque el calibre en la interfaz entre la cavidad del ventrículo izquierdo (VI) y la pared posterior del VI para obtener el diámetro interno y sistólico del VI. Coloque el calibre en la interfaz entre la pared posterior del VI y el pericardio para obtener el espesor sistólico de la pared posterior del VI. Después de sacrificar los animales según el protocolo descrito en el texto, mida sus pesos corporales.Luego, utilice un hisopo con alcohol al 70 % para desinfectar el tórax y el abdomen. Realice una incisión transversal en la piel, un centímetro distal al esternón. A continuación, utilizando fórceps romos, retire la piel del tórax moviéndose en dirección a la cabeza.Con pinzas finas, sostenga ligeramente el esternón y abra el diafragma insertando el extremo romo de unas tijeras finas. Corte la caja torácica por ambos lados paralelamente al esternón. A continuación, mueva el esternón en dirección a la cabeza.Localice el corazón en la cavidad torácica. Con pinzas finas, sostenga el tronco vascular del corazón y use tijeras finas para cortar por debajo del órgano. Luego mida el peso del corazón y establezca la relación entre el peso del corazón y el peso corporal.Transfiera el corazón a dos mililitros de solución de formalina tamponada neutra al 10 % en un tubo de 15 mililitros y fije el órgano a cuatro grados Celsius durante la noche. Para realizar la tinción con aglutinina de germen de trigo o WGA, coloque las laminillas previamente preparadas en aglutinina de germen de trigo conjugada con tetrametilrodamina y incube las muestras a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante sesenta minutos. Use PBS para lavar las muestras tres veces durante cinco minutos cada una.Luego, utilice un medio de montaje con fluorescencia que contenga DAPI para montar las secciones. Almacénelas a cuatro grados Celsius en la oscuridad antes del análisis. Estas grabaciones ecocardiográficas representativas demuestran la utilidad de la ecocardiografía para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente.La diferencia entre un ratón con función cardíaca normal y un animal con un ventrículo izquierdo dilatado o VI y función del VI reducida puede identificarse fácilmente. Aquí se muestra una comparación de las mediciones del diámetro de los cardiomiocitos en animales sin y con hipertrofia cardíaca, utilizando secciones de corazón en parafina teñidas con H&E y mediciones de secciones longitudinales de tejido cardíaco. Esta figura ilustra la medición de los diámetros transversales de los cardiomiocitos utilizando secciones de parafina teñidas con WGA procedentes de corazones de ratones controles y animales con hipertrofia cardíaca.Estos paneles muestran la utilidad de la inmunohistoquímica de PECAM1 en secciones cardíacas para determinar la densidad vascular en tejido cardíaco normal y en corazones con angiogénesis aumentada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La ecocardiografía transtorácica ofrece un método no invasivo para la evaluación de la función cardiaca en ratones. Una combinación de ultrasonido y las modalidades de Doppler puede ser usado para obtener mediciones dimensionales del corazón y el flujo sanguíneo intracardíaco, que en conjunto proporcionan una evaluación de la presión sistólica y el rendimiento cardiaco diastólico.

Ecocardiografía transtorácica en ratones

Este video demuestra el uso de un carril montado en alta frecuencia de la sonda de ultrasonido para realizar un ecocardiograma en un ratón anestesiado. Los métodos de describir tanto las mediciones convencionales de dos dimensiones y en modo M de la función cardíaca, además de nuevos y más potentes herramientas como el color de Doppler, análisis de las cepas, así como imágenes de contraste general y específica.

Ecocardiografía murino y la ecografía

Este video describe un protocolo para realizar ecocardiografía en un ratón de laboratorio.

Ecocardiografía de ratón: una técnica no invasiva para evaluar la morfología cardíaca

Este artículo proporciona un protocolo para la evaluación ecocardiográfica del tamaño ventricular derecha e hipertensión pulmonar en los ratones. Las aplicaciones incluyen la determinación del fenotipo y la evaluación de serie en modelos de ratón inducido por la toxina de la cardiomiopatía y la enfermedad vascular pulmonar transgénicos y.

Evaluación ecocardiográfica de la parte derecha del corazón en ratones

El objetivo de este protocolo es evaluar de forma no invasiva los cambios estructurales y funcionales cardiacas en un modelo de ratón de la enfermedad cardíaca creado por constricción de la aorta transversal, utilizando B y en modo M ecocardiografía y color / de pulso Doppler de onda.

Evaluación de la cardíaco morfológica y funcional Los cambios en el modelo de ratón de la constricción de la aorta transversa por ecocardiográfico Imaging

Este protocolo proporciona una descripción detallada del enfoque ecocardiográfico para el fenotipado completo del corazón y la función de las válvulas cardíacas en ratones.

Enfoques y Protocolos para la Integral ecocardiográficos Caracterización fenotípica en las valvulopatías en ratones

El siguiente protocolo describe la metodología para la adquisición y análisis de imágenes ecocardiográficas utilizadas para obtener el volumen de la aurícula izquierda (LAV) de diámetro, aorta (Ao), y el diámetro de la arteria pulmonar (AP) en ratones. Esta técnica es un procedimiento no invasivo, no terminal que permite la evaluación de la función cardiopulmonar.

Murino de Ecocardiografía del atrio izquierdo, la aorta y arteria pulmonar

Aquí describimos y comparamos dos posiciones para obtener la vista apical de cuatro cámaras en ratones. Estas posiciones permiten la cuantificación de la función ventricular derecha, proporcionan resultados comparables y se pueden utilizar indistintamente.

Medición ecocardiográfica de parámetros diastólicos ventriculares derecho en ratón

En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.

Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

El presente protocolo describe la evaluación ecocardiográfica de la morfología, función y flujo sanguíneo coronario del ventrículo izquierdo en ratones neonatos de 7 días de edad.

Caracterización ecocardiográfica de la estructura, función y flujo coronario del ventrículo izquierdo en ratones neonatos

Este artículo detalla los métodos de diagnóstico de cardiopatía congénita (CHD) murina mediante ecocardiografía fetal, necropsia y captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) mediante microscopía confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrucción tridimensional (3D).

Una tubería para caracterizar defectos cardíacos estructurales en el ratón fetal

Aprenda ecocardiografía e histología para evaluar la morfología cardíaca en modelos transgénicos de ratón. Este protocolo económico permite examinar la función cardíaca en condiciones fisiológicas y patológicas.

Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

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