Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR
30 de diciembre de 2017
La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).
El objetivo general de este procedimiento es un método rápido y eficiente para diseccionar las alas de las pupas de Drosophila adecuado para inmunodetecciones o ensayos de PCR. El procedimiento aquí descrito fue desarrollado por la demanda de encontrar un método rápido y eficiente para obtener muestras de alas de pupa adecuadas para realizar ensayos de PCR o protocolos de inmunodetección. Con un pincel húmedo, retire suavemente la pupa de APF de cero horas de los viales de cultivo y colóquelos en viales nuevos para completar el período de desarrollo.
Por ejemplo, si se usa una pupa que es APF de 24 horas, se dejaría en el vial solo 22 horas. A las 22 horas, transfiera la pupa al portaobjetos del microscopio con la cinta adhesiva de doble cara adherida a ella. Esta transferencia se puede hacer usando un pincel para evitar dañar la pupa.
La pupa debe colocarse formando una fila con los lados dorsales hacia arriba y los extremos cefálicos mirando en la misma dirección. Después de esto, regrese el portaobjetos del microscopio a una temperatura constante y permita que la pupa complete el tiempo de desarrollo adecuado. En este caso, serían 24 horas.
El portaobjetos del microscopio con la cinta adhesiva de doble cara será una plataforma de disección transitoria para extraer la caja de pupa. Durante las dos horas en el portaobjetos del microscopio, la caja de la pupa se secará, por lo que se puede romper fácilmente con pinzas. El primer paso en la disección es eliminar la pupa del cadáver.
Luego, la pupa se transferirá a un portaobjetos diferente con cinta adhesiva de doble cara adherida a ella. El cadáver quedará atrás. Esta pupa se pegará con el lado ventral hacia arriba, colocado en el centro de la cinta.
Antes de realizar el corte del ala, la pupa debe cubrirse con una solución de acuerdo con el procedimiento mediante inmunohistoquímica. Esta solución será afijadora y el ala se liberará de la cutícula. Con unas pinzas, retire suavemente el opérculo de la pupa.
Rompe el estuche con pinzas, haciendo una línea a lo largo del costado de la pupa hasta el extremo caudal de la misma. Con la iluminación adecuada, es posible visualizar la forma interna de la pupa, creando un espacio evidente justo encima de la bisagra del ala de la pupa. Este espacio sirve de guía para realizar la apertura sin dañar la pupa.
A medida que el estuche se abre lateralmente, será posible retirar partes del mismo, recogiéndolos por el borde abierto y llevándolos al lado opuesto donde los sujetará la cinta de doble cara. Al final de la disección, la pupa estará casi desnuda. Solo un pedazo de estuche cubrirá la punta posterior.
Con la ayuda de las pinzas, empuje suavemente hacia abajo el resto de la caja. Este movimiento elevará el extremo interior de la pupa, permitiendo que tanto la cabeza como el tórax permanezcan en una posición preferencial para mantenerse pegados al siguiente paso. Toma un nuevo portaobjetos con cinta adhesiva de doble cara e inviértelo en la pupa.
A continuación, presione ligeramente para que la pupa se pegue a la cinta y deslice suavemente la corredera para separar la pupa del resto de los estuches. Invierta el portaobjetos del microscopio. La pupa estará pegada en la parte dorsal a la altura de la cabeza o de la zona del tórax.
Para uso en inmunohistoquímica, cubra toda la pupa desnuda con un 4% de paraformaldehído. Después de 10 minutos en afijador, con la ayuda de unas tijeras, haga una pequeña incisión en la región de la bisagra del ala o cerca de ella. Permita que el afijo llegue al epitelio del ala.
Luego, después de cinco minutos, rasgue con pinzas los bordes de la cutícula, expandiendo el orificio y permitiendo la liberación del epitelio del ala del saco de la cutícula. Una vez que se libere el tejido del ala, déjelo en la solución de paraformaldehído hasta completar 30 minutos de fijación. El método de disección descrito en este video se puede utilizar para preparar muestras de alta calidad de alas de pupa de Drosophila de diferentes etapas de desarrollo para muchos tipos de técnicas.
El protocolo podría realizarse para diseccionar una pupa o varias pupas al mismo tiempo. Esto ayuda a acelerar el procedimiento, lo que facilita llegar a un gran número de alas disecadas. Para sacar la pupa desnuda de la caja abierta, es importante que la punta posterior sea lo suficientemente pequeña.
Aunque es posible eliminar una fila de cuatro o cinco pupas desnudas a la vez, no es un punto relevante, pudiendo eliminar las que quedan adheridas a su estuche en pasos sucesivos utilizando una sola cinta adhesiva de doble cara. Esta es una imagen confocal de un ala APF de 24 a 30 horas. La tinción muestra la expresión de la proteína parcheada, el receptor canónico del erizo, los núcleos y los filamentos de actina.
Un proceso de disección similar podría utilizarse para obtener muestras de alas más grandes para aislar el ARNm. Este ARNm se puede utilizar para sintetizar ADNc que se puede utilizar en reacciones de PCR. A continuación mostramos los productos obtenidos para detectar la expresión de parches y actina.
El protocolo ofrece un método sencillo para obtener muestras de alas de pupa que conservan la morfología familiar del ala. A partir de estas preparaciones, es posible obtener pilas de imágenes que podrían proyectarse como imágenes 2D o 3D para investigar la distribución y/o el enriquecimiento de proteínas durante la diferenciación del ala. Un protocolo similar se puede utilizar para recolectar una gran muestra de ala de pupa necesaria para sintetizar ADNc, una molécula esencial en las reacciones de PCR.
Este procedimiento proporciona un enfoque alternativo y complementario a los métodos ya publicados para la disección de las alas de la pupa.
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Descripción general
Este artículo describe un método rápido y eficiente para diseccionar alas de pupa de Drosophila, que son esenciales para diversas técnicas como inmunodetección y ensayos de PCR. El procedimiento tiene como objetivo facilitar el estudio de la localización de transcritos y proteínas durante el desarrollo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Genética
Antecedentes
- Comprender la localización de transcritos y proteínas es fundamental en estudios del desarrollo.
- Drosophila sirve como organismo modelo para la investigación genética y del desarrollo.
- Una preparación eficiente de muestras es necesaria para obtener resultados experimentales precisos.
- La inmunodetección y la PCR son técnicas comunes utilizadas en la investigación biológica.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un procedimiento sencillo para la disección de alas de pupa.
- Mejorar la eficiencia en la obtención de muestras para ensayos de inmunodetección y PCR.
- Apoyar la investigación sobre la localización de transcritos y proteínas durante el desarrollo de Drosophila.
Métodos Utilizados
- Uso de un pincel húmedo para manipular las pupas con cuidado.
- Transferencia de las pupas a portaobjetos con cinta adhesiva de doble cara.
- Temporización de la transferencia según la edad de la pupa.
- Minimización del daño a la pupa durante el proceso de disección.
Resultados principales
- El método permite la recolección de muestras intactas de alas de pupa.
- Las muestras obtenidas son adecuadas para diversas aplicaciones posteriores.
- El procedimiento es rápido y minimiza el estrés en las muestras.
- Facilita estudios precisos de localización en Drosophila.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para la disección de alas de pupa.
- Apoya el estudio de los procesos de desarrollo en Drosophila.
- La técnica puede adaptarse a diversas necesidades experimentales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación eficiente de muestras de alas de pupa de Drosophila permite la detección confiable de la expresión de transcritos y proteínas, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este método proporciona un flujo de trabajo rápido y reproducible para generar material biológico de alta calidad adecuado para ensayos posteriores, reduciendo la variabilidad en la selección fenotípica y el desarrollo de ensayos. Al estandarizar la disección de alas, los equipos de investigación pueden mejorar la confianza predictiva en el análisis de vías y priorizar objetivos con una base mecanicista más sólida.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de hipótesis terapéuticas mediante la detección localizada de proteínas como patched, un receptor canónico de hedgehog, en tejido alar en desarrollo.
- Valor operativo: Apoya la desactivación de riesgos biológicos al permitir un muestreo consistente a través de las etapas de desarrollo para la aclaración de rutas de señalización.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación del compromiso del blanco y de los patrones de expresión críticos para la identificación de compuestos prometedores y la selección de carteras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce muestras intactas de alas de pupa adecuadas para inmunodetección y ensayos de PCR, lo que permite lecturas cuantitativas de la expresión génica y proteica.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad para campañas de cribado de alto rendimiento.
- Preparación para ensayos: Genera material compatible con análisis moleculares posteriores, facilitando la evaluación confiable de compuestos en cribados fenotípicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para estudiar la morfogénesis, con aplicabilidad directa a la modelización de vías del desarrollo.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite la visualización de la distribución y enriquecimiento de proteínas durante la diferenciación, lo que aporta confianza al objetivo.
- Alineación Preclínica: Facilita la evaluación de biomarcadores mediante la expresión detectable de marcadores como la actina y patched en el epitelio alar.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta el desarrollo del ensayo y la evaluación preclínica, ofreciendo una técnica reutilizable de preparación de muestras para estudios basados en Drosophila.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la detección de la comunicación entre células del ala y la formación de venas transversales durante el desarrollo pupal.
- Selección: Proporciona muestras listas para ensayos con morfología consistente, mejorando la fiabilidad de lecturas basadas en inmunodetección y PCR.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de niveles de transcritos y proteínas, facilitando el análisis comparativo entre condiciones genéticas o experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con la validación preclínica mediante mecanismos de desarrollo conservados observables en la morfogénesis del ala.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado de disección aplicable en múltiples proyectos que estudian la genética del desarrollo en Drosophila.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de desarrollo.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de la preparación de muestras, favoreciendo un rendimiento constante de los ensayos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos confiables sobre la expresión y localización del objetivo.
- Impacto en la cartera: Permite decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante datos mecanicistas de mayor calidad procedentes de muestras reproducibles.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos básicos en el manejo de Drosophila y microscopía.
- Depende de herramientas estándar: pincel húmedo, pinzas, portaobjetos con cinta adhesiva de doble cara y paraformaldehído al 4%.
- Necesita una precisión temporal basada en las horas posteriores a la formación de la pupa (APF, por sus siglas en inglés) para coincidir con las etapas de desarrollo.
- Adaptable a diferentes etapas del desarrollo alar, aunque está optimizado para pupas de 24 a 30 horas APF.
- Limitado por la necesidad de una disección manual cuidadosa para evitar daños en el tejido, aunque la destreza mejora con la práctica.
