Name: Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprende a generar líneas celulares knockout en células de mamíferos mediante dos métodos CRISPR/Cas9: unión de extremos no homólogos y reparación dirigida por homología. Estas técnicas permiten estudiar funciones génicas con alta eficiencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean agradecer a Gissell Sanchez, Megan Lee y Jason Estep por la asistencia experimental, y Weifeng Gu y Xuemei Chen por compartir reactivos.

1. Identificación de regiones de homología alrededor de la deleción deseada NOTA: Sólo es necesario si se utiliza la edición basada en la selección. <ol><li> Seleccione dos regiones, inicialmente de 1,5-2 kb, a cada lado del locus de deleción deseado, que servirá como brazos de homología en la plantilla HDR ( Figura 1A ). Identificar las regiones que carecen de sitios de reconocimiento BsaI en cada capítulo (GGTCTC) para facilitar la clonación. Si los sitios BsaI son inevitables, utilice una enzima de restricción alternativa de tipo IIs (BsmBI, SapI, BbsI) y modifique los sitios correspondientes en el plásmido receptor (pUC19-BsaI), el plásmido donante marcador de resistencia (pGolden-Neo o pGolden-Hygro) y Homología brazo productos PCR sobresale. </li></ol> 2. Generación de plásmidos de expresión de Cas9-sgRNA <ol><li> Definir el (los) sitio (s) de orientación para la mutagénesis. Para el método de corte único, sin selección, los exones proximales de codificación 5 &#39;para aumentar la probabilidad de un no fuMutación funcional. Para el método de dos cortes, seleccione dos sitios que abarquen tanto del gen como sea necesario. NOTA: En nuestra experiencia, las supresiones de hasta 53 kb se crean eficientemente. </li><li> Introduzca 200 a 300 pb de la secuencia de la región objetivo en la herramienta de diseño crispr.mit.edu. Para la clonación basada en selección, utilice 200-300 pb de las regiones de homología identificadas que son proximales al locus de deleción ( Figura 1A ). Seleccione 2-3 de los sgRNAs de mayor rango por región objetivo para tener en cuenta las diferencias en su actividad y para aislar clones independientes que no compartan los mismos potenciales efectos fuera de la meta. </li><li> Para diseñar oligonucleótidos dúplex con salientes adecuados para su inserción en el plásmido de expresión, omitir la secuencia de PAM final (NGG) y añadir un saliente de 5&#39;-CACC seguido por un G al oligo de la hebra superior. Para el oligo de la hebra inferior, añada un saliente 5&#39;-AAAC a la secuencia diana complementada con el reverso, seguido por un 3&#39;-C, como ilIlustrado a continuación: <img alt="Secuencia 1" src="/files/ftp_upload/55903/55903seq01.jpg" /></li><li> Insertar oligonucleótidos sintéticos correspondientes a los sgRNAs en el plásmido pSpCas9 (BB) utilizando la clonación Golden Gate 28 como se describe en el protocolo de laboratorio Zhang [ 29] . </li></ol> 3. Generación de Plásmidos Plantilla de Reparación dirigida por Homología NOTA: Sólo es necesario si se utiliza la edición basada en la selección. El plásmido plantilla de reparación dirigida por homología consiste en un casete de resistencia a fármacos flanqueado por dos regiones que son complementarias al genoma justo fuera de los dos sitios diana sgRNA ( Figura 1B ). <ol><li> A partir de las regiones de homología más amplias identificadas en el paso 1.1, seleccionar 800-1.000 pb 26 no más de 5-10 pb de los sitios de corte Cas9 diseñados, para servir como brazos de homología ( Figura 1A ). Asegúrese de no incluir el sgRNAEl sitio diana y su PAM en los brazos de homología, ya que esto causará la escisión CRISPR / Cas9 del propio plásmido molde. Si los brazos de homología contienen sitios BsaI internos, utilice sitios alternativos de sgRNA. </li><li> PCR amplifica los brazos de homología a partir del ADN genómico usando una ADN polimerasa de alta fidelidad, según las instrucciones del fabricante, usando cebadores directos e inversos con secuencia 5 &#39;adicional que introduce sitios BsaI (GGTCTC) y salientes únicos en cada extremo de la región de homología. Los salientes deben contener secuencias apropiadas para generar el orden de montaje y orientación correctos, como se describe a continuación ( Figura 1B ): Homología izquierda brazo FP overhang: 5 &#39;GGGTCTCA GGCC Brazo de homología izquierda RP prominente: 5 &#39;GGGTCTCT CACG Homología derecha brazo FP overhang: 5 &#39;GGGTCTCA GTCC Brazo de homología derecha brazo de RP: 5 &#39;GGGTCTCT CCAC </li><li> Comprobar los brazos de homología para el amplificador apropiadoPor electroforesis en gel antes de continuar adelante. </li><li> Reúna las regiones del brazo de homología derecha e izquierda con el casete de resistencia en un plásmido molde HDR por clonación Golden Gate [ 28] . Utilizar plásmidos pGolden-Neo o pGolden-Hygro 30 como fuente de los casetes de resistencia flanqueados con loxP (loxP-PGK-Neo-pA-loxP o loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Utilizar pUC19-BsaI, un pUC19 modificado con sitios BsaI en la región de clonación múltiple y eliminar sitios BsaI en otra parte, como el vector receptor (disponible a petición). Utilice una proporción de 1: 1: 1: 1 para los tres insertos y el vector. <ol><li> Preparar la siguiente mezcla de reacción 30 : <table><tbody><tr><td> Producto de PCR del brazo de homología derecha </td><td> 0,06 pmoles (30-40 ng) </td></tr><tr><td> Producto de PCR del brazo de homología izquierdo </td><td> 0,06 pmoles (30-40 ng) </td></tr><tr><td> El plásmido pGolden - Neo (100 ng / μl) </td><td> 1 &amp;# 181; L </td></tr><tr><td> PUC19 - BsaI (100 ng / μl) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 2x tampón de ADN ligasa T7 </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> BsaI (10 U / μl) </td><td> 0,75 μL </td></tr><tr><td> T7 ADN ligasa (3000 U / μl) </td><td> 0,25 μL </td></tr><tr><td> Agua </td><td> Hasta 10 μL </td></tr></tbody></table></li><li> Utilice los siguientes parámetros del termociclador: 37 ° C durante 5 min, 20 ° C durante 5 min. Repita durante 30 ciclos. </li><li> Tratar el producto de clonación con una exonucleasa según las instrucciones del fabricante para digerir cualquier ADN lineal restante. </li><li> Transformar la mezcla de reacción en una cepa E. coli competente de acuerdo con el protocolo suministrado con las células, y la placa sobre platos que contienen ampicilina. </li></ol></li><li> Para identificar clones con el conjunto de plantilla correcto, realizar bacteriasAl colonia PCR para amplificar las subregiones del brazo de homología del inserto montado (ya que el inserto completo puede ser demasiado grande para amplificarse de forma fiable). Utilizar un recocido de cebador a la secuencia de plásmido flanqueante y un segundo cebador complementario al borde del cassette de resistencia ( Figura 1B , la secuencia es común a los insertos Neo e Hygro), generando un producto dependiente del ensamblaje que es aproximadamente 200 pb más largo que El brazo de homología contenida: PUC19 - Bsal - Izquierda: 5 &#39;GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG Resistencia-Izquierda: 5 &#39;AAAAGCGCCTCCCCTACCC PUC19 - BsaI - Derecha: 5 &#39;GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA Resistencia-Derecha: 5 &#39;AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG <ol><li> Elija colonias bacterianas con mondadientes estériles y suspenda las bacterias en 20 μl de agua. Calentar a 95 ° C durante 15 min, y girar en una centrífuga de mesa a la velocidad máxima durante 5 min. Coloque inmediatamente sobre hielo. </li><li> Preparar la siguiente mezcla de PCR 31 &lt;/ Sup&gt;: <table><tbody><tr><td> Plantilla de colonia diluida </td><td> 1,25 mu l </td></tr><tr><td> Tampón de reacción Taq 10x </td><td> 1,25 mu l </td></tr><tr><td> 20mM dNTPs </td><td> 0,25 μL </td></tr><tr><td> 10 μM Imprimación directa </td><td> 0,25 μL </td></tr><tr><td> 10 μM Imprimación inversa </td><td> 0,25 μL </td></tr><tr><td> Taq Polimerasa </td><td> 0,25 μL </td></tr><tr><td> Agua </td><td> 9 μL </td></tr></tbody></table></li><li> Utilizar los siguientes parámetros del termociclador: 95 ° C durante 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min / kb), repetir durante 25 ciclos, 72 ° C durante 2 min. </li><li> Compruebe el producto de PCR para el tamaño correcto del amplicón mediante electroforesis en gel de agarosa. </li><li> Opcionalmente, el ADN de plásmido de miniprep de colonias individuales con tamaño de inserto correcto y secuenciaE por secuenciación de Sanger con los cebadores de amplificación mencionados anteriormente. </li></ol></li></ol> 4. Transfección de componentes CRISPR en células cultivadas <ol><li> Antes de la transfección: cultivar células T-REx293 en medio DMEM suplementado con FBS al 10% a 37ºC y CO 2 al 5%. </li><li> Placa de células en placas de 6 pozos y crecer hasta aproximadamente el 70% de confluencia. Incluya un pozo para un control no transfectado. </li><li> Transfect células con 2,5 μ g plásmido total utilizando un protocolo de transfección comercial. En paralelo, mantener el control no transfectado. NOTA: El método de transfección y la eficiencia varían dependiendo del tipo de célula. Determine el método de transfección apropiado para el sistema antes del experimento. <ol><li> Para la transfección de células con selección, se utilizan 0,75 μg de Cas9-sgRNA 1 (corte a la izquierda), 0,75 μg de Cas9-sgRNA 2 (corte derecho) y 1,0 μg de plantilla de recombinación homóloga. </li><li> Para transfectiDe las células sin selección, se utiliza 2,5 μ g de Cas9-sgRNA plásmido. </li></ol></li></ol> 5. Selección de fármacos <ol><li> 48 h después de la transfección, tratar las células con el fármaco apropiado (Neomicina / Higromicina). Llevar a cabo la selección hasta que todas las células en el control no transfectado mueren (normalmente 3-5 días para Neo, 7-14 días para Hygro). NOTA: Use concentraciones de 500 μg / mL y 10 μg / mL para Neomicina e Higromicina, respectivamente para las células T-REx293. Para otros tipos de células, puede ser útil llevar a cabo una titulación previa de fármaco en células no transfectadas para determinar la concentración efectiva. </li></ol> 6. Aislamiento de las poblaciones clonales <ol><li> Cultivar las células hasta el 100% de confluencia en el pocillo original después de la selección. Seed células en placas de 96 pozos a una densidad de 0,33 células por pocillo. NOTA: La siembra de tres placas de 96 pocillos es un buen punto de partida para asegurar el aislamiento de más de un clon correcto, pero se puede necesitar más o menos depTerminando en sgRNA y HDR eficiencias. </li><li> Observe las colonias durante un período de 2-4 semanas, hasta que las colonias sean visibles al ojo. Elija colonias visibles con una punta de pipeta estéril y vuelva a sembrar en nuevos pozos para estimular el crecimiento de monocapa. Cuando se usan células en suspensión, incluso se pueden utilizar densidades de siembra más bajas para asegurar una mayor proporción de pozos de una sola colonia. </li></ol> 7. Selección de Candidatos <ol><li> Selección de candidatos sin el uso de la selección: dot blot <ol><li> Crecer clones individuales a 50-100% de confluencia. Desalojar la monocapa de las células pipeteando dentro del pozo. </li><li> Alícuota de 90 μL del volumen total de 100 μL a un tubo de microcentrífuga limpio. Se centrifuga a 6000 rpm durante 5 min, se elimina el medio y se liza el sedimento celular en 10 μl de tampón de lisis 1x o tampón de carga SDS 1x (5x: Tris-Cl 250 mM pH 6,8, SDS al 8%, azul de bromofenol al 0,1% Glicerol, DTT 100 mM). Añadir 90 μl de nuevos medios al resto de las células en elL para continuar propagando. </li><li> Pipetear 1 μl de lisado celular sobre una membrana de nitrocelulosa seca para formar un punto. Blot cada muestra dos veces en dos membranas separadas, creando dos patrones idénticos de muestras. </li><li> Bloquear las membranas en 5% de leche en TBST (solución salina tamponada con Tris + 0,01% de Tween 20: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3 g de base de Tris, hasta 1 l de agua destilada, pH 7,4) 31 durante 1 h a temperatura ambiente Con balanceo, aquí y durante todo el procedimiento). </li><li> Blot usando el anticuerpo primario contra la proteína diana en una membrana, y el anticuerpo primario para una proteína de control (tubulina, GAPDH, o cualquier otra proteína que no se espera que cambie) en el otro. Utilice la dilución recomendada de anticuerpos primarios (0,2 μg / mL para ELAVL1 y 0,1 μg / mL para Pum2 en este caso) en TBST + 5% de leche. Incubar 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 veces con TBST durante 5 min. </li><li> Incubar cada membrana con anticuerpo secundario conjugado con HRP apropiado en TBST + 5% de leche durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 veces con TBST durante 5 min. </li><li> Aplique una solución de sustrato de quimioluminiscencia (véase Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante e imprima la membrana manchada en un dispositivo de imagen de quimioluminiscencia digital. </li><li> Cuantificar las intensidades de los puntos para las proteínas objetivo y de control utilizando el software apropiado. </li><li> Eliminar a los candidatos con baja señal de proteína de control, y calcular el fondo substraído ratios de objetivo para controlar la intensidad de proteínas para los candidatos restantes. Seleccione los candidatos con las proporciones más bajas para el paso y la posterior validación por transferencia western. </li></ol></li><li> Selección de candidatos con el uso de la selección: PCR de colonias <ol><li> Recoger el lisado celular usando un kit de preparación de ADN (Ver Tabla de Materiales ). <ol><li> Duplicar las colonias individuales en un pozo de 96 nuevos y crecer hasta 100% de confluencia. </li><li> Eliminar los medios de un conjunto de los clones, unY resuspender las células en 30 μl de tampón de extracción del kit. Transferir a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml. </li><li> Calentar la solución a 96 ° C durante 15 min y dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 30 μL de tampón de estabilización del kit. Mezclar bien. </li></ol></li><li> Identificar líneas mutantes de tipo salvaje y monoalélicas / bialélicas mediante PCR de colonias. <ol><li> Diseñar dos conjuntos separados de cebadores de PCR (para el lado izquierdo y derecho del locus objetivo) para amplificar las regiones alrededor de los brazos de homología basado en la integración exitosa o fallida del casete de resistencia ( Figura 2C ). En cada lado, utilice un cebador común (rojo) que se recoje fuera del brazo de homología. Se utiliza con un cebador pareado correspondiente que es complementario a la secuencia endógena, que abarca la región de homología (azul), para ensayar el alelo de tipo salvaje. Utilice otro cebador pareado, complementario al casete de resistencia insertado (ver cebadores en la sección2.3), para probar la mutación deseada. </li><li> (Recomendado) Validar los conjuntos de cebadores usando lisado celular de la población de células a granel original seleccionada, ya que contendrá una mezcla de ambos WT y alelos mutantes ( Figura 2D ). </li><li> Preparar la siguiente mezcla de reacción: <table><tbody><tr><td> Lisado celular </td><td> 0,5 μl </td></tr><tr><td> 10 x tampón KOD </td><td> 1,25 mu l </td></tr><tr><td> MgSO _ {4} 25 mM </td><td> 0,75 μL </td></tr><tr><td> DNTPs 2 mM </td><td> 1,25 mu l </td></tr><tr><td> 10 μM Imprimación directa </td><td> 0,375 μL </td></tr><tr><td> 10 μM Imprimación inversa </td><td> 0,375 μL </td></tr><tr><td> KOD polimerasa </td><td> 0,25 μL </td></tr><tr><td> Agua </td><td> 7,75 μL </td></tr></tbody></table></li><li> Utilizar las siguientes condiciones del termociclador: 95 ° C durante 2 min, (95 ° C durante 20 s, Primer Tm durante 10 s, 70 ° C durante 20 s / kb) repetir durante 25 ciclos. </li><li> Visualizar el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. </li></ol></li><li> Repita la prueba de PCR de colonias para cada lado de la integración prevista. Seleccione y expanda candidatos que muestren presencia de integración y ningún producto de secuencia endógena para la región suprimida. </li><li> Validar los candidatos positivos por Western blot y / o RT-qPCR. </li></ol></li></ol> 8. Verificar la mutación genómica mediante secuenciación <ol><li> Aislar el ADN genómico de líneas celulares mutantes por extracción de fenol cloroformo 31 . </li><li> La PCR amplifica la región diana de sgRNA, utilizando cebadores con salientes 5 &#39;que añaden sitios de restricción BsaI a cada extremo. NOTA: Para clones editados con HDR, donde ambos alelos pueden ser idénticos, el producto de PCR puede secuenciarse directamente. </li><li> Clonar la región amplificada en pUC19-BsaI por clonación Golden Gate. </li><li> Transformar la mezcla de reacción en una cepa E. coli competente. </li><li> Miniprep ADN plasmídico de 6-10 colonias individuales y secuencia de la región clonada por secuenciación de Sanger. </li></ol>

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+Fok+I+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).</li>
<li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+homologous+recombination+through+targeted+cleavage+by+chimeric+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.</a> Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Christian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+double-strand+breaks+with+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Karginov, F. V., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system%3A+small+RNA-guided+defense+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea.</a> Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li>
<li>Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+of+regularly+spaced+prokaryotic+repeats+derive+from+foreign+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.</a> J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).</li>
<li>Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+elements+in+Yersinia+pestis+acquire+new+repeats+by+preferential+uptake+of+bacteriophage+DNA%2C+and+provide+additional+tools+for+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies.</a> Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).</li>
<li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li>
<li>Deltcheva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA+maturation+by+trans-encoded+small+RNA+and+host+factor+RNase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.</a> Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).</li>
<li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li>
<li>Guirouilh-Barbat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+KU80+pathway+on+NHEJ-induced+genome+rearrangements+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells.</a> Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).</li>
<li>Moore, J. K., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+and+genetic+requirements+of+two+pathways+of+nonhomologous+end-joining+repair+of+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).</li>
<li>Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+repair+is+a+major+double-strand+break+repair+pathway+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+rAAV-based+gene+targeting+vectors+by+Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning.</a> Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El sistema CRISPR / Cas9 ha permitido la generación eficiente de modificaciones genómicas estables, que proporcionan una alternativa más consistente a otros métodos de manipulación transitorios. Aquí, hemos presentado dos métodos para la rápida identificación de CRISPR / Cas9 genes knockouts en líneas de células de mamíferos. Ambos métodos requieren poco material celular, por lo que las pruebas se pueden hacer en las primeras etapas del cultivo clonal, ahorrando tiempo y reactivos. Para aumentar la eficiencia de ambos m...

<html> Las alteraciones genéticas estables proporcionan una ventaja sobre los métodos transitorios de perturbación celular, que pueden ser variables en su eficacia y duración. La edición genómica se ha vuelto cada vez más común en los últimos años debido al desarrollo de nucleasas específicas para el objetivo, como las nucleasas de zinc-dedo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , nucleasas efectoras semejantes a activadores de transcripción (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 Y ARN-guiado nucleasas derivadas de las agrupadas, regularmente intercaladas palindromic corto repite (CRISPR) sistema [ 10] . La maquinaria de edición CRISPR / Cas9 está adaptada de un sistema inmunológico que las bacterias y arqueas utilizan para defenderse contra infecciones viralesAsno = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 , 13 . En este proceso, fragmentos cortos de 20-30 nt de secuencia viral invasora se incorporan en un locus genómico como &quot;espaciadores&quot; flanqueados por unidades repetidas 14 , 15 . La transcripción subsiguiente y el procesamiento de ARN genera ARNs 16 (CRRNAs) asociados a CRISPR pequeños que, junto con un ARNc trans-activador 17 (tracrRNA), se reúnen con la endonucleasa Cas9 efectora. Los CRRNAs, por lo tanto, proporcionar la especificidad de Cas9 orientación, la guía del complejo para escindir secuencias complementarias de ADN viral y la prevención de nuevas infecciones [ 18 , 19] . Cualquier secuencia &quot;protospacer&quot; en el ADN diana puede servir como fuente del CRRNA, siempre y cuando esté directamente 5 &#39;con un motivo adyacente protospacer corto (PAM), NGG en el caso de S. pyogenes Cas9 <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 20. La ausencia de la secuencia de PAM cerca del espaciador en el locus CRISPR del anfitrión distingue entre el yo y el no-yo, evitando el objetivo del huésped. Debido a su universalidad y flexibilidad, este sistema biológico ha sido poderosamente adaptado para la edición genómica, de tal manera que casi cualquier sitio de ADN PAM adyacente puede ser dirigido. En esta versión, una modificación adicional fundido el crRNA y tracrRNA en un único ARN guía (sgRNA) componente que se carga en el Cas9 proteína [ 21] . Tras la expresión de Cas9 y un sgRNA en células eucariotas, la proteína Cas9 escinde ambas cadenas de ADN en el locus diana. En ausencia de una región apropiada de secuencia homóloga, la célula fija esta ruptura mediante la unión final no homóloga (NHEJ) 22 , 23 , 24 , que típicamente introduce pequeñas deleciones o, en raras ocasiones, inserciones. Al orientar unaLectura, la reparación conduce probablemente a un desplazamiento de traslación que produce un producto proteico no funcional. Por el contrario, cuando se proporciona una plantilla exógena con grandes regiones de homología, la célula puede fijar la ruptura de doble hebra mediante reparación dirigida por homología 25 , 26 . Esta ruta permite mayores deleciones precisas, sustituciones o inserciones en el genoma, junto con la introducción de marcadores de selección excisable [ 27] . Aquí, presentamos protocolos para generar knockout líneas celulares por cualquiera de estos dos CRISPR / Cas9 métodos ( Figura 1A ]. El enfoque de NHEJ utiliza un solo sitio de corte sgRNA y selección independiente de la selección, y por lo tanto requiere poca preparación inicial. Cuando se utiliza este método, deben diseñarse RNAs guía complementarios a los exones cerca del extremo 5 &#39;de la transcripción, que son más probables para producir un knockout. Desde la modificaciónIones al genoma en este caso son pequeños, el cribado para los clones knockout se basa en transferencias de punto, donde el producto proteico se evalúa de una manera de alto rendimiento. Utilizamos la generación de líneas de knockout de ELAV-like 1 protein (ELAVL1) como ejemplo. El segundo enfoque se basa en la reparación dirigida por homología (HDR) y utiliza dos sitios de corte de sgRNA que abarcan el gen o región de interés, permitiendo deleciones de decenas de kb. Un plásmido con dos regiones de homología que flanquean los sitios de escisión proporciona una plantilla de reemplazo ( Figura 1B ), introduciendo un marcador de resistencia seleccionable que aumenta la eficiencia de la generación de knockout. Este método también puede adaptarse para introducir modificaciones genéticas con brazos de homología diseñados apropiadamente. En este caso, la integración de un nuevo fragmento de ADN permite el cribado basado en PCR ( Figura 1C ). Aquí, utilizamos la generación de Pumilio RNA vinculante familia miembro 2 (PUM2) knockout líneas como un ejemplo.

<table><tbody><tr>Kit <td></td><td></td><td></td>de<td>preparación de plásmidos</td></tr> <tr><td>de células</td><td></td><td></td><td></td>E. coli</tr> competente <tr><td>plásmido pSpCas9(BB)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>Ran et al. 2013, clonación de sgRNAs</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>enzima ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td>Ran et al. 2013, clonación de sgRNAs</td></tr><tr><td>T7 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td>Ran et al. 2013, clonación de sgRNAs</td></tr><tr><td>Tango Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>BY5</td><td>Ran et al. 2013, clonación de sgRNAs</td></tr><tr><td>PlasmidSafe exonucleasa</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td>Ran et al. 2013, clonación de sgRNAs</td></tr><tr><td>Q5 hot-start polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>M0494A</td><td>amplificación</td></tr><tr><td>de HA pUC19-BsaI</td><td></td><td></td><td>Plásmido pUC19 modificado, mutó el sitio BsaI existente e insertó dos sitios BsaI orientados hacia afuera después de la digestión BamHI/EcoRI</td></tr><tr><td>pGolden-Neo</td><td>Addgene</td><td>51422</td><td>Cassette de resistencia</td></tr><tr><td>pGolden-Hygro</td><td>Addgene</td><td>51423</td><td>Cassette de resistencia</td></tr><tr><td>Enzima BsaI</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>Construcción del brazo de homología</td></tr><tr><td>T7 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>PlasmidSafe exonucleasa</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td></td></tr><tr><td>Palillos de</td><td></td><td></td> dientes <td>PCR bacteriano</td></tr><tr><td>Taq polimerasa</td><td></td><td></td> colonia <td>bacteriana PCR</td></tr><tr><td>HEK293 células humanas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptococo (opcional)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>BioLite</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI Reactivo de transfección</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td>solo para lipofección</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td>solo para lipofección</td></tr><tr><td>G418 (Neomicina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720-5G</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>12556008</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis pasiva, 5x</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x SDS tampón</td><td></td><td></td> de carga receta <td>descrita en el protocolo</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td></td><td></td><td>receta descrita en el protocolo</td></tr><tr><td>Leche deshidratada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sustrato de larga duración SuperSignal West Dura</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>para anticuerpos secundarios conjugados con HRP</td></tr><tr><td>Preparación de ADN Extracta para PCR</td><td>Quantabio</td><td>95091-025</td><td></td></tr><tr><td>KOD polimerasa</td><td>Novagen</td><td>71316</td><td></td></tr></tbody></table>

generación dependiente de la selección y independiente de crispr / cas9-mediada gene knockouts en células de mamíferos

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

El sistema de ingeniería del genoma CRISPR / Cas9 ha revolucionado la biología permitiendo la edición precisa del genoma con poco esfuerzo. Guiado por una sola guía de ARN (sgRNA) que confiere especificidad, la proteína Cas9 escinde ambas cadenas de ADN en el lugar de destino. La ruptura del ADN puede desencadenar la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ puede introducir pequeñas supresiones o inserciones que conducen a mutaciones de cambio de marco, mientras que el HDR permite perturbaciones más grandes y más precisas. Aquí, presentamos protocolos para la generación de líneas celulares knockout mediante el acoplamiento CRISPR / Cas9 métodos establecidos con dos opciones para la selección / cribado aguas abajo. El enfoque de NHEJ utiliza un único sitio de corte sgRNA y selección independiente de la selección, donde la producción de proteínas se evalúa por punto inmunoblot en un alto rendimiento. El enfoque HDR utiliza dos sitios de corte sgRNA que abarcan el gen de interés. Junto con una plantilla de HDR proporcionada, este método puede lograr supresiónDe decenas de kb, ayudado por el marcador de resistencia seleccionable insertado. Se discuten las aplicaciones y ventajas apropiadas de cada método.

Para la generación de ELAVL1 knockout líneas, un anticuerpo robusto estaba disponible, por lo que la edición utilizando sgRNAs único ( Figura 1A , izquierda) se realizó, seguido de inmunotransferencia punto. Se transfectaron tres sgRNAs de forma independiente para comparar las eficiencias y para descartar los efectos deseados en los clones resultantes. Después de recoger y borrar los lisados ​​celulares de las poblaciones clonales en dos membranas de nitroce...

Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

El objetivo de este procedimiento es aislar e identificar líneas celulares clonales con genes eliminados generadas mediante dos tipos de edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9. Un método detecta la eliminación de proteínas causada por la unión de extremos no homólogos, mientras que el otro detecta perturbaciones genómicas generadas por la reparación dirigida por homología. Este método es particularmente útil en el campo de la biología molecular, donde la generación de líneas celulares con perturbaciones genéticas constituye una herramienta importante para analizar la función génica.La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un método rápido y de rendimiento relativamente alto que puede realizarse fácilmente utilizando técnicas básicas de biología molecular. La unión de extremos no homólogos introduce pequeñas deleciones o inserciones, y se evalúa mediante un inmunoblot por puntos, mientras que la reparación dirigida por homología permite perturbaciones más grandes y precisas, y se evalúa mediante PCR de colonias. Este experimento utiliza células T-REx-293 cultivadas en medio DMEM, suplementado con 10% de FBS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Antes de l

selection-dependent-independent-generation-crisprcas9-mediated-gene

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

Este protocolo describe los pasos para la clonación de múltiples ARN guía único en un guía de ARN concatemer vector, que es de uso particular en la creación de múltiples gen knockouts utilizando CRISPR / Cas9 tecnología. La generación de knockouts dobles en organoides intestinales se muestra como una posible aplicación de este método.

Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Este manuscrito describe un enfoque de cribado basado en células a escala del genoma para identificar interacciones extracelulares entre receptores y ligand.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

A medida que los protocolos relacionados con CRISPR se vuelven cada vez más útiles y accesibles, aún pueden surgir complicaciones y obstáculos en condiciones experimentales específicas. Este protocolo describe la creación de una línea celular humana knockout de serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK1/RIP1) que interactúa con el receptor utilizando CRISPR/Cas9 y destaca los posibles desafíos encontrados durante este proceso.

Generación de una línea celular RIP1 knockout U937 utilizando el sistema CRISPR-Cas9

Aprende a generar líneas celulares knockout en células de mamíferos mediante dos métodos CRISPR/Cas9: unión de extremos no homólogos y reparación dirigida por homología. Estas técnicas permiten estudiar funciones génicas con alta eficiencia.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

Explorar más videos