Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

El objetivo de este procedimiento es aislar e identificar líneas celulares clonales knockout generadas por dos tipos de edición genómica mediada por CRIPSR/Cas9. Un método detecta el knockout de proteínas causado por la unión de extremos no homólogos, mientras que el otro detecta perturbaciones genómicas generadas por reparación dirigida por homología. Este método es particularmente útil en el campo de la biología molecular, donde la generación de líneas celulares con perturbaciones genéticas es una herramienta importante en la disección de la función de los genes.

La principal ventaja de esta técnica es que es un método rápido y de rendimiento relativamente alto que se puede ejecutar fácilmente utilizando técnicas básicas de biología molecular. La unión de extremos no homólogos introduce pequeñas deleciones o inserciones, y se evalúan mediante un inmunoblot de puntos, mientras que la reparación dirigida por homología permite perturbaciones más grandes y precisas, y se evalúan mediante PCR de colonias. Este experimento utiliza células T-REx-293 cultivadas en medios DMEM, suplementadas con un 10% de FBS a 37 grados Celsius y un 5% de dióxido de carbono.

Antes de la transvección, coloque las celdas en seis placas de pocillos e incluya un pocillo para un control sin transvección. Haga crecer las células hasta aproximadamente el 70% de confluencia. Transvección de las células con 2,5 microgramos de plásmido total utilizando un protocolo de transvección comercial.

Para la transvección de células sin selección, utilice 2,5 microgramos de plásmido Cas9-sgRNA. Para la transvección de células con selección, utilice 0,75 microgramos de Cas9-sgRNA1, 0,75 microgramos de Cas9-sgRNA2 y un microgramo de plantilla de recombinación homóloga. Incubar las células transvectadas y el control no transvectado a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.

En el caso de las células transvectadas con selección, se debe comenzar la selección del fármaco tratando las células con el fármaco adecuado, que en este caso es la neomicina. Regrese la placa de seis pocillos a la incubadora. Observe las células tratadas una vez al día para comprobar las tasas de muerte celular, hasta que mueran todas las células del control no transvectado.

Para aislar las poblaciones clonales, primero cultive las células hasta el 100% de confluencia en el pozo original después de la selección. A continuación, haga diluciones en serie de las células y cuente las células. Dado que la generación adecuada de colonias monoclonales es clave para obtener un knockout completo, se debe tener cuidado para determinar la dilución correcta para asentar las células a la densidad deseada.

Una vez que se haya determinado la dilución correcta, coloque las celdas en placas de 96 pocillos a una densidad de 0,33 celdas por pocillo. Colocar tres placas de 96=pocillos es un buen punto de partida para asegurar el aislamiento de más de un clon correcto. Durante un período de dos a cuatro semanas, observe las colonias hasta que las colonias sean visibles a simple vista.

Estas imágenes representativas muestran colonias en diferentes etapas de crecimiento. Una sola celda en el asiento, celdas en el quinto día y una colonia bien establecida en el día 10. Con una punta de pipeta estéril, recoja las colonias visibles con cuidado y precisión, y vuelva a colocarlas en nuevos pocillos para fomentar el crecimiento de una sola capa.

Continúe cultivando las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Los candidatos knockout sin selección se examinan mediante inmunoblot dot para evaluar el producto proteico de una manera de alto rendimiento. Después de cultivar clones individuales hasta una confluencia del 50 al 100%, desaloje la monocapa de células pipeteando dentro del pocillo.

Alícuota de 90 microlitros del volumen total de 100 microlitros de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga limpio. A los efectos de este video, solo se procesarán dos muestras. Gire a 6.000 RPM durante cinco minutos, retire el medio y lise la paleta de celdas en 10 microlitros de búfer de carga 1X SDS.

Agregue 90 microlitros de medio nuevo al resto de las celdas en el pocillo y devuelva la placa a la incubadora para continuar propagando las celdas. Pipetear un microlitro de lisado celular sobre una membrana de nitrocelulosa seca para formar un punto. Seque cada muestra dos veces en dos membranas separadas, creando dos patrones idénticos de muestras.

Bloquear las membranas en leche al 5% en TBST a temperatura ambiente, con balanceo, durante una hora. Después de una hora, seque las membranas con anticuerpos primarios en la dilución de anticuerpos primarios recomendada y TBST más leche al 5%. En una membrana, use el anticuerpo primario contra la proteína diana, ELAVL1 en este experimento.

En la otra membrana, use el anticuerpo primario para una proteína de control que no se espera que cambie, aquí se usa PUM2. Incubar a temperatura ambiente durante una hora. Retire la solución de anticuerpos primarios de cada transferencia, agregue TBST e incube durante cinco minutos.

De esta manera, lave las manchas tres veces con TBST. A continuación, añada a cada membrana el anticuerpo secundario conjugado HRP adecuado y seque a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, lave las membranas tres veces con TBST durante cinco minutos cada vez.

Aplique una solución de sustrato quimioluminiscente a las manchas, siguiendo las instrucciones del fabricante, y obtenga imágenes de las membranas secadas en un generador de imágenes de quimioluminiscencia digital. Por último, cuantifique las intensidades de puntos para las proteínas diana y de control utilizando el software adecuado, y analice los resultados tal y como se describe en el protocolo de texto. Los candidatos con el marcador de resistencia seleccionable se examinan mediante PCR de colonias.

Comience este procedimiento duplicando las colonias individuales en una nueva placa de 96 pocillos y haciéndolas crecer hasta el 100% de confluencia para la preparación de lisados celulares. Retire los medios de un conjunto de clones, vuelva a suspender las células de cada pocillo en 30 microlitros de tampón de extracción de un kit comercial de preparación de ADN y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Caliente la solución a 96 grados centígrados durante 15 minutos y luego deje enfriar a temperatura ambiente.

Agregue 30 microlitros de tampón de estabilización a cada tubo de microcentrífuga y mezcle bien. Para identificar líneas mutantes de tipo salvaje y monoalélicas o bialélicas mediante PCR de colonias, diseñe dos conjuntos separados de cebadores de PCR para amplificar las regiones alrededor de los brazos de homología en función de la integración exitosa o incorrecta del casete de resistencia. En cada lado, use un cebador común que recoche fuera del brazo de homología.

Para probar el alelo de tipo salvaje, use el cebador común con el cebador emparejado correspondiente que es complementario a la secuencia endógena que abarca la región de homología. Para probar la mutación deseada, use el cebador común con otro cebador emparejado, complementario al casete de resistencia insertado. Para cada muestra que se va a analizar, prepare una mezcla de reacción que contenga lo siguiente: 0,5 microlitros de lisado celular, 1,25 microlitros de tampón 10X KOD, 0,75 microlitros de sulfato de magnesio de 25 milimolares, 1,25 microlitros de dos dNTP milimolares, 0,375 microlitros de cebador directo, 0,375 microlitros de cebador inverso, 0,25 microlitros de polimerasa KOD y 7,75 microlitros de agua.

Realice la PCR utilizando las siguientes condiciones, 95 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 25 ciclos de 95 grados Celsius durante 20 segundos, temperatura de fusión del cebador durante 10 segundos y 70 grados Celsius durante 20 segundos por KB. Posteriormente, visualizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. La edición del genoma mediante unión de extremos no homólogos se realizó para generar líneas knockout de ELAVL1 seguidas de inmunotransferencia de puntos, sondeo de ELAVL1 y PUM2. Los clones que mostraron poca señal de control se marcaron con una X y se excluyeron de análisis posteriores.

Los clones con señales bajas de ELAVL1 se probaron más a fondo mediante Western blot. Los candidatos confirmados se indican en verde y los candidatos invalidados se indican en gris. Este gráfico muestra las proporciones de ELAVL1 para controlar la señal de la proteína en orden creciente.

En la mayoría de los casos, las poblaciones clonales con la señal relativa más baja de ELAVL1 se identificaron correctamente como knockouts. Los candidatos generados por el método de reparación dirigida por homología se seleccionaron mediante PCR de colonias y los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se muestran ejemplos de resultados utilizando cebadores que abarcan la unión de integración aguas arriba utilizando cebadores internos endógenos y ciegos dentro de cebadores.

Los cebadores se validaron primero tanto en células parentales como en células seleccionadas a granel. Se muestran los resultados de 24 clones candidatos individuales junto con los patrones de banda esperados para clones de tipo salvaje, knockout y de deleción monoalélica. Las flechas negras indican los productos de amplificación correctos, las estrellas indican clones knockout bialélicos.

Las líneas mutantes bialélicas se validaron aún más mediante Western blot. La unión de extremos no homólogos utiliza un solo corte Cas9 y un cribado independiente de la selección, por lo que requiere poca preparación inicial, y el cribado de clones knockout mediante dot blots puede determinar rápidamente si una generación de knockout fue exitosa. El cribado basado en PCR detecta con precisión a los candidatos correctos con grandes perturbaciones genómicas generadas por la reparación dirigida por homología.

Estas técnicas permiten a los investigadores en biología molecular identificar de manera fácil y eficiente los knockouts, lo que les permite explorar procesos celulares normales o disfuncionales utilizando líneas celulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar e identificar líneas celulares clonales generadas por la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9.