Name: Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a realizar inmunoprecipitación de cromatina en líneas de células T de ratón para estudiar marcas de histonas y regulación de la estructura cromatínica. Este protocolo eficiente permite investigar interacciones proteína-ADN en células inmunes.

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Agradecemos a P. Käse y T. Schmidt-Wöll su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación colaborativa TRR81 y el programa Heisenberg (BO 1639 / 5-1) de la DFG (Fundación Alemana de Investigación), la Sociedad Max Planck y la EXC 294 en Friburgo y el Cluster de Excelencia para el Sistema Cardio Pulmonar (ECCPS) en Giessen a TB

NOTA: Todos los búferes y el medio utilizado en este protocolo se enumeran en la Tabla 1 . Días 1 y 2 1. Reticulación de las células <ol><li> Transferir las células T de ratón de una placa de 6 pocillos a un tubo de 50 ml y centrifugar durante 5 min a 4 ° C y ~ 271 x g. Resuspender el sedimento celular en 30 ml de medio de cultivo celular IMDM y contar las células utilizando una cámara Neubauer. </li><li> Recoja alícuotas de 20 x 10 6 células en nuevos tubos de 50 ml. </li><li> Añadir formaldehído (FMA) a una concentración final del 1% directamente al medio de cultivo celular e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Precaución: FMA es tóxico si se inhala, así que trabaje bajo una campana extractora y use equipo de protección adecuado. También, maneje los residuos FMA de acuerdo con las reglas de la institución anfitriona. </li><li> Añadir un 1/8-volumen de 1 M de glicina, pH 7,0, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Pellet las células por centrifugación de 5Min a 4 ° C y ~ 271 xg y se lava con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Lavar el sedimento celular con 1 mL de PBS y transferir a tubos de 1,5 mL. </li></ol> 2. Lisis Celular y Cizallamiento de Cromatina <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 1 mL de tampón de lisis SDS e incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Transferir cada muestra a un tubo de sonicación y realizar el cizallamiento usando un ultrasonizador enfocado de acuerdo con los ajustes indicados en la Tabla 2. </li><li> Tras el cizallamiento, se transfieren las muestras a tubos de 1,5 ml y se centrifugan durante 10 min a 4 ° C y ~ 18.000 x g. </li><li> Transferir el sobrenadante a nuevos tubos. </li><li> Recoger 50 μL para determinar el rendimiento de cizallamiento de acuerdo con el paso 3 y congelar rápidamente el lisado cortado en nitrógeno líquido. Almacene el lisado en alícuotas de un solo uso a -80 ° C. </li></ol> 3. Determinación de la eficiencia de corte <ol><li> Añadir 50 μl de tampón de elución al 50 &amp; #181 mu L de cada lisado sometido a cizallamiento e incubar a 65ºC durante la noche, con agitación. </li><li> Añadir 100 μl de tampón TE y 4 μL de RNasa A 10 mg / ml (concentración final de 0,2 μg / μL). Mezclar e incubar durante 2 ha 37 ° C, con agitación. </li><li> Añadir 2 μL de 20 mg / ml de proteinasa K (concentración final de 0,2 μg / μl) a cada muestra e incubar durante 2 ha 55 ° C, con agitación. </li><li> Transferir cada muestra a un tubo de gel adecuado para la extracción de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico; Manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Añadir 200 μl de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1) y agitar los tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C y ~ 16.000 xg y transferir la fase superior a nuevos tubos. Precaución: El fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico son tóxicos si son inhalados y son corrosivos; Trabajar debajo de una campana de humos y usar equipo de protección personal adecuado. También, manejar fenol, cloroformo y residuos de alcohol isoamílico acDe acuerdo con las normas de la institución de acogida. <ol><li> Repita una vez. </li></ol></li><li> Purificar el ADN utilizando columnas de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: <ol><li> Lave la membrana dos veces. Después del último lavado, dejar el tubo abierto durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual. </li><li> Para la elución, añadir 50 μl de H2O, incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, centrifugar el tubo durante 1 s para humedecer adecuadamente la membrana e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto antes de eluir el ADN por centrifugación durante 1 minuto a 24 ° C y ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Cuantificar el ADN purificado en un fluorómetro utilizando un kit de alta sensibilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Analizar aproximadamente 500 ng del ADN purificado en un gel de agarosa al 1,8% y aproximadamente 1 ng en un sistema de electroforesis usando un kit de alta sensibilidad. NOTA: El esperado sizE de los fragmentos de ADN está entre 200 y 500 pb. </li></ol> Días 3 y 4 4. Inmunoprecipitación <ol><li> Diluir 1 volumen de lisado cortado con 5 volúmenes de tampón de dilución. </li><li> Preclear con 30 μL / ml de perlas de agarosa de proteína A (preparadas de acuerdo con el Apéndice A ) durante 30 min mientras gira en la habitación fría. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 5 min a ~ 750 x g. </li><li> Recoger el 10% de la entrada y almacenarla a 4 ° C. </li><li> Alícuota de la cantidad deseada de lisado en nuevos tubos (ver Tabla 3 para más detalles). Añadir los anticuerpos deseados a cada tubo (véase la Tabla 3 para más detalles) y girar durante una noche a 4 ° C. </li><li> Añadir 40 μL de perlas de proteína A e incubar durante 1 h a 4 ° C mientras giraba. </li><li> Lavar las perlas con 1 mL de tampón de baja sal, tampón de alto contenido en sal, tampón LiCl y tampón TE (para cada lavado, incubar durante 5 minutos a 4 ° C mientras gira y centrifugaDurante 3 min a 4 ° C y ~ 950 xg). Consulte la Tabla 3 para obtener más detalles. </li><li> Añadir 110 μl de tampón de elución e incubar durante 15 min a temperatura ambiente, agitando vorticialmente cada 2 min. </li><li> Centrifugar durante 3 min a 4 ° C y ~ 950 xg y transferir 100 μ l de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Repita los pasos 4.7-4.8 con 100 μl de tampón de elución y combine los eluatos. Añadir tampón de elución hasta 200 μL para introducir las muestras. </li><li> Incubar todas las muestras durante la noche a 65 ° C, con agitación. </li></ol> Día 5 5. Purificación de ADN <ol><li> Añadir 200 μl de tampón TE a cada eluato y 8 μl de RNasa A 10 mg / mL (concentración final de 0,2 μg / μl). Mezclar e incubar durante 2 ha 37 ° C, con agitación. </li><li> Añadir 4 μL de 20 μg / ml de proteinasa K (concentración final de 0,2 μg / μl) a cada eluato e incubar durante 2 ha 55 ° C, con agitación. </li><li> Transferir cada muestra a un gelTubo adecuado para la extracción de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico; Manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Añadir 400 μl de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1) y agitar los tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C y ~ 16.000 x g. Transferir la fase superior a nuevos tubos. Precaución: El fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico son tóxicos si son inhalados y son corrosivos; Trabajar debajo de una campana de humos y usar equipo de protección personal adecuado. También, manejar residuos de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico de acuerdo con las reglas de la institución de acogida. <ol><li> Repita una vez. </li></ol></li><li> Purificar el ADN utilizando columnas de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: </li><li> Lave la membrana dos veces. Después del último lavado, dejar los tubos abiertos durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual. </li><li> Para la elución, añadir 50 μl de H2O, incubar a temperatura ambienteDurante 1 min, centrifugar los tubos durante 1 s para humedecer adecuadamente la membrana, e incubar a temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir el ADN por centrifugación durante 1 min a 24 ° C y ~ 17.900 x g. </li></ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li>
<li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li>
<li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li>
<li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li>
<li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905(2015).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li>
<li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li>
<li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li>
<li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li>
<li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li>
<li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+chromatin+research%3A+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67(2016).</li>
<li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li>
<li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li>
<li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
<li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li>
<li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

ChIP es una técnica válida para investigar si las proteínas o sus PTM se enriquecen en regiones genómicas específicas. Los resultados del ensayo CHIP a menudo son difíciles de interpretar debido a razones biológicas o técnicas. Las razones biológicas son múltiples e incluyen la unión débil o indirecta de proteínas al ADN. También existen limitaciones técnicas, tales como la limitada especificidad de anticuerpos y la lisis celular ineficiente o el cizallamiento de la cromatina. Una guía de solución de problemas ( Tabla 5 ) puede ayudar al lector a resolver los problemas que pueden encontrarse con los ensayos ChIP. Este protocolo, haciendo uso de un dispositivo de ultrasonido enfocado enfriamiento, permite cortar eficientemente la cromatina de una línea de células T de ratón madura. El principal paso crítico del protocolo está representado por el cizallamiento de la cromatina, que siempre debe optimizarse para cada tipo de célula. Se sugiere variar el número de células y el número de ciclos de sonicación. Además, la<html> Aring está influenciada negativamente por la presencia de precipitados de SDS en las muestras, que pueden formarse durante la lisis de las células sobre hielo con tampón de lisis SDS. En este caso, es mejor incubar la muestra después de la lisis a temperatura ambiente durante unos minutos para reducir la presencia de precipitados de SDS. Se recomienda optimizar el protocolo para obtener fragmentos cortados entre 200 y 500 pb y evaluar siempre la calidad de corte de las muestras antes de proceder con la inmunoprecipitación. Adicionalmente, el tiempo de fijación, la cantidad de anticuerpo y / o células, y las condiciones de lavado deben optimizarse para cada anticuerpo. Un paso más crítico para hacer que un procedimiento de CHIP tenga éxito es la elección del anticuerpo, ya que los anticuerpos de baja especificidad reducen significativamente la eficacia de la inmunoprecipitación. Anteriormente, un procedimiento de prueba de calidad unificado permitió la evaluación de la especificidad de varios anticuerpos disponibles en el mercado<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. La tubería de detección se basó en dot blot, Western blot y ChIP, proporcionando una lista de reactivos de alta calidad adecuados para ChIP 19 . Más recientemente, se evaluó la especificidad de varios anticuerpos comercialmente disponibles utilizando plataformas de microarrays de péptidos de histonas de alta densidad, lo que permitió establecer una base de datos sobre la especificidad de anticuerpos 20 . El lector puede utilizar esta herramienta útil para identificar los anticuerpos más específicos que se pueden utilizar para los experimentos de ChIP. Este protocolo no ha sido probado para las células T primarias y, en este caso, el lector debe referirse a otros protocolos publicados que llevan a cabo con éxito ChIP en células T primarias 3 , 4 , 21 . En particular, este protocolo se ha utilizado con éxito para realizar ChIP en una línea de células T progenitoras de ratón, así como en una línea de células endoteliales de ratón. Ove_content &quot;&gt; Para cada inmunoprecipitación se deben utilizar 5 x 10 6 células para el análisis de las marcas histonas, ya que este protocolo también puede ser adecuado, con alguna optimización, para realizar ChIP en TFs o cofactores, lo mejor es aumentar el número de células Utilizado para la inmunoprecipitación en estos casos Para alcanzar el número requerido de células para cada experimento, se pueden agrupar más partes alícuotas de lisado cortado antes de diluir la cromatina en el tampón de dilución. Este protocolo también podría ser modificado para realizar ChIP en proteínas endógenas que no se unen directamente al ADN. En este caso, se puede requerir una fijación previa con reticulantes proteína-proteína ( por ejemplo, adipimidato de dimetilo, DMA) (ver Apéndice B para más información). El rendimiento exitoso de ChIP en cofactores se realizó previamente mediante la sobreexpresión de proteínas que se fusionan a una etiqueta de biotina. En este caso, la proteína se purificó con estreptavidina-conjugaTed granos magnéticos, y una pre-fijación con DMA se realizó [ 22] .

El desarrollo, la diferenciación y la homeostasis dependen de programas de expresión génica específicos que se establecen mediante eventos de señalización que modulan la estructura de la cromatina y, por tanto, determinan si un gen específico se activa o se reprime de una manera específica de la célula y del tiempo. Durante el desarrollo de células T, se deben establecer programas específicos de expresión génica para determinar adecuadamente la maduración de los precursores de células T desde el estado doblemente negativo (DN) hasta el estado positivo único (SP), pasando por varias etapas intermedias 1 . La forma en que el programa de expresión génica se regula dinámicamente durante el desarrollo de células T ha sido ampliamente investigado en años anteriores por varios laboratorios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Por modificaciones postraduccionales (PTMs) de las histonas, el intercambio deLas histonas canónicas con variantes de histonas, el desalojo de nucleosomas y la metilación del ADN regulan el interruptor ON / OFF de los genes. Varios grupos han investigado la distribución de todo el genoma de PTMs y variantes de histonas para determinar las marcas que se asocian con diferentes estados de cromatina en ambas regiones reguladoras proximal y distal 7 , 8 , 9 , 10 . Las cascadas de señalización orquestan la regulación dinámica de la cromatina mediante el intercambio de enzimas modificadoras de la cromatina positivas y negativas (también conocidas como modificadores de la cromatina) en elementos potenciadores específicos. Estos modificadores de la cromatina regulan la estructura de la cromatina y, por tanto, la producción transcripcional, por ejemplo, por metilación dinámica de las histonas y acetilación. Este es el caso en la vía de señalización Notch 11 , 12 , 13 ,14. PTM histonas dinámicas; Intercambios con variantes de histonas; Y la ocupación dinámica de histonas, factores de transcripción y cofactores pueden ser investigados mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Los anticuerpos altamente específicos se usan para purificar complejos específicos de ADN-proteína, y el ADN purificado se analiza por PCR cuantitativa (qPCR); Secuenciación profunda (ChIP-Seq); O, menos frecuentemente hoy en día, hibridación a microarrays (ChIP-ChIP). Los ensayos de CHIP a veces son desafiantes debido a complicaciones con la lisis de las células, cizallamiento de la cromatina y / o baja especificidad de los anticuerpos. Se han adoptado varias estrategias para mejorar el protocolo, como es el caso de NEXSON 15 . El uso de sonicadores de baño de agua de refrigeración evita el calentamiento de la muestra que podría dañar los epítopos presentes en la proteína bajo investigación, pero la energía requerida para el cizallamiento de las muestras se dispersa en el agua.Otra mejora se hizo con el desarrollo de dispositivos de ultrasonidos enfocados que evitan la dispersión de la energía. Por lo tanto, los dispositivos de ultrasonidos enfocados permiten mejoras en la lisis celular y en el cizallamiento de la cromatina, eliminando las variaciones inducidas por el operador y aumentando significativamente la reproducibilidad. Este trabajo describe un protocolo (descripción esquemática en la Figura 1 ) para realizar eficientemente el ChIP de las proteínas histonas en una línea de células T de ratón madura llamada E2-10HA 16 , 17 . Las células T suelen ser difíciles de lisar, y el cizallamiento de su cromatina se ha revelado que es ineficiente. En este protocolo, que hace uso de un enfriador enfocado ultrasonidos, el número de células, el tampón de lisis y el ajuste de cizallamiento se optimizaron para la línea de células T de ratón E2-10HA. Este protocolo permite realizar un ChIP con alta reproducibilidad y en un tiempo razonable. De hecho, requiereEs aproximadamente dos días para cortar la cromatina y evaluar la calidad del cizallamiento, y tres días para realizar la inmunoprecipitación, revertir la reticulación y purificar el ADN.

<table><tbody><tr><td>Reactivos Agilent de alta sensibilidad D5000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 Sistema AFA</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimetil adipimidato (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina humana&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo aminoácidos no esenciales (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProteína A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptona primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&nbsp; mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Solución de proteinasa K (20 mg/mL), grado de ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Libre de ARNasa A, DNasa y proteasa (10&nbsp; mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tubo AFA Fibra & Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunoprecipitación de cromatina (chip) en líneas de células t de ratón

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Las vías de señalización regulan los programas de expresión génica a través de la modulación de la estructura de la cromatina a diferentes niveles, como las modificaciones postraduccionales (PTMs) de las colas histonas, el intercambio de histonas canónicas con variantes de histonas y el desalojo de nucleosomas. Tal regulación requiere la unión de factores de transcripción sensibles a señales (TFs) que reclutan enzimas modificadoras de la cromatina en elementos reguladores definidos como potenciadores. Entender cómo las cascadas de señalización regulan la actividad potenciadora requiere un análisis exhaustivo de la unión de TFs, enzimas modificadoras de la cromatina y la ocupación de marcas histonas específicas y variantes de histonas. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) utilizan anticuerpos altamente específicos para inmunoprecipitar complejos específicos de proteína / ADN. El análisis subsiguiente del ADN purificado permite identificar la región ocupada por la proteína reconocida por el anticuerpo. Este trabajo describe un protocolo paraRform ChIP de las proteínas histonas en una línea de células T de ratón madura. El protocolo presentado permite la realización de ensayos ChIP en un plazo razonable y con alta reproducibilidad.

Las células T murinas maduras se sometieron a análisis de ChIP para investigar el enriquecimiento de la mono-metilación de la histona de la lisina 4 en la histona 3 (H3K4me1), la trimetilación de la lisina 4 en la histona 3 (H3K4me3) y la acetilación de la lisina 27 sobre Histona 3 (H3K27ac), así como la ocupación de los nucleosomas, como se revela por panH3 ChIP. La calidad de cizallamiento se evaluó mediante análisis en un gel de agarosa al 1,8% ( Figura 2A ) y en un sistema de electroforesis ( Figura 2B ). H3K4me1 y H3K4me3 se usan generalmente para identificar sitios potenciadores y promotores, respectivamente ( Figura 3A ). De hecho, H3K4me3 es prominente pero no exclusivamente enriquecido en los promotores 5 , 8 , 14 . Una característica de los potenciadores activos debe ser altamente enriquecida para H3K4me1 y H3K27ac y mal enriquecida para H3K4me3 (&lt;Mientras que los intensificadores inactivos presentan niveles bajos de H3K4me3 y H3K27ac pero altos niveles de H3K4me1 ( Figura 3A , panel inferior). Como se muestra en la Figura 3B , el gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa ( Gapdh ) es representativo del análisis de promotores de genes activos ( promotor Gapdh ). De hecho, muestra altos niveles de H3K4me3 y H3K27ac y bajos niveles de H3K4me1. En la Figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) es representativo de potenciadores inactivos ( Dtx1 potenciador ), ya que está altamente enriquecido para H3K4me1 y mal enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac. El desierto génico es representativo de una región que carece de genes codificadores y suele ser demandado como un control negativo de las marcas activas de la cromatina. La observación de que H3K4me1, una marca de potenciador bien aceptada 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , no está enriquecido en Gene desierto sugiere que esta región carece de potenciadores. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general esquemática del protocolo ChIP presentado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figura 2: Control de calidad de corte de la línea de células T de ratón madura. ( A ) Dos partes alícuotas diferentes de la línea de células T de ratón madura E2-10HA se cortaron y aproximadamente 500 ng de ADN purificado se analizaron en un gel de agarosa al 1,8% para evaluar su cizallaCalidad. ( B ) 1 ng de ADN purificado de la muestra 2 se analizó por electroforesis para evaluar su calidad de cizallamiento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figura 3: Marcas de cromatina que caracterizan potenciadores y promotores. ( A ) Los potenciadores activos (panel superior) se caracterizan por H3K4me1 alto, H3K4me3 bajo y H3K27ac alto, mientras que los intensificadores inactivos (panel inferior) presentan H3K4me1 alto, H3K4me3 bajo y H3K27ac bajo. ( B ) Las muestras presentadas en la Figura 2A se agruparon y se usaron para el análisis de ChIP frente a las marcas de histonas H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac y la ocupación de las histonas, como se reveló por panH3 ChIP. Este análisis muestra queE promotor del gen doméstico El gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa ( promotor Gapdh ) está altamente enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac y poco enriquecido para H3K4me1. Por otra parte, el potenciador del gen inactivo Deltex1 ( potenciador Dtx1 ) está altamente enriquecido para H3K4me1 pero pobremente enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac. ChIP utilizando un anticuerpo panH3 se utilizó para investigar la ocupación de nucleosomas. Gene desierto se utilizó como un control negativo. Un experimento representativo es mostrado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre del buffer </td><td> Reactivo </td><td> Concentración final </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampón de dilución </td><td> Sodio dodecIlo (SDS) </td><td> 0,01% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 167 mm </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solución DMA </td><td> El adipimidato de dimetilo (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Solución salina tamponada con fosfato (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Tampón de elución </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 1% (p / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Alto tampón de sal </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EtilendiamiÁcido netetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> Medio IMDM </td><td> El medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> El suero bovino fetal (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptona primatona </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Solución de insulina humana </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampón de sal de LiCl </td><td> Cloruro de litio (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Bajo tampón de sal </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Proteína A Sepharose perlas buffer de lavado </td><td> Tris - HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS tampón de lisis </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 1% (p / v) </td></tr><tr><td> EtilenodiÁcido aminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tampón TE </td><td> Tris - HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Lista de los tampones y el medio utilizado en este protocolo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> EN </td><td> APAGADO </td></tr><tr><td> La punta del Poder </td><td> 150,0 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Factor de servicio </td><td> 15,0 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> Ciclos / explosión </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabla 2: Configuraciones de corte usadas en este protocolo. Estas condiciones se han optimizado para una línea de células T de ratón madura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Proveedor </td><td> Cantidad de anticuerpo / inmunoprecipitación </td><td> Cantidad de células / inmunoprecipitación </td><td> Condiciones de lavado </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce en tampón de baja sal, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td></tr><tr><td colspan="5"> * En el caso del control IgG, la cantidad de anticuerpo y células, así como las etapas de lavado, tienen que reflejar las condiciones de las otras inmunoprecipitaciones. </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Anticuerpos y condiciones de lavado utilizados en este estudio. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; para: keep-with-next.within-page = &quot;siempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gene </td><td> Primer directo </td><td> Primer inverso </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Promotor de Gapdh (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 potenciador (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Desierto de genes </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Primers y sondas utilizadas para qPCR en este estudio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;siempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Causas </td><td> Solución </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina está bajo cizallamiento y los fragmentos son demasiado grandes. </td><td> Se han utilizado demasiadas celdas. </td><td> Reduzca el número de celdas. </td></tr><tr><td rowspan="2"> El cizallamiento es demasiado bajo. </td><td> Aumentar el número de ciclos de corte. </td></tr><tr><td> Aumentar la potencia de pico de cizallamiento, el factor de servicio y / o los ciclos / ráfaga. </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina es excesivamente cortada y los fragmentos son demasiado pequeños. </td><td> Se han utilizado muy pocas células. </td><td> Aumentar el número de celdas. </td></tr><tr><td rowspan="2"> El cizallamiento es demasiado alto. </td><td> Reducir el número de ciclos de corte. </td></tr><tr><td> Reducir la potencia máxima de cizallamiento, el factor de servicio y / o los ciclos / ráfagas. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Demasiado baja recuperación sobre IControl gG y / o control negativo (fondo alto). </td><td> No se usó suficiente cromatina para el experimento. </td><td> Aumentar la cantidad de cromatina. </td></tr><tr><td> La cantidad de anticuerpo es demasiado baja. </td><td> Aumentar la cantidad de anticuerpos. </td></tr><tr><td> La cantidad de anticuerpo es demasiado alta. </td><td> Reducir la cantidad de anticuerpos. </td></tr><tr><td> El anticuerpo tiene una especificidad baja. </td><td> Cambiar el anticuerpo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Las condiciones de lavado son demasiado estrictas. </td><td> Reducir el número de lavado. </td></tr><tr><td> Reducir la rigurosidad de los tampones de lavado. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Las condiciones de lavado no son lo suficientemente estrictas. </td><td> Aumentar el número de lavado. </td></tr><tr><td> Aumentar la rigurosidad de los tampones de lavado. </td></tr><tr><td> Demasiado ADN se pipeteó en el qPCR. </td><td> Reducir la cantidad de ADN pipeteado en el qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR condiciones no son óptimas. </td><td> Optimice las condiciones qPCR. </td></tr><tr><td> Reducir el número de ciclos. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Ningún producto o producto es demasiado bajo en la reacción qPCR de la muestra de entrada. </td><td> No se pipeteó suficiente DNA en el qPCR. </td><td> Aumentar la cantidad de ADN pipeteado en el qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR condiciones no son óptimas. </td><td> Optimice las condiciones qPCR. </td></tr><tr><td> Aumentar el número de ciclos. </td></tr><tr><td> No se usó suficiente cromatina para el experimento. </td><td> Aumentar la cantidad de cromatina. </td></tr><tr><td rowspan="4"> No hay señal en el control positivo y / o panH3 ChIP. </td><td> No se usó suficiente cromatina para el experimento. </td><td> Aumentar la cantidad de cromatina. </td></tr><tr><td> La cantidad de anticuerpo es demasiado baja. </td><td> Aumentar la cantidad de anticuerpos. </td></tr><tr><td> El antiCuerpo tiene baja especificidad. </td><td> Cambiar el anticuerpo. </td></tr><tr><td> La elución es subóptima. </td><td> Asegúrese de agitar frecuentemente las muestras para mantener las perlas en solución. </td></tr></tbody></table> Tabla 5: Solución de problemas.

Este trabajo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando una línea de células T de ratón madura. Este protocolo es adecuado para investigar la distribución de marcas de histonas específicas en sitios específicos del promotor o en todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

El objetivo general de este protocolo es realizar de manera eficiente la inmunoprecipitación de cromatina en líneas celulares de linfocitos T de ratón con alta reproducibilidad en un tiempo razonable, para estudiar la distribución de marcas histónicas en regiones genómicas específicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la cromatina, con especial enfoque en linfocitos T, como por ejemplo cómo se regula la estructura de la cromatina durante la división o activación de los linfocitos T. La principal ventaja de esta técnica es que la fragmentación de la cromatina es eficiente y altamente reproducible.La demostración visual de este método es fundamental, ya que las condiciones de fragmentación de la cromatina son difíciles de establecer, y los pasos con fenol-cloroformo alcohol isoamílico pueden resultar complicados. El procedimiento será demostrado por Francesca Ferrante, una estudiante de doctorado en nuestro laboratorio. En el día uno, transfiera las células T de ratón desde una placa de seis pocillos a un tubo de 50 mililitros.Luego, centrifugue las células durante cinco minutos a 24 grados celsius a aproximadamente 271 veces G. Después de resuspender el botón celular en 30 mililitros de medio de cultivo celular IMDM, cuente las células utilizando una cámara de Neubauer. Recoja alícuotas de 20 millones de células en nuevos tubos de 50 mililitros. A continuación, agregue formaldehído hasta una concentración final de 1 % directamente al medio de cultivo celular e incube a temperatura ambiente durante diez minutos.A continuación, agregue un volumen de un octavo de glicina un molar pH 7,5 e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Pelote las células por centrifugación durante cinco minutos a 24 grados Celsius y aproximadamente 271 veces G. Luego lave las células resuspendiendo el pelotón celular en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato y repita la centrifugación. Lave las células nuevamente con un mililitro de PBS.Transferencia de las células re-suspendidas a tubos de 1,5 mililitros antes de la centrifugación. La fragmentación de la cromatina es el paso más crítico, ya que depende de la cantidad de células, los tubos de fragmentación, el dispositivo, el tampón de lisis y los parámetros de fragmentación. Tras el lavado, re-suspender el botón celular en un mililitro de tampón de lisis SGS e incubar en hielo.Después de 10 minutos, transfiera cada muestra a un tubo de sonicación. Luego realice la fragmentación utilizando un ultrasonido enfocado según la configuración indicada en el protocolo escrito. Después de la fragmentación, transfiera las muestras a tubos de 1,5 mililitros.Centrifugar durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y aproximadamente 18.000 × g. Luego, transferir el sobrenadante a nuevos tubos. Recoger 50 microlitros para la determinación de la eficiencia de cizallamiento y congelar rápidamente el lisado fragmentado en nitrógeno líquido. Almacenar el lisado en alícuotas de un solo uso a menos 80 grados Celsius.Para determinar la eficiencia de cizallamiento, primero agregue 50 microlitros de tampón de elución a los 50 microlitros de cada lisado cizallado. Incube las mezclas a 65 grados Celsius durante la noche con agitación. En el día dos, agregue 100 microlitros de tampón TE y cuatro microlitros de RNasa A al 10 miligramos por mililitro a las muestras.Mezcle las muestras e incube durante dos horas a 37 grados Celsius con agitación. Luego agregue dos microlitros de proteinasa K al 20 miligramos por mililitro a cada muestra, antes de incubar durante dos horas a 55 grados Celsius con agitación. A continuación, transfiera cada muestra a un tubo con gel adecuado para la extracción con fenol cloroformo alcohol isoamílico.Manipule los tubos según las instrucciones del fabricante. Añada 200 microlitros de fenol cloroformo alcohol isoamílico y agite los tubos. Tras la centrifugación, transfiera la fase superior a tubos nuevos.Repita este proceso una vez. Purifique el ADN utilizando columnas de purificación según las instrucciones del fabricante, excepto que lave la membrana dos veces. Después del último lavado, deje el tubo abierto durante dos minutos a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual.Para la elución, agregue 50 microlitros de agua a la columna e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Luego, centrifugue el tubo durante un segundo para humedecer adecuadamente la membrana. Incube la membrana a temperatura ambiente durante un minuto antes de eluir el ADN mediante centrifugación.Cuantifique el ADN purificado en un fluorómetro utilizando un kit de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante. Finalmente, analice aproximadamente 500 nanogramos del ADN purificado en un gel de agarosa al 1,8%. Y aproximadamente un nanogramo del ADN purificado en un sistema de electroforesis utilizando un kit de alta sensibilidad.El tercer día, diluya un volumen de lisado fragmentado con cinco volúmenes de tampón de dilución. Precicle el lisado diluido con 30 microlitros por mililitro de perlas de agarosa A de proteína durante 30 minutos, rotando en la nevera. Centrifugue las muestras a cuatro grados centígrados durante cinco minutos a aproximadamente 750 × g. Recoja el 10 % del lisado clarificado como muestras de entrada y almacénelas a cuatro grados centígrados.A continuación, alícuote la cantidad deseada del lisado clarificado en nuevos tubos. Luego, agregue los anticuerpos seleccionados a cada tubo y rote durante la noche a cuatro grados celsius. En el día cuatro, agregue 40 microlitros de perlas de proteína A.Incube la mezcla durante una hora a cuatro grados centígrados mientras gira. Lave las perlas con un mililitro de tampón de bajo contenido salino incubando durante cinco minutos a cuatro grados centígrados mientras gira. Luego, centrifugue durante tres minutos a cuatro grados centígrados y aproximadamente 950 veces G. Repita el lavado con tampón de alto contenido salino, tampón de cloruro de litio y tampón TE.Luego, agregue 110 microlitros de tampón de elución a las muestras. Incúbelas durante 15 minutos a temperatura ambiente, agitando las muestras en vórtex cada dos minutos. Después de centrifugar nuevamente, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Repita la elución con 100 microlitros de tampón de elución y combine los eluidos. Mientras tanto, agregue tampón de elución a las muestras de entrada recolectadas previamente para alcanzar un volumen final de 200 microlitros. Incube todas las muestras durante la noche a 65 grados celsius con agitación.El día cinco, agregue 200 microlitros de tampón TE a cada eluido y ocho microlitros de RNasa A al 10 miligramos por mililitro. Mezcle las muestras antes de incubar durante dos horas a 37 grados celsius con agitación. Luego agregue cuatro microlitros de proteinasa K al 20 miligramos por mililitro a cada eluido antes de incubar durante dos horas a 55 grados celsius con agitación. A continuación, transfiera cada muestra a un tubo de gel adecuado para la extracción con fenol-cloroformio-isoamil alcohol.Añada 400 microlitros de fenol cloroformo alcohol isoamílico y agite los tubos. Después de centrifugar los tubos, transfiera la fase superior a tubos nuevos y repita este proceso una vez. Finalmente, purifique el ADN utilizando columnas de purificación como antes.Este resultado representativo de la fragmentación de líneas de células T de ratón muestra una fragmentación eficiente de la cromatina. Aquí se muestra un experimento representativo de inmunoprecipitación de cromatina en líneas de células T de ratón. El promotor del gen de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa está altamente enriquecido en trimetilación de la lisina cuatro en la histona tres.Y acetilación de la lisina 27 en la histona tres, pero no para la monometilación de la lisina 4 en la histona tres. Por el contrario, el potenciador del gen inactivo deltex-1 está altamente enriquecido en monometilación de la lisina 4 en la histona tres.Pero pobremente enriquecido en trimetilación de la lisina cuatro en la histona tres y en acetilación de la lisina 27 en la histona tres. Al realizar este procedimiento, es importante recordar resuspender los precipitados de SGS antes de fragmentar las muestras.Tuvimos por primera vez la idea de este método al estudiar la regulación génica en linfocitos T. Seleccionamos los linfocitos T porque son altamente relevantes para aplicaciones médicas y representan uno de los sistemas modelo mejor descritos para estudiar la expresión génica en eucariotas superiores. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de la cromatina exploraran la regulación de la cromatina en sistemas mamíferos.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades asociadas a linfocitos T, ya que permite el análisis detallado del establecimiento y la regulación de los programas de expresión génica en linfocitos T. No olvide que trabajar con formaldehído, fenol-cloroformo y alcohol isoamílico es extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones como trabajar bajo una campana extractora y usar el equipo de protección adecuado durante la realización de este procedimiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación del cromatina en linfocitos T de ratón, también puede aplicarse a otros sistemas, como líneas celulares endoteliales y pulmonares.

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aprenda a realizar inmunoprecipitación de cromatina en líneas de células T de ratón para estudiar marcas de histonas y regulación de la estructura cromatínica. Este protocolo eficiente permite investigar interacciones proteína-ADN en células inmunes.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

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