La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

El objetivo general de este experimento es visualizar y cuantificar los eventos de traducción compartimentados que tienen lugar durante los pasos iniciales de la adhesión celular. Este método tiene una amplia aplicación. Utilícelo siempre que se pueda analizar una respuesta de traducción específica rápida, como cuando se analiza la migración celular, la adhesión o la respuesta temprana a los fármacos.

La principal ventaja de esta técnica es que es fácil, rápida y rentable. Solo requiere puromicina, anticuerpos dirigidos contra la puromicina y el sistema de imágenes de exploración confocal estándar. Para empezar, haz una suspensión de las células MRC-5.

Utilice la tripsinización, seguida de centrifugación, eliminación del sobrenadante, luego resuspensión en DMEM con diez por ciento de FBS, a 40 mil células por mililitro. Incubar la suspensión con una rotación suave durante 20 minutos para disociar completamente los complejos de adhesión focal. Esto es fundamental.

A continuación, en dos platos de 35 milímetros con fondo de vidrio, agregue dos alícuotas de suspensión de mililitros e incube para permitir la adhesión celular y la formación de SiC. Después de 40 minutos, trate una placa con cicloheximida y devuélvala a la incubadora. Esta placa funcionará como el control negativo.

Después de 55 minutos, aplique puromicina en ambas placas a la concentración predeterminada e incube las placas durante cinco minutos más. Después de una hora de siembra y cinco minutos de puromicina en cooperación, lave cada plato dos veces con dos mililitros de PBS helado. Luego fije las celdas con un mililitro de formaldehído al cuatro por ciento en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de la fijación, lave las células tres veces con PBS, luego permeable las células con 500 microlitros de tritón X-100 al 0,5 por ciento en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las placas tres veces con PBS y luego aplique 500 microlitros de BSA al uno por ciento en PBS. Continúe la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos más.

Para eliminar el exceso de BSA, lave las células tres veces con 0.1 por ciento de Tween-20 en PBS. Ahora, incuba las células con 300 microlitros de anticuerpo anti-puromicina. Retire el anticuerpo no unido mediante tres lavados con Tween-20 al 0,1 por ciento.

A continuación, aplique trescientos microlitros de una mezcla de dos anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para visualizar polipéptidos puromiolados y de factem. Incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de una hora, lave las placas tres veces para eliminar los anticuerpos no unidos y luego aplique trescientos microlitros de solución Tween-20 al 0,1 por ciento, suplementada con DAPI.

Deje que el DAPI permanezca en las celdas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Finalmente, lave las celdas cuatro veces más, terminando con un lavado en PBS puro. Luego, almacene las células en dos mililitros de PBS para obtener imágenes.

Utilizando cualquier sistema de imágenes confocales disponible en el mercado, determine primero los ajustes adecuados que maximicen el rango dinámico para la cuantificación. El enfoque en la cuantificación solo se puede obtener si se evita la saturación del tamaño del pico y la concentración se ajusta correctamente. El ajuste se puede lograr ajustando cuidadosamente la ventaja de potencia del láser y los desplazamientos.

Primero, ajuste el factor de zoom y el número de píxeles para optimizar el tamaño de píxel. Hazlo de acuerdo con el teorema de Nyquist. A continuación, disminuya la velocidad de escaneo y utilice el promedio para mejorar la relación señal-ruido.

A continuación, determine manualmente los planos focales superior e inferior apropiados a lo largo del eje Z y establezca el StepSize calculando la resolución axial y dividiendo esta distancia por 2,3. El resultado típico es de 20 a 25 capas de imagen. Una vez ajustados los ajustes, adquiera una imagen confocal de una sola celda completa utilizando un objetivo de inmersión en aceite Plan Apo de 60x con una apertura numérica de 1,42.

Para cuantificar y analizar las señales de fluróforo, primero abra una imagen correspondiente a la capa de interés del plano z en la imagen J. Luego, usando la herramienta de dibujo, haga una línea a través de la celda donde se desea la cuantificación. A continuación, modifique el olor de la línea haciendo doble clic en recto. Los valores de intensidad se promediarán a lo largo del ancho de la línea, así que use una línea más delgada para evitar la superposición de señales de diferentes estructuras.

A continuación, perfile la densidad de la señal a lo largo de la línea. Ahora, repita el proceso de recolección de la densidad de señal a lo largo de la misma línea en el canal que corresponde a un fluróforo. Los valores siempre se ordenarán mediante la orientación de la línea.

Ahora, copie los datos del perfil y péguelos en una hoja de cálculo para su análisis. Repita este proceso de recopilación de datos de cada imagen de plano Z de interés antes de continuar con el análisis estadístico. Alternativamente, en lugar de recolectar señal a lo largo de un eje, la señal se puede recolectar de un área de la imagen.

En primer lugar, utilice la función de forma geométrica para seleccionar una región de interés. A continuación, ajuste el nivel de umbral para evitar cualquier fondo. En el histograma de intensidades de píxeles, mueva el control deslizante para ajustar qué píxeles se incluirán en la cuantificación.

Establezca el umbral para eliminar todos los píxeles rojos fuera de la celda. Ahora, defina los parámetros de medición necesarios para medir la señal de interés y no la señal de fondo. Alterne el límite a las opciones de umbral y densidad integrada.

A continuación, utilice el comando measure. Esto abrirá una nueva ventana con los valores medios de gris y el recuento de píxeles en el área seleccionada. Ahora repita el proceso, aplicando el mismo umbral para determinar la intensidad de la señal en toda la celda.

A continuación, utilice estos datos para calcular la relación entre la señal en el área seleccionada y la de toda la celda. Para una medición precisa de los eventos de traslación utilizando la incorporación de purmicina, primero se evaluaron las condiciones óptimas para una medición axial. Se comparó un espectro de concentraciones frente a un tratamiento de cinco o diez minutos.

La concentración aceptable de puromicina para las células MRC-5 y HeLa fue un poco más alta que la necesaria para las células Huh-7. Las células tratadas durante diez minutos con altas concentraciones de puromicina generaron principalmente polipéptidos puromiocolados más pequeños. Los polipéptidos más pequeños se desactivan más rápidamente y no son deseables.

Por lo tanto, se consideró más deseable un tiempo de incubación más corto. El tratamiento con cicloheximida es un control negativo eficaz e importante. En las células MRC-5, solo se detectó una señal débil de puromicina después del tratamiento con cicloheximida.

Mediante la cuantificación de señales axiales, se pudo evaluar la localización general de los polipéptidos puromiolados correspondientes a las proteínas recién sintetizadas a diferentes niveles dentro de la célula. También fue factible una distribución cuantitativa de la señal a través de la célula. Para cualquiera de las dos técnicas, era importante cuantificar la señal de cada plano Z de la pila de imágenes para evaluar con precisión los eventos de traslación en una celda completa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar el evento de traducción en el compartimento subcelular. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día, si se realiza correctamente. Cuando uno piensa en este procedimiento, es importante recordar que la concentración de puromicina y su tiempo de incubación es importante.

Para limitar la difusión, es preferible limitar el tiempo de incubación. También es importante reconocer que la calidad del tipo de adquisición de la imagen es fundamental para obtener buenos resultados. No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana química, mientras se realiza este procedimiento.