Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

El objetivo general de este procedimiento es mapear los sitios de integración de vectores retrovirales derivados del virus de la leucemia murina para definir regiones reguladoras específicas de la célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en estudios de terapia génica y regulación génica, como por ejemplo dónde se integra el vector en el genoma humano y qué elemento regulador puede utilizarse activamente a través de un subtipo particular. Originalmente, tuvimos la idea de este método al observar que, en estudios de terapia génica, los vectores MLV se integran en promotores y potenciadores activos y específicos de subtipo.

Comience por transducir las células diana con un vector retroviral derivado del MLV que contenga el gen reportero EGFP y pseudotipado con VSV-G o con la glucoproteína de envoltura amfrotrópica. Las células transducidas simuladas se utilizan como control negativo. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, centrifugue las muestras y luego re suspenda 100.000 células en 300 microlitros de PBS que contenga dos por ciento de suero bovino fetal.

Luego, mida la expresión de EGFP mediante análisis citométrico de flujo. Recopile otras 0,5 a cinco millones de células transducidas para la preparación de ADN genómico y la posterior digestión con enzimas de restricción. Prepare cuatro digestiones con enzimas de restricción por muestra en tubos de 1,5 mililitros.

Digiera de 0,1 a un microgramo de ADN-G en cada tubo. Añada 10 unidades de TRU91 y un microlitro de tampón M por muestra en un volumen final de 10 microlitros. Distribuya dos microlitros de la mezcla en los tubos de digestión.

A continuación, incubar las reacciones a 65 grados celsius durante seis horas o durante la noche. Tras la incubación, añadir 40 microlitros de agua a un tubo de 1,5 mililitros. En el mismo tubo, añadir 10 unidades de PST1 y un microlitro de tampón H por muestra.

Dispensar 10 microlitros de la mezcla de reacción de digestión en los tubos de digestión. Incubar las reacciones a 37 grados Celsius durante seis horas o durante la noche. Al día siguiente, preparar ocho reacciones de ligación de adaptadores en tubos de 1,5 mililitros.

Para cada reacción, añada la mezcla de reacción de la ligasa a 10 microlitros de ADN genómico digerido. Incube a 16 grados Celsius durante tres a seis horas. Para la PCR de primera ronda, prepare 48 reacciones de PCR en tubos de 0,2 mililitros.

Para cada PCR, agregue la mezcla de reacción que contiene el cebador puente y el cebador MLV3 prime LTR a dos microlitros de la reacción de ligación. Coloque las muestras en un termociclador con tapa calefactora. Establezca los parámetros de ciclado y realice la primera ronda de reacción PCR.

Para la PCR de segunda ronda, prepare la mezcla de reacción que incluya el cebador anidado del enlazador y el cebador anidado del LTR 3' del MLV. Luego, agregue dos microlitros del producto de PCR de la primera ronda como molde. A continuación, ejecute la reacción de PCR de segunda ronda para generar los productos finales de PCR de LN.

Después de la PCR de segundo ciclo, reúna las 48 reacciones de PCR anidada LM en un tubo de 15 mililitros. Luego agregue 20 microlitros de tampón de carga a 100 microlitros del producto de PCR LM agrupado y precipitado. Y cargue la muestra en un gel de agarosa al uno por ciento junto con la escalera de ADN de 100 pares de bases.

Corra el gel a cinco voltios por centímetro durante 30 a 60 minutos una vez que las bandas estén resueltas; corte la porción del gel que contiene amplicones de entre 500 y 150 pares de bases. Después de purificar el producto de PCR de LM con un kit de extracción en columna basado en gel, mida la concentración mediante un espectrofotómetro UV antes de continuar con la preparación de la biblioteca. Asimismo, evalúe la longitud de los productos de PCR de LM utilizando un equipo bioanalizador según las instrucciones del fabricante.

Prepare la biblioteca mediante la puesta a punto de una PCR de indexación. Para cada PCR, utilice de 150 a 170 nanogramos de producto de PCR de LM purificado, con una combinación de índices diferente para cada muestra. Realice la PCR en un termociclador con tapa calentada, como se indica.

Después de la PCR, diluya la biblioteca purificada a 10 nanomolar con tris HCL 10 milimolar. A continuación, mezcle cinco microlitros del pool diluido con cinco microlitros de hidróxido de sodio 0,2 newtons en un nuevo tubo de 1,5 mililitro. Agite brevemente por vórtex, centrifugue y luego incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar las bibliotecas.

Coloque los tubos del grupo desnaturalizado en hielo y 990 microlitros de tampón de hibridación HT1 previamente enfriado. Luego, retire 300 microlitros del grupo desnaturalizado y transfiéralos a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añada 300 microlitros de HT1 previamente enfriado para obtener un grupo final de biblioteca de diez picomoles.

En paralelo, mezcle 10 nanomolares de biblioteca de control fija en un volumen de dos microlitros con 3 microlitros de tris HCl 10 milimolar en un tubo de 1,5 mililitros. Añada cinco microlitros de hidróxido de sodio 0,2 newtons y vortexee brevemente. Después de centrifugar, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la fijación diluida.

Después de la incubación, coloque el tubo en hielo y agregue 990 microlitros de HT1 previamente enfriado. A continuación, retire alícuotas de 100 microlitros de fijador desnaturalizado en un tubo nuevo de 1,5 mililitros y agregue 300 microlitros de HT1 previamente enfriado para obtener una concentración final de 10 picomolares de fijador. Finalmente, en un tubo nuevo de 1,5 mililitros, mezcle 510 microlitros del grupo de bibliotecas desnaturalizadas con 90 microlitros de la biblioteca fija desnaturalizada, obteniendo así un grupo final de 10 picomolares con un 15 % de control de fijador para ser secuenciado.

Esta imagen muestra el análisis de 3498, 2989 y 4103 agrupaciones de sitios recurrentes de integración del virus de la leucemia murina (MLV) en células progenitoras hematopoyéticas, progenitores eritroides y progenitores mieloides, respectivamente. En cada población celular, más del 95 % de las agrupaciones de MLV se superpusieron con potenciadores y promotores definidos epigenéticamente. Las regiones específicas de célula diana para MLV presentaron una alta acetilación y se asociaron con la expresión específica de la célula del gen diana.

Los ejemplos incluyen el promotor del gen SPINK2 específico para HSP. La región reguladora del locus que contiene potentes potenciadores de los genes de globina beta-like específicos para eritroides. Los potenciadores ubicados aguas arriba del gen LYZ específico para NPP.

Los ensayos de luciferasa confirmaron el subconjunto de potenciadores específicos de células dirigidos por MLV en EPP y MPP. Las regiones dirigidas por MLV específicas de eritroides mostraron una actividad mayor en EPP que en MPP y viceversa, lo que confirma que MLV identifica potenciadores específicos de células que posiblemente controlan la expresión de genes cercanos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una semana si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar maximizar la frecuencia de células transducidas para obtener una recuperación óptima de los sitios de integración. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mapear los sitios de integración virales ajustando primero el ADN genómico, luego ligando los fragmentos genómicos con un enlazador de ADN, seguido de la amplificación de la unión entre el genoma del huésped y el virus mediante PCR-ML y, finalmente, la secuenciación profunda de la biblioteca de amplicones.