Name: Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a mapear sitios de integración de vectores retrovirales MLV en células humanas para identificar regiones reguladoras específicas. Este método optimiza estrategias de terapia génica mediante el análisis de promotores y potenciadores activos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), el Ministerio Italiano de Educación, Universidades e Investigación (FIRB-Futuro en Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro en Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), el Ministerio Italiano de Salud (Jóvenes Investigadores llaman 2011 GR-2011-02352026) y la Imagine Institute Foundation (París, Francia).

1. Transducción MLV de células humanas <ol><li> Aislar las células diana y transducirlos con un vector retroviral derivado de mlV que alberga el gen reportero eGFP y pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G) o la glicoproteína de la envoltura anfotrópica 16 . <ol><li> Mantenga las células simuladas transducidas como un control negativo para los siguientes análisis. Dado que los vectores retrovirales basados ​​en mLV pueden transducir células que se dividen eficazmente, cultivan la población de células diana en condiciones que estimulan la división celular. Las condiciones de transducción necesitan ser optimizadas específicamente para cada tipo de célula bajo estudio. Las condiciones de crecimiento celular y de transducción para progenitores hematopoyéticos humanos, células T y células epidérmicas se describen en las Referencias 7, 14, 15 y 17. </li></ol></li><li> 48 h después de la transducción, resuspender 100.000 células en 300 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2% de suero bovino fetal y medir la expresión de eGFP por fAnálisis de baja citometría (láser de excitación de 488 nm). Utilizar células transducidas simulando como control negativo. Para una recuperación óptima del sitio de integración, purifique las células GFP + mediante Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS). </li><li> Recoger 0,5 a 5 millones de células para la preparación del ADN genómico. Se prefiere un período de cultivo más largo (&gt; 7 días) para diluir el provirus no integrado y es necesario cuando se analiza la progenie a largo plazo de células madre bona fide (véase la sección de discusión y la referencia 15 ). Los gránulos de células pueden congelarse instantáneamente y almacenarse a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 2. Amplificación de los sitios de integración de mLV mediante PCR-PCR (LM-PCR) <ol><li> Preparación de ADN genómico (gDNA) <ol><li> Extraer gDNA utilizando un kit de extracción de ADN a base de columna y seguir el protocolo para las células cultivadas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Enzima de restricción digestien <ol><li> Preparar 4 digestiones de enzimas de restricción por muestra en tubos de 1,5 mL. Digerir 0,1 a 1 μg de gDNA en cada tubo añadiendo 1 μl de Tru9I (10 U) y 1 μl de Tampón M en un volumen final de 10 μl. Incubar las reacciones a 65 ° C durante 6 h o durante la noche. </li><li> Añadir a cada reacción 1 μl de PstI (10 U), 1 μl de Tampón H y 8 μl de agua. Incubar las reacciones a 37 ° C durante 6 h o durante la noche. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Enlazador ligadura <ol><li> Preparar una solución madre Tru9I 100 μM de enlace en un tubo de 1,5 ml mezclando los oligonucleótidos de hebra más ligando y ligador menos una concentración de 100 μM. Poner el tubo en un conjunto de agua a 100 ° C y dejar enfriar a temperatura ambiente. La solución madre de ligante Tru9I se puede almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Establecer 8 reacciones de ligadura de ligadores en tubos de 1,5 mL. Para cada reacción, añada el siguiente componenteS a 10 μl de digestión con enzimas de restricción: 1,4 μl de tampón de reacción de 10 μg de ADN-ligasa T4, 1 μl de Tru9I de ligante 10 μM, 1 μL (2.000 U) de T4 DNA ligasa y 0,6 μl de agua. Incubar a 16 ° C durante 3 a 6 h. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Primera PCR <ol><li> Establecer 48 reacciones de PCR (6 reacciones de cada tubo de ligadura) en tubos de 0,2 ml. Para cada PCR, añada los siguientes reactivos a 2 μl de reacción de ligadura: 5 μl de tampón de PCR 10X, 2 μl de sulfato de magnesio 50 mM, 1 μl de desoxinucleótido 10 mM (dNTP), 1 μl de cebador 10 μM de ligante, Μl de cebador LTR mLV-3 &#39;10 μM, 0,3 μl (1,5 U) de Taq DNA Polimerasa y 37,7 μl de agua. Las secuencias de cebador se proporcionan en la Tabla 1. </li><li> Realizar la reacción de PCR en un termociclador con tapa calentada, como sigue: 95 ° C durante 2 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 °; C durante 5 min; Mantener a 4 ° C. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Segunda PCR <ol><li> Establecer 48 reacciones de PCR (1 de cada &quot;primer tubo de PCR&quot;) en tubos de 0,2 ml. Para cada PCR, añada los siguientes componentes a 2 μL de la primera reacción de PCR: 5 μl de tampón de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnesio 50 mM, 1 μl de Mezcla de dNTP 10 mM, 1 μl de cebador anidado de ligante 10 μM, Μl de cebador anidado de 10 μM mLV-3 &#39;LTR, 0,3 μL de Taq DNA Polimerasa (1,5 U) y 37,7 μl de agua. Utilizar cebadores anidados diseñados para la estrategia de secuenciación masiva específica elegida: (i) cebador anidado de enlace y cebador anidado de mLV-3 &#39;LTR compatible con la plataforma Illumina; (Ii) cebador anidado de enlace y cebador anidado de LTR mLV-3 &#39;compatible con la plataforma de Roche. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 . </li><li> Realizar la reacción de PCR en un termociclador con tapa calentada, como sigue: 95 ° C durante 2 min; 25Ciclos de 95 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72ºC durante 5 min; Mantener a 4 ° C. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Agrupe las 48 reacciones de PCR anidadas en un tubo de 15 ml (volumen final de ~ 2,4 ml). Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Determinar la presencia y el tamaño de los productos de LM-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. <ol><li> Añadir 4 μl de tampón de carga a 20 μL de productos LM-PCR y cargar la muestra en un gel de agarosa al 1%, junto con una escala de ADN de 100 bp. Hacer funcionar el gel a 5 V / cm durante 30 a 60 minutos y visualizar los productos de PCR mediante tinción con bromuro de etidio. </li><li> Ejecutar una reacción LM-PCR de la muestra de transducción simulada como control negativo. </li></ol></li><li> Se precipitaron los amplicones añadiendo 0,1 volúmenes de solución de acetato de sodio (3 M, pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar y congelar a -80 ° C durante 20 min. <ol><li> Giro en fuLl en una microcentrífuga estándar a 4 ° C durante 20 min. Desechar el sobrenadante y lavar el sedimento con etanol al 70%. Girar a toda velocidad en una microcentrífuga estándar a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Desechar el sobrenadante y secar al aire el pellet. Añadir 200 μl de agua de grado PCR y resuspender el ADN. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Añadir 20 μl de tampón de carga a 100 μL de los productos de LM-PCR y cargar la muestra en un gel de agarosa al 1%, junto con una escalera de ADN de 100 bp. <ol><li> Se hace funcionar el gel a 5 V / cm durante 30 a 60 minutos y se corta la porción del gel que contiene 150 a 500 bp de largo amplicones. </li><li> Purificar los productos LM-PCR con un kit de extracción de gel a base de columna y medir la concentración usando un espectrofotómetro UV. </li></ol></li><li> Utilice 1 μl de biblioteca para evaluar la longitud de los productos de LM-PCR usando un instrumento de bioanalizador, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li><sTrong&gt; Clonación con escopeta de amplicones <ol><li> Utilizar 20 ng de los productos LM-PCR purificados y clonarlos en el vector pCR2.1-TOPO, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Realizar reacciones de secuenciación utilizando el cebador universal M13, seguido de la cartografía genómica de las secuencias resultantes, para revelar la presencia de las uniones del genoma viral (incluido el cebador anidado de mLV-3 &#39;LTR) en&gt; 50% de los clones para identificar muestras adecuadas Para la secuenciación masiva. Ejemplo de una unión viral-genoma: <img alt="Unión" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLV-3 &#39;LTR iniciador anidado 454 y el iniciador anidado de ligador 454 ( Tabla 1 ) se indican en negrita y el extremo 3&#39; del LTR viral en cursiva. La secuencia genómica humana se destaca en texto rojo (chr10: 6439408 - 6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. Secuenciación masiva de los sitios de integración de mLV NOTA: Producto LM-PCRLos procesos pueden ser secuenciados usando plataformas comerciales (eligiendo el par anidado apropiado en la segunda reacción PCR, véase la subsección 2.5.1). Para la secuenciación por Roche GS-FLX pyrosequencing plataforma, consulte a los documentos anteriores 7 , 14 , 15 . En esta sección, se describe un protocolo recién optimizado para la plataforma de secuenciación de Illumina. <ol><li> Preparación de la biblioteca <ol><li> Establecer una reacción de PCR de indexación por muestra en tubos de 0,2 ml. Para cada PCR, a~nadir los siguientes reactivos a 5 μl (150-170 ng) de producto LM-PCR purificado: 5 μl de Primer Indice 1, 5 μl de Indice Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix y 10 μL de PCR- Grado de agua. Utilice una combinación de índice diferente para cada muestra. </li><li> Realizar reacciones de PCR en un termociclador con tapa calentada, como sigue: 95 ° C durante 3 min; 8 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s; 72 ° C durante 5 men; Mantener a 4 ° C. </li><li> Purificar los productos de PCR usando un protocolo de aislamiento de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI): en tubos nuevos de 1,5 ml, agregar 56 μL de perlas a cada muestra y proceder siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 25 μl de Tris-HCl 10 mM. Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Comprobación de la biblioteca <ol><li> Utilice 1 μl de muestra para evaluar el tamaño de la biblioteca utilizando un instrumento de bioanalizador. </li><li> Utilizar 1 μl de muestra para cuantificar la molaridad de la biblioteca usando un ensayo de PCR en tiempo real basado en fluorescencia, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Dilución y secuenciación de la biblioteca <ol><li> Diluir las bibliotecas hasta 10 nM usando Tris-HCl 10 mM. Para la agrupación de las bibliotecas, transferir 5 μ l de cada biblioteca diluida a un nuevo tubo de 1,5 ml y luego diluir la piscina a 4 nM en Tris-HCl 10 mM. </li><li> Mezclar 5 μL de la mezcla diluida con 5 μl de NaOH 0,2 N en un nuevo 1,5 mL, vórtice brevemente, centrifugue e incube durante 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar las bibliotecas. </li><li> Ponga los tubos en hielo y agregue 990 μl de tampón de hibridación pre-enfriado (HT1). Alícuota de 300 μ l de piscina desnaturalizada en un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 300 μ l de pre-refrigerados HT1 para obtener una biblioteca final de 10 pM. </li><li> En paralelo, mezclar 2 μl de biblioteca de control PhiX (10 nM) con 3 μl de Tris-HCl 10 mM en un tubo de 1,5 ml. Añadir 5 μL de NaOH 0,2 N, agitar brevemente vórtice, centrifugar e incubar durante 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar la PhiX diluida. Coloque el tubo sobre hielo y añada 990 μl de HT1 previamente enfriado. </li><li> Alícuote 300 μl de PhiX desnaturalizada en un nuevo tubo de 1,5 ml y añada 300 μl de HT1 previamente enfriado para obtener una PhiX final de 10 μM. </li><li> En un nuevo tubo de 1,5 ml, mezclar 510 μL de la piscina de la biblioteca desnaturalizada con 90 μL de la biblioteca PhiX desnaturalizada, obteniendo así un pool final de 10 μM con un 15% de control PhiX. </li><li> Pipetear estos 600 μl de muestraDe volumen en el depósito de carga de muestra del cartucho de reactivo de secuenciación descongelado y proceda inmediatamente a realizar un ciclo de 150 ciclos. NOTA: Los reactivos críticos y secuencias de cebadores requeridos para este protocolo se enumeran en la Tabla 1 . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li>
<li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li>
<li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li>
<li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li>
<li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li>
<li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li>
<li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional%2C+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724(2016).</li>
<li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li>
<li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting%2C+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688(2010).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158(2013).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración de mLV, un retrovirus que las regiones de la cromatina objetivo, epigenéticamente marcado como promotores activos y potenciadores. Los pasos críticos y / o limitaciones del protocolo incluyen: (i) transducción mLV de la población de células diana; (Ii) amplificación de las uniones huésped-virus por LM-PCR; (Iii) recuperación de una alta fracción de sitios de integración. Los vectores retrovirales basados ​​en mLV transfieren ...

La identidad celular se determina mediante la expresión de conjuntos específicos de genes. El papel de los elementos reguladores cis, tales como promotores y potenciadores, es crucial para la activación de programas de transcripción específicos de tipo celular. Estas regiones reguladoras se caracterizan por características específicas de la cromatina, tales como modificaciones peculiares de las histonas, factores de transcripción y unión de co-factores, y accesibilidad a la cromatina, que han sido ampliamente utilizados para su identificación genómica en varios tipos de células 1 , 2 , 3 . En particular, el perfil genómico de la acetilación de histona H3 lisina 27 (H3K27ac) se utiliza comúnmente para definir promotores activos, potenciadores y super-potenciadores 4 , 5 , 6 . El virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) es un gamma-retrovirus que es ampliamente utilizado para el genTransferencia en células de mamíferos. Después de infectar una célula diana, el genoma del ARN retroviral se retrotranscribe en una molécula de ADN de doble cadena que se une a las proteínas víricas y celulares para ensamblar el complejo de preinteligencia (PIC). El PIC entra en el núcleo y se une a la cromatina de la célula huésped. En este caso, la integrasa viral, un componente clave de PIC, media la integración del ADN proviral en el genoma de la célula huésped. MlV integración en el ADN genómico no es al azar, pero se produce en elementos activos cis-reguladores, tales como promotores y potenciadores, en una célula de forma específica 7 , 8 , 9 , 10 . Este peculiar perfil de integración está mediada por una interacción directa entre la integrasa mLV y las proteínas celulares de bromodominio y dominio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . Las proteínas BET (BRD2, BRD3 yBRD4) actúan como puente entre la cromatina del huésped y el PIC mlV: a través de sus bromodominios reconocen regiones cis-reguladoras altamente acetiladas, mientras que el dominio extraterminal interactúa con la integrasa mLV 11 , 12 , 13 . Aquí, describimos el escaneo retroviral, una herramienta novedosa para mapear regiones reguladoras cis-activas basadas en las propiedades de integración de mLV. Brevemente, las células se transducen con el vector retroviral derivado de mlV que expresa el gen indicador de proteína fluorescente verde (eGFP) mejorada. Después de la extracción del ADN genómico, las uniones entre la repetición terminal larga (LTR) de 3 &#39;del vector mlV y el ADN genómico se amplifican mediante PCR (LM-PCR) mediada por enlazadores y se secuencian masivamente. MlV sitios de integración se asignan al genoma humano y las regiones genómicas altamente objetivo de mLV se definen como grupos de mlV sitios de integración. Escaneo retroviralNing se utilizó para definir la célula específica de los elementos reguladores activos en varias células primarias humanas [ 14 , 15] . MlV clusters co-mapeados con epigenéticamente definidos promotores y potenciadores, la mayoría de los cuales albergan histonas marcas activas, como H3K27ac, y fueron específicos de células. El escaneo retroviral permite la identificación en todo el genoma de los elementos reguladores del ADN en poblaciones de células purificadas prospectivamente 7,14 , así como en poblaciones celulares definidas de forma retrospectiva, como las células madre de queratinocitos, que carecen de marcadores efectivos para el aislamiento prospectivo 15 .

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoScientific 16000044</td><td></td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tubo de 0,2 ml</td><td>Proveedor de laboratorio general</td> Tubo <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de 1,5 ml proveedor de</td><td>laboratorio</td></tr><tr><td>general QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>o ADN</td></tr><tr><td>ligasa T4 equivalente&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 T4 T4 Tampón de reacción de ligasa</td> New <td>England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Linker Plus Strand oligonucleótido</td><td>proveedor de laboratorio</td><td></td> general 5<td>'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp; (Grado de purificación: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Proveedor de laboratorio general de oligonucleótidos de cadena negativa</td><td></td><td></td> 5<td>'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grado de purificación: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Tampón de corte H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platino Taq ADN Polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Grado PCR Proveedor</td> de <td>laboratorio general Termociclador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos (con tapa calentada)</td><td>Proveedor</td><td></td><td></td>de laboratorio general</tr><tr><td>Linker Primer proveedor</td> de <td>laboratorio</td><td></td> general <td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grado de purificación: grado PCR)</td></tr><tr><td>MLV-3' Proveedor</td><td></td> de <td>laboratorio general</td> de imprimación LTR <td>5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grado de purificación: grado PCR)</td></tr><tr><td>cebador anidado del enlazador 454</td><td>proveedor</td><td></td> de laboratorio general <td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado de purificación: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' Imprimación anidada LTR 454</td><td>proveedor</td><td></td> de laboratorio general <td>5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado de purificación: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>cebador anidado del enlazador Illumina</td><td>proveedor</td><td></td> de laboratorio general <td>5'-TCGTCGGCAGCGTGTGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado de purificación: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' Imprimación anidada LTR Illumina</td><td>proveedor</td><td></td> de laboratorio general <td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado de purificación: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Solución de acetato de sodio (3M) pH 5.2</td><td>proveedor</td><td></td><td></td>de laboratorio general</tr><tr><td>Etanol (absoluto) para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Topo TA Kit de clonación (con vector pCR2.1-TOPO)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Escalera de ADN de 100 pb</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>6x Tampón de carga</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de índice</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 o FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético Dynal para tubos de 2 ml</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Kit Agencourt AMPure XP 60 ml</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td> proveedor <td>de laboratorio</td><td></td><td></td>general</tr><tr><td>Agilent 2200 Sistema TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>D1000 Reactivos</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit para plataformas Illumina (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Sistema de PCR rápida en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, molecular </td><td>proveedor</td><td></td><td></td>de laboratorio general de grado biológico</tr><tr><td>HT1 (tampón de hibridación)</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>Incluido en el kit de reactivos MiSeq Kit</td><td></td></tr><tr>de<td>reactivos MiSeq v3 (150 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

escaneo retroviral: mapeo de sitios de integración mlv para definir regiones reguladoras específicas de células

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Los vectores retrovirales basados ​​en virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) se integran predominantemente en potenciadores y promotores acetilados. Por esta razón, los sitios de integración mLV pueden usarse como marcadores funcionales de elementos reguladores activos. Aquí, presentamos una herramienta de exploración retroviral, que permite la identificación a nivel genoma de potenciadores y promotores específicos de células. En resumen, la población de células diana se transduce con un vector derivado de mLV y el ADN genómico se digiere con una enzima de restricción de corte frecuente. Después de la ligación de fragmentos genómicos con un enlazador de ADN compatible, la reacción en cadena de polimerasa mediada por enlazador (LM-PCR) permite la amplificación de las uniones genómicas virus-huésped. La secuenciación masiva de los amplicones se utiliza para definir el perfil de integración de mLV en todo el genoma. Finalmente, se definen grupos de integraciones recurrentes para identificar regiones reguladoras específicas de células, responsables de la activación de programas transcripcionales específicos de tipo celular. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; La herramienta de exploración retroviral permite la identificación en todo el genoma de promotores y potenciadores específicos de células en poblaciones de células diana prospectivamente aisladas. En particular, el escáner retroviral representa una técnica instrumental para la identificación retrospectiva de poblaciones raras ( por ejemplo, células madre somáticas) que carecen de marcadores robustos para el aislamiento prospectivo.

Flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral El flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral se esquematiza en la Figura 1 . La población de células diana se purifica y transduce con un vector retroviral derivado de mlV que expresa un gen informador eGFP. El transgén está flanqueado por las dos repeticiones terminales largas idénticas (5 &#39;y 3&#39; LTR), asegurando ...

Aquí, describimos un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración Moloney murino leucemia virus basados ​​en retrovirus vectores en células humanas.

Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

El objetivo general de este procedimiento es mapear los sitios de integración de vectores retrovirales derivados del virus de la leucemia murina para definir regiones reguladoras específicas de la célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en estudios de terapia génica y regulación génica, como por ejemplo dónde se integra el vector en el genoma humano y qué elemento regulador puede utilizarse activamente a través de un subtipo particular. Originalmente, tuvimos la idea de este método al observar que, en estudios de terapia génica, los vectores MLV se integran en promotores y potenciadores activos y específicos de subtipo.Comience por transducir las células diana con un vector retroviral derivado del MLV que contenga el gen reportero EGFP y pseudotipado con VSV-G o con la glucoproteína de envoltura amfrotrópica. Las células transducidas simuladas se utilizan como control negativo. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, centrifugue las muestras y luego re suspenda 100.000 células en 300 microlitros de PBS que contenga dos por ciento de suero bovino fetal.Luego, mida la expresión de EGFP mediante análisis citométrico de flujo. Recopile otras 0,5 a cinco millones de células transducidas para la preparación de ADN genómico y la posterior digestión con enzimas de restricción. Prepare cuatro digestiones con enzimas de restricción por muestra en tubos de 1,5 mililitros.Digiera de 0,1 a un microgramo de ADN-G en cada tubo. Añada 10 unidades de TRU91 y un microlitro de tampón M por muestra en un volumen final de 10 microlitros. Distribuya dos microlitros de la mezcla en los tubos de digestión.A continuación, incubar las reacciones a 65 grados celsius durante seis horas o durante la noche. Tras la incubación, añadir 40 microlitros de agua a un tubo de 1,5 mililitros. En el mismo tubo, añadir 10 unidades de PST1 y un microlitro de tampón H por muestra.Dispensar 10 microlitros de la mezcla de reacción de digestión en los tubos de digestión. Incubar las reacciones a 37 grados Celsius durante seis horas o durante la noche. Al día siguiente, preparar ocho reacciones de ligación de adaptadores en tubos de 1,5 mililitros.Para cada reacción, añada la mezcla de reacción de la ligasa a 10 microlitros de ADN genómico digerido. Incube a 16 grados Celsius durante tres a seis horas. Para la PCR de primera ronda, prepare 48 reacciones de PCR en tubos de 0,2 mililitros.Para cada PCR, agregue la mezcla de reacción que contiene el cebador puente y el cebador MLV3 prime LTR a dos microlitros de la reacción de ligación. Coloque las muestras en un termociclador con tapa calefactora. Establezca los parámetros de ciclado y realice la primera ronda de reacción PCR.Para la PCR de segunda ronda, prepare la mezcla de reacción que incluya el cebador anidado del enlazador y el cebador anidado del LTR 3' del MLV. Luego, agregue dos microlitros del producto de PCR de la primera ronda como molde. A continuación, ejecute la reacción de PCR de segunda ronda para generar los productos finales de PCR de LN.Después de la PCR de segundo ciclo, reúna las 48 reacciones de PCR anidada LM en un tubo de 15 mililitros. Luego agregue 20 microlitros de tampón de carga a 100 microlitros del producto de PCR LM agrupado y precipitado. Y cargue la muestra en un gel de agarosa al uno por ciento junto con la escalera de ADN de 100 pares de bases.Corra el gel a cinco voltios por centímetro durante 30 a 60 minutos una vez que las bandas estén resueltas; corte la porción del gel que contiene amplicones de entre 500 y 150 pares de bases. Después de purificar el producto de PCR de LM con un kit de extracción en columna basado en gel, mida la concentración mediante un espectrofotómetro UV antes de continuar con la preparación de la biblioteca. Asimismo, evalúe la longitud de los productos de PCR de LM utilizando un equipo bioanalizador según las instrucciones del fabricante.Prepare la biblioteca mediante la puesta a punto de una PCR de indexación. Para cada PCR, utilice de 150 a 170 nanogramos de producto de PCR de LM purificado, con una combinación de índices diferente para cada muestra. Realice la PCR en un termociclador con tapa calentada, como se indica.Después de la PCR, diluya la biblioteca purificada a 10 nanomolar con tris HCL 10 milimolar. A continuación, mezcle cinco microlitros del pool diluido con cinco microlitros de hidróxido de sodio 0,2 newtons en un nuevo tubo de 1,5 mililitro. Agite brevemente por vórtex, centrifugue y luego incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar las bibliotecas.Coloque los tubos del grupo desnaturalizado en hielo y 990 microlitros de tampón de hibridación HT1 previamente enfriado. Luego, retire 300 microlitros del grupo desnaturalizado y transfiéralos a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añada 300 microlitros de HT1 previamente enfriado para obtener un grupo final de biblioteca de diez picomoles.En paralelo, mezcle 10 nanomolares de biblioteca de control fija en un volumen de dos microlitros con 3 microlitros de tris HCl 10 milimolar en un tubo de 1,5 mililitros. Añada cinco microlitros de hidróxido de sodio 0,2 newtons y vortexee brevemente. Después de centrifugar, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la fijación diluida.Después de la incubación, coloque el tubo en hielo y agregue 990 microlitros de HT1 previamente enfriado. A continuación, retire alícuotas de 100 microlitros de fijador desnaturalizado en un tubo nuevo de 1,5 mililitros y agregue 300 microlitros de HT1 previamente enfriado para obtener una concentración final de 10 picomolares de fijador. Finalmente, en un tubo nuevo de 1,5 mililitros, mezcle 510 microlitros del grupo de bibliotecas desnaturalizadas con 90 microlitros de la biblioteca fija desnaturalizada, obteniendo así un grupo final de 10 picomolares con un 15 % de control de fijador para ser secuenciado.Esta imagen muestra el análisis de 3498, 2989 y 4103 agrupaciones de sitios recurrentes de integración del virus de la leucemia murina (MLV) en células progenitoras hematopoyéticas, progenitores eritroides y progenitores mieloides, respectivamente. En cada población celular, más del 95 % de las agrupaciones de MLV se superpusieron con potenciadores y promotores definidos epigenéticamente. Las regiones específicas de célula diana para MLV presentaron una alta acetilación y se asociaron con la expresión específica de la célula del gen diana.Los ejemplos incluyen el promotor del gen SPINK2 específico para HSP. La región reguladora del locus que contiene potentes potenciadores de los genes de globina beta-like específicos para eritroides. Los potenciadores ubicados aguas arriba del gen LYZ específico para NPP.Los ensayos de luciferasa confirmaron el subconjunto de potenciadores específicos de células dirigidos por MLV en EPP y MPP. Las regiones dirigidas por MLV específicas de eritroides mostraron una actividad mayor en EPP que en MPP y viceversa, lo que confirma que MLV identifica potenciadores específicos de células que posiblemente controlan la expresión de genes cercanos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una semana si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar maximizar la frecuencia de células transducidas para obtener una recuperación óptima de los sitios de integración. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mapear los sitios de integración virales ajustando primero el ADN genómico, luego ligando los fragmentos genómicos con un enlazador de ADN, seguido de la amplificación de la unión entre el genoma del huésped y el virus mediante PCR-ML y, finalmente, la secuenciación profunda de la biblioteca de amplicones.

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Retrovirus endógenos humanos (HERV), que ocupan 8% del genoma humano, conservan la capacidad de codificación de los escasos pero cien mil repeticiones terminales largas (LTRs). A Affymetrix microarray costumbre fue diseñado para identificar la expresión locus HERV individual y se utilizó en los tejidos de cáncer de próstata como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.

La identificación basada en microarrays de expresión individual HERV Loci: Aplicación al descubrimiento de biomarcadores en el cáncer de próstata

Lineal-amplificación mediada (LAM)-PCR es un método desarrollado para identificar las posiciones exactas de los vectores de integración viral en el genoma. La técnica ha evolucionado a ser el método superior para estudiar la dinámica clonales en los pacientes de terapia génica, la bioseguridad de las tecnologías de nuevo vector, la diversidad de células T, los modelos de células madre de cáncer, etc...

Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

La secuencia proviral individual completa (FLIPS) proporciona un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación de sola, cerca de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus de HIV-1 y permite la determinación de su potencial capacidad de replicación. FLIPS supera limitaciones de anteriores ensayos diseñados para secuenciar la reserva latente de VIH-1.

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Presentamos un flujo de trabajo de ingeniería de genoma por la generación de nuevos modelos in vitro para la infección por VIH-1 que recapitular integración proviral en sitios genómicos. Ataques contra reporteros derivados del VIH es facilitada por la manipulación del genoma mediada por Cas9 CRISPR, site-specific. Cuentan con protocolos detallados unicelular clon generación, detección y verificación dirigida a corregir.

Ingeniería de genoma CRISPR Cas9 basado en generar modelos de Jurkat reportero para infección por VIH-1 con los sitios seleccionados integración Proviral

Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

La mutagénesis insercional es una herramienta esencial en genética avanzada para identificar elementos genómicos funcionales. Aquí, describimos el Cribado basado en la inserción para elementos funcionales y transcripciones (InSET), un método para detectar sitios de integración de lentivirus dentro de una biblioteca de células de mutagénesis de inserción basada en lentivirus.

Identificación de sitios de integración de lentivirus funcionalmente relevantes en una biblioteca de células de mutagénesis insercional

Aprende a mapear sitios de integración de vectores retrovirales MLV en células humanas para identificar regiones reguladoras específicas. Este método optimiza estrategias de terapia génica mediante el análisis de promotores y potenciadores activos.

Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Explorar más videos