Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un ensayo sencillo, robusto y de alto rendimiento para el estiramiento de moléculas individuales mediante flujo, destinado al estudio del transporte de moléculas a lo largo del ADN. Esto se logra primero preparando ADN lambda marcado con biotina, mediante la ligación de un oligonucleótido marcado con biotina al ADN lambda. El segundo paso consiste en preparar cubreobjetos funcionalizados con polietilenglicol (PEG), siguiendo un protocolo de reacción en un solo paso.

A continuación, se construye una celda de flujo de alto rendimiento mediante la inserción de una cinta de doble cara con canales pre-cortados entre una cubreobjetos funcionalizada con PEG y un bloque de polidimetilsiloxano o PDMS que contiene orificios de entrada y salida. El último paso consiste en rastrear las trayectorias de moléculas fluorescentes individuales en el canal de flujo utilizando imágenes de fluorescencia de reflexión interna total, o TIRF, con lapso de tiempo. Para identificar las trayectorias de moléculas individuales que difunden a lo largo del ADN lambda estirado por el flujo, se utiliza un software personalizado confiable y eficiente de rastreo de partículas individuales para analizar las imágenes brutas de fluorescencia.

Las principales ventajas de esta configuración de ensayo frente a otras alternativas son la fiabilidad en la preparación de laminillas, una mayor capacidad de alto rendimiento, un tiempo reducido de manipulación para la preparación de muestras y un análisis de datos más simplificado y sin supervisión. El procedimiento será demostrado por un posdoctorado de mi laboratorio, el Dr. Kan Xiong. Antes de comenzar este ensayo, prepare todos los reactivos necesarios según se describe en el texto del protocolo.

Caliente el stock de ADN lambda de 0,5 miligramos por mililitro a 65 grados Celsius durante 60 segundos e introdúzcalo inmediatamente en hielo. Mezcle 100 microlitros de la solución de ADN lambda con dos microlitros de oligonucleótido marcado con biotina de 10 micromolar en un tubo de microcentrifugadora. Somete la mezcla a 65 grados Celsius durante 60 segundos y luego enfríe lentamente hasta temperatura ambiente.

Coloque la mezcla en hielo. Añada 11 microlitros de tampón de reacción de la ligasa T4 ADN y mezcle suavemente. Luego, añada dos microlitros equivalentes a 800 unidades de ligasa T4 ADN y mezcle suavemente.

Incube la mezcla durante dos horas a 16 grados Celsius o durante la noche a cuatro grados Celsius. Purifique el producto utilizando tubos de filtro centrífugo con un límite nominal de peso molecular de 100 kilodaltons. Sometan los portaobjetos número uno a ultrasonido en etanol al 95 % dentro de un frasco de tinción durante 10 minutos y luego enjuáguelos tres veces con agua ultrapura.

Llene el frasco de tinción con hidróxido de potasio un molar, someta de nuevo a ultrasonido durante 10 minutos y luego enjuague tres veces con agua ultrapura. Repita este ciclo dos veces. Seque las laminillas bajo un flujo de gas nitrógeno seco y limpio.

Limpie y seque aún más los cubreobjetos realizando un tratamiento con plasma de aire a una presión de 900 militorr durante cinco minutos. Incube los cubreobjetos con 50 microlitros de silano-polietilenglicol-biotina al 25 miligramos por mililitro disuelto en etanol al 95 % a temperatura ambiente durante dos horas. Lave el exceso de polietilenglicol con agua ultrapura y seque los cubreobjetos recubiertos con polietilenglicol bajo un flujo de gas nitrógeno seco y limpio.

Diseñe canales de flujo utilizando software CAD y corte los canales en una cinta de doble cara usando una cortadora de cintas. Retire los residuos de cinta dentro de los canales. Para fabricar placas de PDMS, mezcle completamente 45 gramos de PDMS con cinco gramos de reactivo entrecruzante utilizando un mezclador.

Vierta la mezcla en dos placas de Petri de 100 milímetros y coloque las placas dentro de una cámara de vacío durante aproximadamente 30 minutos hasta que desaparezcan todas las burbujas de aire. Deje las placas dentro de un horno a 80 grados Celsius durante aproximadamente dos horas hasta que el PDMS se solidifique. Corte un bloque de PDMS que coincida con el tamaño de la cinta de doble cara con canales pre-cortados.

Retire una película protectora de la cinta de doble cara y adhiera a un lado plano del bloque de PDMS. Perfore orificios de salida y entrada en el bloque de PDMS utilizando un punzón de biopsia con una aguja de calibre 23. Retire la otra película protectora de la cinta de doble cara y adhiera a la superficie funcionalizada del cubreobjetos.

Fije la celda de flujo ensamblada en un inserto del portaobjetos del microscopio. Cargue todos los reactivos previamente desgasificados en los depósitos que tengan un tubo de Tygon conectado a una válvula solenoide y otro tubo conectado a un tubo de PEEK que evitará el retroceso de los reactivos. El flujo de los reactivos está controlado por válvulas solenoides que a su vez son controladas por una aplicación de programación por script.

Primee un canal de flujo haciendo pasar un tampón en blanco. Inserte otros tres tubos de PEEK en los orificios de entrada. Tenga cuidado de no inducir la formación de burbujas de aire dentro del canal.

Conecte un tubo de Tygon con un tubo corto de PEEK desde el orificio de salida hasta un recipiente de desecho de muestra. Pase una solución de estreptavidina a 0,2 miligramos por mililitro e incube durante cinco minutos. A continuación, pase tampón sin analito para eliminar la estreptavidina no unida.

Fluya una solución de albúmina sérica bovina a un miligramo por mililitro e incube durante un minuto. Luego, fluya tampón sin analito para eliminar la albúmina sérica bovina no unida. Fluya una solución de ADN lambda biotinilado a 100 picomolares e incube durante 10 minutos.

Luego, haga fluir tampón sin aditivos para lavar el ADN lambda no unido. Para verificar la calidad del cubreobjetos funcionalizado con PEG, introduzca un colorante fluorescente para ADN, como el colorante SYTOX Orange, e inicie la adquisición de imágenes de fluorescencia. Si la calidad del cubreobjetos es buena, la densidad de los ADN lambda estirados por flujo será alta.

Asimismo, ajuste el ángulo de fluorescencia inducida por reflexión interna total (TIRF) para lograr la mayor relación señal-ruido en imágenes de ADN lambda casi completamente estirado por flujo. Para rastrear las trayectorias de moléculas individuales, inicie las incubaciones dentro de un canal nuevo, luego introduzca moléculas marcadas con fluoróforo en subnanomolar mediante una bomba de jeringa a una velocidad de flujo suficientemente alta y capture imágenes de fluorescencia con intervalos de tiempo a una frecuencia de cuadro de 100 hercios. Habitualmente se adquieren 10.000 cuadros en un campo de visión, y se obtienen películas de múltiples campos de visión.

Al final, haga fluir nuevamente el colorante para tinción de ADN para confirmar que los ADN aún pueden estirarse mediante flujo. Se utilizará un software personalizado de seguimiento de partículas individuales para identificar las trayectorias de moléculas individuales que difunden a lo largo del ADN. El software determinará primero las posiciones del centroide de las partículas individuales con alta precisión.

Elimine las partículas que están adheridas a la superficie del cubreobjetos y luego vincule las partículas en diferentes cuadros para formar trayectorias de lapse de tiempo. A partir de estas trayectorias, se estimarán las constantes de difusión en 1D. Para comenzar el análisis de datos, abra una aplicación de programación de scripts y vaya al directorio del software de seguimiento de partículas individuales.

Abra un script llamado largedataprocess3.m. Un parámetro importante que debe definirse es el valor umbral para la detección de partículas individuales. Para determinar el valor umbral óptimo, ejecute determine_threshold_value.

script. Este script visualizará cómo el valor umbral afecta la detección de partículas individuales. Después de determinar el valor umbral óptimo, ejecute el largedataprocess3.

script. Después de completar el análisis de seguimiento de partículas individuales, las trayectorias crudas se filtrarán ejecutando el script trajectory_filtering.m.

Se construye una interfaz gráfica de usuario o GUI para visualizar el paso de filtrado. En el panel de la GUI, establezca el desplazamiento mínimo a lo largo del ADN, MinXDisp, en dos píxeles. Establezca el desplazamiento máximo transversal al ADN, MaxYDisp, en dos píxeles.

Establezca el número mínimo de cuadros, minFrames, en 10. Establezca el número mínimo de estados del trímero, minTriplets, en 10. Establezca la constante de difusión mínima a lo largo del ADN, D_par, en cero.

Establezca la constante máxima de difusión estimada transversal al ADN, D_trans, en 10 megabases al cuadrado por segundo. Establezca el parámetro estadístico mínimo, Chi2 Stat, en menos cinco. Establezca la relación mínima de desplazamiento a lo largo del ADN respecto al desplazamiento transversal al ADN, MinX/Y, en dos.

Todas las trayectorias crudas que cumplan con estos parámetros de filtrado se enumerarán en la tabla uno y aquellas que no los cumplan se enumerarán en la tabla tres. Haga clic en un número de trayectoria en la tabla uno. La trayectoria se mostrará en los gráficos uno y dos.

Haga clic en el botón de reproducción para ver las imágenes de fluorescencia en bruto. Haga clic en agregar a la tabla2 si esta trayectoria es una trayectoria de deslizamiento de una sola molécula. Al final, todas las trayectorias agregadas a la tabla2 se guardarán al cerrar la interfaz gráfica de usuario (GUI).

Las trayectorias que han superado todos los pasos de filtrado se agrupan conjuntamente, a partir de las cuales se estimará la constante media de difusión. Para calcular las constantes medias de difusión, simplemente ejecute el script calculate_mean_diffusion_constant.m. Este procedimiento beneficiará a muchas personas que estudian la biofísica de moléculas individuales in vitro.