Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

El objetivo general de este procedimiento es construir un ensayo de estiramiento de flujo de molécula única simple, robusto y de alto rendimiento para estudiar el transporte de moléculas a lo largo del ADN. Esto se logra preparando primero el ADN lambda marcado con biotina mediante la ligadura de un oligo marcado con biotina al ADN lambda. El segundo paso es preparar cubreobjetos funcionalizados de polietilenglicol o PEG siguiendo un protocolo de reacción de un solo paso.

A continuación, se construye una celda de flujo de alto rendimiento intercalando una cinta de doble cara con canales precortados entre un cubreobjetos funcionalizado con PEG y una losa de polidimetilsiloxano o PDMS que contiene orificios de entrada y salida. El paso final es realizar un seguimiento de las trayectorias de las moléculas fluorescentes individuales en el canal de flujo mediante el uso de imágenes de fluorescencia de reflexión interna total de lapso de tiempo o TIRF. Para identificar las trayectorias de moléculas individuales que se difunden a lo largo del flujo de ADN lambda estirado, se utiliza un software de seguimiento de partículas individuales personalizado confiable y eficiente para analizar imágenes de fluorescencia sin procesar.

Las principales ventajas de esta configuración de ensayo sobre las alternativas son la fiabilidad de la preparación del cubreobjetos, la mayor capacidad de rendimiento, la reducción del tiempo de manipulación para la preparación de muestras y un análisis de datos no supervisado más optimizado. La demostración del procedimiento será realizada por un post-doctorado en mi laboratorio, el Dr. Kan Xiong. Antes de comenzar este ensayo, prepare todos los reactivos necesarios como se describe en el texto del protocolo.

Caliente 0,5 miligramos por mililitro de caldo de ADN lambda a 65 grados centígrados durante 60 segundos y sumérjalo en hielo húmedo de inmediato. Mezcle 100 microlitros de la solución de ADN lambda con dos microlitros de oligonucleótidos marcados con biotina de 10 micromolares dentro de un tubo de microcentrífuga. Caliente la mezcla a 65 grados centígrados durante 60 segundos y luego enfríe lentamente a temperatura ambiente.

Coloca la mezcla sobre hielo. Agregue 11 microlitros de tampón de reacción de ADN ligasa T4 y mezcle suavemente. A continuación, dos microlitros equivalentes a 800 unidades de ADN ligasa T4 y mezclar suavemente.

Incubar la mezcla durante dos horas a 16 grados centígrados o toda la noche a cuatro grados centígrados. Purificar el producto mediante el uso de tubos de filtro centrífugo con un límite de peso molecular nominal de 100 kilodaltons. El sonicato número uno cubre las barbitas en etanol al 95% dentro de un frasco de tinción durante 10 minutos y luego enjuague con agua ultrapura tres veces.

Llene el frasco de tinción con un molar de hidróxido de potasio, vuelva a sonicular durante 10 minutos y luego enjuague con agua ultrapura tres veces. Repite este ciclo dos veces. Seque los cubreobjetos bajo un flujo de gas nitrógeno limpio y seco.

Limpie y seque aún más los cubreobjetos mediante un tratamiento de plasma de aire a una presión de 900 militorr durante cinco minutos. Incubar cubreobjetos con 50 microlitros de 25 miligramos por mililitro de silano-polietilenglicol-biotina disueltos en etanol al 95% a temperatura ambiente durante dos horas. Lave el exceso de polietilenglicol con agua ultrapura y seque los cubreobjetos recubiertos de polietilenglicol bajo un flujo de gas nitrógeno limpio y seco.

Diseñe los canales de flujo con software CAD y corte los canales en una cinta adhesiva de doble cara con un cortador de cinta. Retire los residuos de cinta dentro de los canales. Para hacer losas de PDMS, mezcle bien 45 gramos de PDMS con cinco gramos de reactivo de reticulación usando un mezclador.

Vierta la mezcla en dos placas de Petri de 100 milímetros y deje las placas dentro de una cámara de vacío durante unos 30 minutos hasta que desaparezcan todas las burbujas de aire. Deje los platos dentro de un horno a 80 grados centígrados durante unas dos horas hasta que el PDMS se solidifique. Corte una losa de PDMS que coincida con el tamaño de la cinta adhesiva de doble cara con canales precortados.

Despegue una película protectora de la cinta adhesiva de doble cara y adhiérala a un lado plano de la losa PDMS. Perfore los orificios de salida y entrada en la losa de PDMS mediante el uso de un perforador de orificios de biopsia con una aguja de calibre 23. Despegue la otra película protectora de la cinta adhesiva de doble cara y adhiérala a la superficie funcionalizada del cubreobjetos.

Fije la celda de flujo ensamblada en un inserto de platina de microscopio. Cargue todos los reactivos predesgasificados en depósitos que tengan un tubo Tygon conectado a una válvula solenoide y otro tubo conectado a un tubo de PEEK que evitará el reflujo de los reactivos. El flujo de reactivos está controlado por válvulas solenoides que son controladas por una aplicación de programación de scripts.

Cebe un canal de flujo fluyendo en un tampón en blanco. Inserte otros tres tubos de PEEK en los orificios de entrada. Tenga cuidado de no inducir la formación de burbujas de aire dentro del canal.

Conecte un tubo Tygon con un tubo corto de PEEK desde el orificio de salida hasta un contenedor de residuos de muestra. Fluya en 0,2 miligramos por mililitro de solución de estreptavidina e incube durante cinco minutos. A continuación, fluya en un tampón en blanco para lavar la estreptavidina no unida.

Fluir en una solución de albúmina sérica bovina de miligramos por mililitro e incubar durante un minuto. A continuación, fluya en tampón en blanco para lavar la albúmina sérica bovina no unida. Fluir en 100 picomolares de biotina-lambda-solución de ADN e incubar durante 10 minutos.

A continuación, fluya en un tampón en blanco para lavar los ADN lambda no unidos. Para verificar la calidad del cubreobjetos funcionalizado PEG, agregue un tinte de tinción de ADN, como el tinte SYTOX Orange, e inicie la obtención de imágenes de fluorescencia. Si la calidad del cubreobjetos es buena, la densidad de ADNs lambda estirados por el flujo será alta.

Además, ajuste el ángulo TIRF para lograr la relación señal-ruido más alta de imágenes de ADN-lambda estirados casi por completo. Para rastrear las trayectorias de moléculas individuales, inicie las incubaciones dentro de un nuevo canal y luego fusione moléculas marcadas con fluoróforos subnanomolares a una velocidad de flujo lo suficientemente alta mediante el uso de una bomba de jeringa y recopile imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo con una velocidad de fotogramas de 100 hercios. Normalmente, se recopilan 10.000 fotogramas en un campo de visión y películas de varios campos de visión.

Al final, vuelva a fluir en el tinte de tinción de ADN para confirmar que el ADN aún se puede estirar. Se utilizará un software personalizado de seguimiento de una sola partícula para identificar las trayectorias de las moléculas individuales que se difunden a lo largo del ADN. El software primero determinará las posiciones de los centroides de partículas individuales con alta precisión.

Elimine las partículas que estén atascadas en la superficie del cubreobjetos y, a continuación, vincule las partículas en diferentes fotogramas para formar trayectorias de lapso de tiempo. A partir de estas trayectorias, se estimarán las constantes de difusión 1D. Para iniciar el análisis de datos, abra una aplicación de programación de scripts y vaya al directorio del software de seguimiento de partículas individuales.

Abra un script denominado largedataprocess3.m. Un parámetro importante que debe definirse es el valor umbral para la detección de partículas individuales. Para determinar el valor de umbral óptimo, ejecute el determine_threshold_value.

M guión. Este script visualizará cómo el valor umbral afecta a la detección de una sola partícula. Después de determinar el valor de umbral óptimo, ejecute largedataprocess3.

M guión. Una vez completado el análisis de seguimiento de una sola partícula, las trayectorias sin procesar se filtrarán ejecutando el trajectory_filtering. M guión.

Se crea una interfaz gráfica de usuario o GUI para visualizar el paso de filtrado. En el panel GUI, establezca el desplazamiento mínimo a lo largo del ADN, MinXDisp, en dos píxeles. Establezca el desplazamiento transversal máximo en ADN, MaxYDisp, a dos píxeles.

Establezca el número mínimo de fotogramas, minFrames, en 10. Establezca el número mínimo de estados de triplet, minTriplets, en 10. Establezca la constante de difusión mínima a lo largo del ADN, D_par a cero.

Establezca la constante de difusión transversal estimada máxima estimada en ADN, D_trans, a 10 mega pares de bases al cuadrado por segundo. Establezca el parámetro estadístico mínimo, Chi2 Stat, en menos cinco. Establezca la relación mínima de desplazamiento a lo largo del ADN a lo transversal al ADN, MinX/Y, a dos.

Todas las trayectorias sin procesar que pasen estos parámetros de filtrado se enumerarán en la tabla uno y las que no lo hagan se enumerarán en la tabla tres. Haga clic en un número de trayectoria en la tabla uno. La trayectoria se mostrará en los gráficos uno y dos.

Haga clic en el botón de reproducción para reproducir las imágenes de fluorescencia sin procesar. Haga clic en agregar a la tabla2 si esta trayectoria es una trayectoria de deslizamiento de una sola molécula. Al final, todas las trayectorias añadidas a la tabla2 se guardarán al cerrar la GUI.

Las trayectorias que han pasado todos los pasos de filtrado se agrupan a partir de las cuales se estimará la constante de difusión media. Para calcular las constantes de difusión media, simplemente ejecute el script calculate_mean_diffusion_constant.m. Este procedimiento beneficiará a muchas personas que estudian biofísica de moléculas individuales in vitro.