Name: Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a caracterizar interacciones de plegamiento y unión biomolecular mediante calorimetría diferencial de barrido con ligandos termolábiles. Este método permite extraer parámetros termodinámicos rápidamente para avanzar en biocalorimetría y diseño de fármacos.

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R. W. H. V fue apoyado por el programa de formación ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) en Bionanomachines y Ciencias naturales de McGill. A. K. M. y P. E. J. fueron apoyados por donaciones NSERC 327028-09 (A. K. M) y 238562 (P. E. J.).

1. preparación de la muestra
<ol><li>Purificar la biomolécula deseado13. Nota: Este protocolo usa comprados cocaína vinculante ADN aptámeros MN4 después de intercambiar contra 2 NaCl M tres veces seguido por tres rondas de agua desionizada utilizando un filtro centrífugo con una membrana de corte de peso molecular de 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizar y purificar o comprar la deseada ligando termolábiles13. Nota: MN4 se une la cocaína ligando termolábiles. MN4 también se une a la quinina, que se utiliza como un control negativo para thermolability ligando a estas temperaturas experimentales.</li>
	<li>Preparación de buffers para diálisis de la biomolécula purificada y la disolución de los ligandos (20 mM de fosfato de sodio y 140 mM de tampón NaCl, pH 7,4, MN4 y los ligandos utilizados aquí).</li>
	<li>Dializan biomoléculas contra al menos 2 L de tampón utilizando tubos de diálisis con 0,5 - 1,0 kDa corte.</li>
	<li>Filtrar el búfer final (denominado buffer de trabajo) a través de un filtro de 0.2 μm que ha sido cuidadosamente equilibrado con tampón.</li>
	<li>Pesar las masas deseadas de los ligandos y disolver en buffer de trabajo filtrada. Si las concentraciones de ligando deseado requieren masas que son demasiado pequeñas para pesar exactamente, hacer una solución madre concentrada ligando (10 x por ejemplo). Nota: Es fundamental que todos los experimentos de DSC utilizan el mismo buffer de trabajo para la muestra y ligando, es decir, nunca realice un experimento donde el ligando se disuelve en un lote diferente de tampón de trabajo que las biomoléculas ya que esto causará buffer artefactos de desajuste en los datos.</li>
	<li>Filtrar la solución stock de biomoléculas a través de un filtro de 0.2 μm que ha sido cuidadosamente equilibrado con tampón de trabajo.</li>
	<li>Determinar la concentración de biomoléculas por medidas de absorbancia (260 nm por ácidos nucleicos como el MN4 y 280 nm para las proteínas).</li>
	<li>Guarde las biomoléculas preparado y ligando en un refrigerador de 4 ° C (apto para MN4 y los ligandos utilizados aquí), o -20 o -80 ° C si la biomolécula y ligandos soportar almacenamiento de congelación y a largo plazo se requiere. Degas las soluciones tampón, biomoléculas y ligando en una mesa degasser (véase Tabla de materiales) antes de cargar el DSC. Nota: Desgasificación ayuda a prevenir la formación de burbujas en el DSC en temperaturas más altas. Las burbujas causan artefactos de señal que las líneas de base y formas de pico de DSC.</li>
</ol>2. preparación de DSC
<ol><li>Desenrosque el mango de presión de la DSC (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Ejecutar tubos de silicio desde el buffer de trabajo y fije la brida delantera (abertura de metal) de los capilares de la referencia.</li>
	<li>Crear un puente entre los capilares mediante la conexión de la brida posterior referencia a la brida frontal muestra y muestra.</li>
	<li>Coloque un pedazo de tubo de silicon en la brida posterior muestra que va a un frasco de residuos con una línea de vacío conectada.</li>
	<li>Abra la línea de vacío para eliminar el DSC con 200 mL de buffer de trabajo.</li>
	<li>Cargar el capilar de la referencia del DSC con buffer de trabajo. Coloque aproximadamente secciones 3-5 cm de tubo de silicon en las pestañas capilar de referencia.</li>
	<li>Inserte una pipeta de 1 mL en tubos de silicona de la brida posterior. Dibujar 0,8 mL de tampón de trabajo con una pipeta e inserte la punta de la pipeta con el tampón en tubo de silicio de la brida frontal referencia.</li>
	<li>Presione suavemente el émbolo de la pipeta hasta pasar el buffer de trabajo a través del tubo frontal del silicio en el capilar de referencia y hacia la brida posterior unida una punta de pipeta. Presione el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del buffer de trabajo alcanza apenas sobre el tubo de silicona frontal, luego suelte el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del buffer de trabajo alcanza apenas sobre el tubo de silicona trasera.<ol>
<li>Repita el paso el buffer de trabajo hacia adelante y hacia atrás para purgar el volumen en el capilar de referencia de burbujas. Nota: Generalmente, 10 pasos de la solución hacia adelante y hacia atrás son suficientes para eliminar cualquier burbuja.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La tapa la punta trasera con el pulgar y tire suavemente hacia arriba en la punta trasera y delantera pipeta para sacarlos de las pestañas de referencia con el tubo de silicona Unido.</li>
	<li>Cargar el capilar de muestras con tampón de trabajo como en los pasos de 2.6-2.9. Coloque un tapón de plástico negro en la referencia posterior y rebordes, dejando las pestañas frente descubiertas de la muestra.</li>
	<li>Coloque la manija de presión.</li>
	<li>Abra el software de DSC (véase Tabla de materiales) y Presurice el instrumento haciendo clic en el rojo encima de la flecha en la parte superior de la interfaz una vez que la lectura de la energía se ha estabilizado; el poder de la DSC se indica en un cuadro en la parte superior derecha de la interfaz junto con la temperatura del instrumento y lectura de la presión. Nota: Monitor que el poder de la lectura como el DSC se presuriza. Cambios en la alimentación de más de ~ 10 μW indican la formación de burbujas en los tubos capilares, que pueden causar artefactos en los datos. Las soluciones deben ser quitadas y desgasificadas más antes de continuar.</li>
	<li>Equilibre la DSC con tampón de trabajo mediante la realización de una exploración hacia adelante y hacia atrás. En la pestaña "Método Experimental" en el lado izquierdo de la pantalla, asegúrese de que está seleccionada la opción "Exploración" para ejecutar el DSC de temperatura modo de exploración. Nota: Parámetros experimentales son la temperatura, gama, velocidad de lectura, tiempo de equilibrado de baja y alta temperatura y número de análisis de la exploración.<ol>
<li>En el recuadro de "Parámetros de temperatura" en la pestaña "Método Experimental", haga clic en el botón para "Calentar". Entre 1 a 100 ° C para las temperaturas experimentales superiores e inferiores, 1 ° C/min para la frecuencia de barrido y 60 s para el período de equilibrio.</li>
		<li>Haga clic en el botón "Añadir Series" bajo el campo de entrada para el período de equilibrio. Introduzca 2 en el campo "Los pasos para agregar" en la ventana emergente (para una calefacción y una refrigeración exploración) y marque la casilla de "calefacción/refrigeración alternativa". Haga clic en "Aceptar"; el análisis agregados aparecen en la parte inferior de la interfaz. Compruebe que los parámetros para cada análisis como deseado.</li>
		<li>Iniciar el experimento haciendo clic en el botón verde de "play" en la parte superior de la interfaz. Desplácese hasta la carpeta deseada e introduzca un nombre de archivo para guardar el experimento en la ventana emergente. Ver el progreso del experimento haciendo clic en la ficha "Datos" a la derecha de la pestaña "Método de experimento".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. recoger datos de DSC ligando termolábil
Nota: El procedimiento mínimo consiste en cinco experimentos: experimentos de referencia con y sin ligand del almacenador intermediario (utilizado para la sustracción de la línea de base, ver discusión), experimentos con las biomoléculas gratis, la biomolécula ligando enlazado, la muestra y el biomoléculas de ligando enlazado con un largo periodo de equilibrado de alta temperatura.
<ol><li>Ejecutar experimentos de referencia para restar en base de los datos de ejemplo. Recargar la DSC con tampón de trabajo en ambos tubos capilares y recoger múltiples exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás sobre un rango de temperatura adecuado en 1 ° C min-1 , con una parte superior (alta temperatura) tiempo de equilibrado de 120 s.<ol>
<li>Eliminar los anteriores buffer equilibrado análisis de la parte inferior de la interfaz destacando cada uno individualmente y haciendo clic en la X roja a la mitad derecha de la interfaz. Clic en el botón "Añadir Series", escriba 20 en el campo para "Pasos para añadir" y marcar la casilla de "calefacción/refrigeración alternativa" para agregar las nuevas exploraciones. Haga clic en aceptar y ejecutar el experimento haciendo clic en el botón de play verde que el anterior.</li>
		<li>Repita los pasos 3.1 - 3.1.1 con tampón de trabajo con la concentración de ligando en ambos vasos capilares para obtener la referencia de experimentos para el ligando (recoger dos experimentos separados 120 s y 600 s alta temperatura equilibrado veces respectivamente, para ser utilizado en la adquisición de la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles). Nota: El tipo de análisis utilizado aquí garantiza que las biomoléculas en posteriores experimentos en equilibrio térmico en las exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás (ver discusión). Analizar las tasas < 0.1-0.2 ° C min-1 conducen a termogramas ruidosos y no son aplicables en los experimentos de DSC. Las temperaturas deben extenderse desde bien abajo la temperatura de fusión de la biomolécula gratis a muy superior a la temperatura de fusión de biomoléculas saturado de ligando (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar la reproducibilidad de los análisis (por ejemplo, 10 adelante y exploraciones inversas 10 20 total es suficiente).</li>
		<li>Si utiliza múltiples ligandos (como la cocaína y quinina), enjuague la DSC con 200 mL de tampón de trabajo (repetición del paso 2.5) entre tramos para quitar el ligando de los capilares y evitar la contaminación cruzada. Nota: Es útil realizar un experimento de replicación en la biomolécula libre después de una carrera de ligando enlazado para comprobar si el ligando anterior adsorbe fuertemente a las paredes capilares y no se elimina adecuadamente con tampón de lavado. Si los termogramas de las biomoléculas libre parecen ser cambiado de puesto a una magnitud mayor y una temperatura de desnaturalización después de experimentar el límite de ligando, es probable que el ligando anterior todavía está presente en el calorímetro después del lavado. Quitar el ligando adsorbido por incubación de los tubos capilares con un 20% Contrad 70 por 1 h a 60 ° C con presión asa de los tapones de plástico. En el software de DSC, cambiar el modo experimental a "Isotérmica" en la ficha método Experimental elegir 3.600 s de duración y 60 ° C para la temperatura ambiente, con cero en el tiempo de equilibrado. Haga clic en "Añadir al método Experimental". El experimento isotermo aparece en la parte inferior de la pantalla. Después de la terminación, lave el instrumento con agua 2 L desionizada y repita desde el paso 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar experimentos de muestra utilizando la misma DSC carga procedimiento y parámetros experimentales como la referencia de análisis. Para el conjunto de datos libre de biomoléculas, asegúrese de que el capilar de referencia contiene el buffer de trabajo mientras que el capilar de la muestra contiene la biomolécula libre en la concentración deseada en buffer de trabajo.<ol>
<li>Para los experimentos de ligando enlazado, asegúrese de que el ligando se encuentra en el buffer de trabajo en el capilar de referencia y la biomolécula más ligando es en buffer de trabajo en el capilar de la muestra. Limpie el sistema entre adiciones de diferentes ligandos como en el paso 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar un experimento adicional con las biomoléculas ligada al ligando termolábil donde el período de equilibrio de alta temperatura se aumenta a 600 s y todos los otros parámetros experimentales son las mismas que paso 3.2.1. Nota: La duración del periodo de equilibrado de alta temperatura para el experimento segundo ligando enlazado es elegida simplemente para asegurarse de que el ligando es agotado más rápidamente que el experimento de equilibrio corto tiempo. Si los picos ligando enlazado desde el primero experimentan decaimiento lentamente en función del número de análisis (por ejemplo, las diferencias en maxima pico sucesivas son ≤ 0,5 ° C), aumenta de 10 a 20 veces en el periodo de equilibrado de alta temperatura a fin de estimar adecuadamente agotan el ligando durante el segundo experimento. El cálculo exacto de la constante de velocidad para la conversión de ligando requiere que el segundo experimento tiene agotamiento más rápido de ligando con respecto a la primera. Las concentraciones de ligando extraídas del análisis global de los dos experimentos serán similares y por lo tanto inutilizable si el agotamiento del ligando no se acelera suficientemente en el segundo experimento.</li>
</ol>4. procesamiento de datos
<ol><li>Abierto el DSC experimentar archivos en el software de análisis de datos de DSC (véase Tabla de materiales) y exportar los datos de potencia bruta como hojas de cálculo.</li>
	<li>Importar las hojas de cálculo que contiene los datos de potencia en software para ajuste de datos.</li>
	<li>Línea de base restar los datos de la muestra restando los datos de la potencia de búfer y ligando enlazado biomoléculas experimentos. Nota: Para el experimento de ligando termolábiles, la concentración de ligando inicial disminuye con cada barrido. Por lo tanto, es ideal para restar la exploración búfer 1 del análisis de la muestra 1 y así sucesivamente. Hemos encontrado que las exploraciones de búfer con la cocaína no cambian apreciablemente como procede de la conversión de ligando y por lo tanto, una exploración de búfer ligando termolábil solo puede utilizarse para restar todos los datos de ligando enlazado termolábiles.</li>
	<li>Convertir los datos de potencia muestra resta base para capacidad de calor. Nota: La conversión requiere volumen específico parcial de biomoléculas, que puede ser unos14,15,16. La ecuación para la conversión de energía a la capacidad de calor ha sido descrito previamente17.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>A nivel mundial ajuste equilibrado corto tiempo termolábiles ligando enlazado calor capacidad dataset con un conjunto único de base, la concentración de ligando, plegable y ligando vinculante parámetros tal como se describe anteriormente4.</li>
	<li>Repita el que ajuste global del conjunto de datos de tiempo de mucho equilibrio para calcular la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles como se describió anteriormente4.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Modificaciones y la resolución de problemas
El información de los análisis de montaje global utilizado en la figura 1 y figura 2 ha sido descrito previamente4. Aquí, describimos aspectos prácticos de la realización y análisis de experimentos de unión de DSC con ligandos termolábiles. Tenga en cuenta que una base de DSC obtenidos para el ligando termolábil solo se resta del ligando + conjunto de ...

Calorimetría diferencial (barrido DSC) es un método eficaz para la cuantificación biomolecular vinculante y plegable interacciones1,2,3. Los puntos fuertes de DSC incluyen su capacidad para aclarar vinculantes y mecanismos de plegamiento y rendir los correspondientes parámetros termodinámicos2,3. Además, DSC puede realizarse en solución bajo condiciones fisiológicas cerca y no requiere de etiquetado de la biomolécula o ligando, por ejemplo, con fluoróforos, etiquetas de spin o isótopos nucleares4. El instrumento escanea en temperatura, midiendo la cantidad de calor necesaria para desnaturalizar las biomoléculas en presencia y en ausencia de ligando. Los termogramas resultantes se utilizan para extraer los parámetros termodinámicos que gobiernan el ligando vinculante y procesos de plegamiento. La información proporcionada por DSC u otras técnicas termodinámicas es fundamental para orientar el diseño de fármacos dirigidos a biomoléculas1,5,6,7,8. Sin embargo, la exploración repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) puede ser problemático. Por ejemplo, muchos compuestos farmacéuticamente importantes someterse a cambio o descomposición sobre la exposición sostenida a altas temperaturas9,10,11, es decir, que son termolábiles. Examen de enlace las interacciones por DSC normalmente requiere múltiples exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás con el fin de verificar la reproducibilidad de la termografía para el análisis termodinámico12. Conversión térmica de un ligando inicial a una forma secundaria con características de atascamiento alterado conduce a pronunciadas diferencias en la forma y posición de los termogramas sucesivas, puesto que la concentración del ligando inicial disminuye con cada barrido mientras que la se acumulan productos de conversión térmica. Estos conjuntos de datos no son susceptibles de análisis tradicionales.
Recientemente hemos desarrollado un método de ajuste global para datasets termolábiles ligando DSC que el conjunto completo de parámetros termodinámicos que gobiernan el plegamiento de biomolecular y vinculante de las interacciones de un solo experimento ligando enlazado hace referenciada a la Termograma de necesarias para el libre biomoléculas4. El análisis reduce el tiempo experimental y la muestra necesaria por ~ 10 veces en comparación con métodos estándar de DSC. Hemos representaron para ligando conversión térmica asumiendo esto sucede durante la parte de alta temperatura de cada exploración donde el termograma no depende de la concentración de ligando. Por lo tanto, la concentración de ligando es una constante dentro de la porción del termograma que se utiliza para extraer parámetros termodinámicos. Además demostramos cómo puede obtenerse la constante de velocidad para la conversión térmica ligando mediante la realización de un experimento complementario con un largo periodo de equilibrado de alta temperatura. Para sistemas donde la conversión termal ligando es menos dependiente de la temperatura (es decir, que ocurre apreciable en todas las temperaturas), el análisis puede ser modificado para incluir las concentraciones de ligando variable. Aquí demostramos este procedimiento para el aptámero de ADN MN4 en presencia de la cocaína ligando termolábiles, que rápidamente se convierte en benzoylecgonine a altas temperaturas (> 60 ° C). La quinina se utiliza como un control negativo para thermolability ligando ya que no sufre conversión a estas temperaturas experimentales y también se une a MN4. Describimos la adquisición de ligando termolábiles DSC conjuntos de datos y su análisis, obtención de parámetros termodinámicos y cinéticos de la plegable, vinculante y ligando procesos de conversión.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Agua desyoinizada para biología molecular</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>filtros de jeringa estériles de 0,2 micras</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos de 3 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis Corte de 0,5-1,0 kDa</td> Tubos de silicona <td>de Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de brida DSC de plástico</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>Aptámero de ADN MN4</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>Microcalorímetro NanoDSC-III</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software NanoAnalyze</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de perfiles biomolecular dsc con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Calorimetría diferencial (barrido DSC) es una técnica poderosa para la cuantificación de parámetros termodinámicos que rigen biomolecular plegable y las interacciones de los Unión. Esta información es fundamental en el diseño de nuevos compuestos farmacéuticos. Sin embargo, muchos ligandos farmacéuticamente relevantes son químicamente inestables a las altas temperaturas utilizadas en análisis de DSC. Así, las interacciones de los Unión de medición es difícil porque las concentraciones de ligandos y convierte térmicamente los productos cambian constantemente dentro de la célula del calorímetro. Aquí, presentamos un protocolo usando ligandos termolábiles y DSC para obtener rápidamente información termodinámica y cinética de plegamiento, vinculante y ligando procesos de conversión. Hemos aplicado el método al aptámero de ADN MN4 que se une a la cocaína ligando termolábiles. Usando un nuevo análisis del ajuste global que tenga en cuenta para la conversión de ligando termolábiles, el conjunto completo de parámetros vinculantes y plegable se obtienen de un par de experimentos de DSC. Además, nos muestran que la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles puede obtenerse con sólo un conjunto de datos complementario de DSC. Se presentan las directrices para la identificación y análisis de datos de varios escenarios más complicados, incluyendo la agregación irreversible de la biomolécula, plegamiento lento, enlace lento y rápido agotamiento del ligand termolábil.

Datos representativos para el DSC ligando termolábiles se muestran en la figura 1. La posición y altura del pico ligando enlazado termolábil sucesivamente cambios hacia la de las biomoléculas como el ligando termolábil se agota con cada exploración (Figura 1a). El perfil de desnaturalización libre se utiliza como referencia para el punto final de conversión ligando termolábiles (Figura 1b). Datos de ...

Presentamos un protocolo para la caracterización rápida de biomolecular plegado y encuadernación interacciones con ligandos termolábiles utilizando calorimetría diferencial.

Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

El objetivo general de esta metodología es extraer los parámetros termodinámicos que rigen el plegamiento biomolecular y las interacciones de unión mediante calorimetría de barrido diferencial, o DSC, utilizando un ligando termolábil en tan solo dos experimentos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biocalorimetría y el diseño de fármacos, como por ejemplo cuáles son las magnitudes relativas de los parámetros termodinámicos que rigen las interacciones entre biomoléculas e inhibidores de unión fuerte. La principal ventaja de esta técnica es que se realiza una titulación completa del ligando en un solo experimento, lo que permite la extracción rápida de los parámetros termodinámicos mediante un análisis de ajuste global.Para comenzar, prepare los tampones para la diálisis de la biomolécula purificada en solución de ligandos. Someta la biomolécula a diálisis frente a al menos un litro de tampón utilizando tubos de diálisis con un punto de corte de 0,5 a 1,7 kilodalton. El paso más importante para obtener datos de DSC de alta calidad es la diálisis de la biomolécula frente al ligando en el tampón deseado.Esto asegura que no haya artefactos por desajuste de tampón presentes en los datos de DSC. Filtre el tampón final, denominado tampón de trabajo, a través de un filtro de 0,2 micrones que haya sido previamente equilibrado completamente con tampón. Pese las masas deseadas de los ligandos y disuélvalas en el tampón de trabajo filtrado.Si las concentraciones deseadas de ligando requieren masas demasiado pequeñas para pesar con precisión, prepare una solución stock concentrada de ligando. Filtre la solución stock del biomolécula a través de un filtro de 0,2 micrones que se haya equilibrado completamente con el tampón de trabajo. Luego, determine la concentración del biomolécula mediante mediciones de absorbancia.Almacene la biomolécula y el ligando preparados en un refrigerador a cuatro grados Celsius o a menos 20 o menos 80 grados Celsius si la biomolécula y los ligandos toleran la congelación y se requiere almacenamiento a largo plazo. Desgasifique el tampón mediante una mesa agitadora desgasificadora antes de cargarlo en el calorímetro de barrido diferencial, o DSC. Desenrosque la manija de presión del DSC.Luego, conecte un tubo de silicona desde el tampón de trabajo y fíjelo a la brida frontal del capilar de referencia. Cree un puente entre los capilares de referencia y de muestra conectando la brida trasera de referencia a la brida frontal simple. A continuación, fije un trozo de tubo de silicona a la brida trasera de la muestra, que conduzca a un matraz de desecho con una línea de vacío conectada.Encienda la línea de vacío para purgar el DSC con 200 mililitros de tampón de trabajo. Comience conectando secciones de tubo de silicona de aproximadamente tres a cinco centímetros a las bridas del capilar de referencia. A continuación, inserte una punta de pipeta de un mililitro en el tubo de silicona de la brida trasera.Aspire 0,8 mililitros de tampón de trabajo con una pipeta e inserte la punta de la pipeta con el tampón en el tubo de silicona de la brida de referencia frontal. Presione suavemente el émbolo de la pipeta para hacer pasar el tampón de trabajo a través del tubo de silicona frontal, hacia el capilar de referencia y hacia arriba hasta la punta de pipeta conectada a la brida trasera. Presione el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del tampón de trabajo alcance justo por encima del tubo de silicona frontal, luego suelte el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del tampón de trabajo alcance justo por encima del tubo de silicona trasero.Continúe pasando el tampón de trabajo de un lado a otro en el capilar de referencia para eliminar las burbujas del volumen. A continuación, tape la punta posterior de la pipeta con el dedo índice y tire suavemente hacia arriba de la punta posterior de la pipeta y de la pipeta frontal para retirarlas de las bridas de referencia con el tubo de silicona conectado. Cargue el capilar de muestra con el tampón de trabajo como antes.Coloque una tapa de plástico negro en las bridas de la muestra de referencia trasera, dejando las bridas frontales descubiertas. Conecte la manija de presión al DSC y luego abra el software del DSC y presurice el instrumento haciendo clic en la flecha roja hacia arriba en la parte superior de la interfaz una vez que la lectura de potencia se haya estabilizado. La potencia del DSC se indica en un cuadro en la parte superior derecha de la interfaz, junto con la lectura de temperatura y presión del instrumento.Equilibre el DSC con el tampón de trabajo realizando un barrido directo y uno inverso en la pestaña de método experimental ubicada en el lado izquierdo de la pantalla. Asegúrese de seleccionar la opción de barrido para ejecutar el DSC y el modo de barrido de temperatura. En el recuadro de parámetros de temperatura bajo la pestaña de método experimental, haga clic en el botón para calentar.Introduzca uno y 100 grados Celsius como temperaturas experimentales inferior y superior, un grado Celsius por minuto como velocidad de barrido y 60 segundos como período de equilibrio. Haga clic en el botón AddSeries debajo del campo de entrada para el período de equilibrio. Introduzca dos en el campo de pasos a agregar en la ventana emergente y marque la casilla Alternar Calentamiento/Enfriamiento.Haga clic en Aceptar. Los escaneos añadidos aparecen en la parte inferior de la interfaz. Verifique que los parámetros de cada escaneo sean los deseados. Inicie el experimento haciendo clic en el botón verde de reproducción en la parte superior de la interfaz.Navegue hasta la ventana deseada e introduzca un nombre de archivo para guardar el experimento en la ventana emergente. Visualice el progreso del experimento haciendo clic en la pestaña de datos, ubicada a la derecha de la pestaña del método del experimento. Realice experimentos de referencia para la sustracción de la línea base de los datos de la muestra recargando el DSC con tampón de trabajo en ambas capilares.Recopile múltiples barridos directos e inversos en un rango de temperatura adecuado a un grado Celsius por minuto, con un tiempo de equilibrio ascendente de 120 segundos. Elimine los barridos previos de equilibración con tampón de la parte inferior de la interfaz resaltando cada uno individualmente y haciendo clic en la X roja situada en la parte central derecha de la interfaz. Agregue los nuevos barridos haciendo clic en el botón AddSeries, ingresando 20 en el campo para los pasos a agregar y marcando la casilla Alternate Heating/Cooling.Luego, haga clic en Aceptar y ejecute el experimento haciendo clic en el botón de reproducción verde como antes. Repita estos pasos con tampón de trabajo que contenga la concentración deseada de ligando en ambos capilares para obtener los experimentos de referencia para el ligando. Realice dos experimentos separados que se utilizarán para obtener la constante de velocidad de la conversión termolábil.Para el conjunto de datos de biomolécula libre, asegúrese de que la cápsula de referencia contenga el tampón de trabajo, mientras que la cápsula de muestra contenga la biomolécula libre en la concentración deseada en tampón de trabajo. A continuación, realice los experimentos de muestra utilizando el mismo procedimiento de carga de DSC y los mismos parámetros experimentales empleados en los escaneos de referencia. Para los experimentos con ligando unido, asegúrese de que el ligando esté en el tampón de trabajo dentro de la cápsula de referencia, y que la biomolécula más el ligando estén en el tampón de trabajo dentro de la cápsula de muestra.Lave el sistema entre la adición de diferentes ligandos como antes. Realice un experimento adicional con la biomolécula unida al ligando termolábil en el que el período de equilibrio a alta temperatura se aumente a 600 segundos y todos los demás parámetros experimentales sean iguales que antes. Continúe con el procesamiento y análisis de los datos según se describe en el protocolo del texto.La posición y la altura del pico correspondiente al ligando termolábil unido se desplazan sucesivamente hacia las del componente no unido a medida que el ligando termolábil se agota en cada escaneo. El perfil de maduración 3D se utiliza como referencia para determinar el punto final de la conversión del ligando termolábil. Aumentar el período de equilibrio a alta temperatura produce reducciones más pronunciadas en la concentración del ligando termolábil en cada escaneo en comparación con el conjunto de datos obtenido con un período corto de equilibrio.Utilizando los parámetros de concentración del ajuste global optimizado a partir de los dos conjuntos de datos, se puede calcular la constante de velocidad para la conversión del ligando a la temperatura elevada de equilibrio. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 72 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar desgasificar también el ligando de la biomolécula y purgar las burbujas de las capilares de DSC utilizando la pipeta de carga para evitar artefactos en los datos.Después de ver este video y leer el artículo, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de DSC en biomoléculas, así como de la implementación de análisis de ajuste global para extraer rápidamente los parámetros termodinámicos que rigen las interacciones de plegamiento y unión. Aunque este método puede proporcionar información sobre interacciones de plegamiento y unión en equilibrio, también puede aplicarse a otros sistemas, como biomoléculas que presentan cinética lenta de plegamiento y/o de unión de ligandos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un protocolo general para el uso de la calorimetría de titulación isotérmica para controlar la termodinámica vinculante para los sistemas biológicos con moderada afinidad de unión se presenta.

Calorimetría de titulación isotérmica para la medición de macromoléculas-ligando de afinidad

Este video muestra la calorimetría diferencial de barrido, una técnica para estudiar la interacción entre una biomolécula y un ligando. La unión de un aptámero de ADN y un ligando termolábil se estudia mediante la aplicación de repetidos ciclos de calentamiento y enfriamiento a la muestra y la obtención de escaneos para el análisis termodinámico.

Calorimetría diferencial de barrido para estudiar la interacción entre el aptámero y el ligando termolábil del ADN

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

La fluorimetría diferencial de barrido es un método ampliamente utilizado para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de interacciones con proteínas. Aquí, presentamos un método sencillo para ampliar estos análisis para proporcionar una estimación de la constante de disociación entre una molécula pequeña y su proteína asociada.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

Calorimetría diferencial de barrido mide la temperatura de transición térmica (s) y la energía total de calor requerida para desnaturalizar una proteína. Los resultados obtenidos se utilizan para evaluar la estabilidad térmica de los antígenos de proteínas en formulaciones de vacunas.

Calorimetría diferencial de barrido - un método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación del antígeno proteico

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y purificación de proteínas que están marcados con isótopos estables y posterior caracterización de las interacciones de la proteína-proteína usando la espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Los experimentos de Thermophoresis (MST).

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

La termoforesis a microescala obtiene constantes de unión rápidamente a bajo costo de material. La termoforesis a microescala etiquetada o sin etiqueta está disponible comercialmente; sin embargo, la termoforesis sin etiquetas no es capaz de la diversidad de mediciones de interacción que se pueden realizar utilizando etiquetas fluorescentes. Proporcionamos un protocolo para mediciones de termoforesis etiquetadas.

Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.

Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos

Este protocolo describe un método único para detectar la unión entre compuestos y moléculas de proteínas, que ofrece las ventajas de una pérdida mínima de muestras de proteínas y una alta precisión de los datos.

Detección de la interacción proteína-umbeliferona CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido

Aquí, presentamos el ensayo de cambio térmico, una técnica de alto rendimiento basada en fluorescencia que se utiliza para investigar la unión de moléculas pequeñas a proteínas de interés.

Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Aprende a caracterizar interacciones de plegamiento y unión biomolecular mediante calorimetría diferencial de barrido con ligandos termolábiles. Este método permite extraer parámetros termodinámicos rápidamente para avanzar en biocalorimetría y diseño de fármacos.

Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

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