Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo
13 de julio de 2017
Presentamos una configuración de grabación de comportamiento y un protocolo que permite el análisis automatizado del nematodo, la preferencia de Caenorhabditis elegans por compuestos solubles en un ensayo basado en la población. Este artículo describe la construcción de una cámara de comportamiento, el protocolo de ensayo conductual y el uso de software de análisis de vídeo.
El objetivo general de esta configuración y protocolo de registro de comportamiento es cuantificar la preferencia quimiosensorial basada en la población de C Elegans por los compuestos solubles utilizando un sistema de adquisición de video multicámara, seguido de un análisis de video automatizado. Este método puede facilitar la investigación en neurobiología de C. Elegans al permitir un análisis conductual más rápido y estandarizado de los mutantes genéticos. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden analizar múltiples réplicas simultáneamente en condiciones idénticas mientras se monitorea la dinámica temporal de la respuesta de la población de nematodos a las señales solubles.
La demostración del ensamblaje de la cámara de comportamiento estará a cargo de Christopher Cronin, un científico de este laboratorio. Para comenzar, prepare las cubiertas de tela, las barras de montaje de la cámara, los soportes de esquina, las barras de extrusión y el conjunto de montaje de la cámara como se describe en el protocolo de texto adjunto. Comenzando con las barras de los extremos unidas a la barra central, fije el soporte de la cámara y las fundas al conjunto de montaje de la cámara.
A continuación, ensamble el marco de la cámara de comportamiento. Comience colocando cuatro barras de aluminio de extrusión de un pie en una lámina de poliéster cuadrada. Deslice una barra sobre las dos tuercas en T de omni de la hoja de tela, centrando la barra a lo largo del ancho de la tela.
Apriete los sujetadores para asegurar la hoja de tela a cada barra. Extienda la lámina cuadrada de poliéster sobre la superficie de trabajo con las cuatro barras de aluminio adjuntas en la parte superior. Luego, deslice ocho soportes de esquina en las superficies superiores de las cuatro barras de aluminio, uno en cada extremo de cada barra.
Coloque los soportes de esquina en las barras con las patas verticales del soporte al ras con el extremo de las barras y asegúrelos en su lugar apretando los tornillos en las tuercas en T. En cada esquina, coloque una extrusión de aluminio de un pie en posición vertical, deslizando la extrusión sobre las tuercas en T en las dos patas del soporte de la esquina. Luego, asegure la barra vertical a las barras horizontales apretando los sujetadores, uniendo así las dos barras horizontales adyacentes.
Deslice las tuercas en T sueltas del conjunto de montaje de la cámara en forma de H hacia abajo en los montantes del marco. Deje que la H se deslice completamente hacia abajo para descansar en la parte superior de los soportes de las esquinas en cada esquina del marco. Asegure el conjunto de montaje de la cámara en su lugar, apretando los cuatro tornillos del soporte de las esquinas.
A continuación, use las cuatro últimas barras de aluminio de extrusión de un pie para ensamblar la capa inferior de la cámara. Coloque los soportes de las esquinas con las patas de los soportes al ras del extremo de la barra y apriete los tornillos para asegurarlo en su lugar. Luego, deslice las barras hacia abajo entre los montantes del marco con las tuercas en T sueltas en los canales verticales.
Coloque la barra de modo que los bordes superiores de sus soportes de esquina estén una pulgada por debajo del extremo abierto de los montantes y asegúrela en su lugar apretando los tornillos del soporte de esquina. A continuación, deslice las tuercas en T de las cuatro láminas rectangulares de poliéster hacia abajo en los canales de las barras de extrusión verticales para cubrir los lados de la cámara y apriete los sujetadores para asegurarlos en su lugar. Seleccione un lado que sea una puerta para acceder al interior de la cámara y retire los dos tornillos y tuercas en T en la capa inferior de la cámara.
Coloque una tapa de plástico en el extremo superior de cada esquina para que sirva como pies para el marco completo. Gire el marco hacia arriba e inserte dos soportes de panel por diapositiva dentro de la capa de espacio del marco, y gírelos para asegurarlos en su lugar. Luego, coloque una pieza de acrílico transparente de 12 por 12 pulgadas encima de los soportes del panel para proporcionar una etapa para las placas de ensayo.
Por último, coloque la cámara y la plantilla del escenario como se describe en el protocolo de texto adjunto. El día antes del experimento, coloque 28 placas vacías de 35 milímetros en pilas de cinco o menos sobre una superficie plana. Llene cada placa de ensayo con cinco mililitros de agar de medios de crecimiento de nematodos y deje que las placas de ensayo se sequen en posición vertical sin tapas, durante la noche a temperatura ambiente.
El día del experimento, encienda la luz de fondo, inicie la computadora e inicie el software de captura de video de la cámara del microscopio. Conecte la cámara del microscopio a la computadora y haga clic en la miniatura numerada de la cámara en la parte superior de la ventana del software para ver la transmisión en vivo de la cámara. Para ajustar la configuración de grabación de video, despliega el menú de formato de video en la esquina superior izquierda de la alimentación de la cámara y selecciona MJPG 1280x1024.
A continuación, despliega el menú de carpetas junto al menú de formato de vídeo y selecciona una carpeta en la que guardar los archivos de vídeo. Haga clic en el icono de exposición automática en la esquina superior derecha de la transmisión de la cámara y desactive la exposición automática. A continuación, haga clic en el icono LED inmediatamente a la derecha del icono de exposición automática para apagar los LED de la cámara del microscopio incorporados.
Haga clic en el icono de configuración adyacente y seleccione, monocromo. Maximiza el contraste y ajusta el brillo. Alinee una plantilla de ubicación de solución encima de la plantilla de alineación de la placa del escenario y haga clic en el icono de grabación de vídeo timelapse en el lado izquierdo de la alimentación de la cámara.
Introduzca cinco segundos para la duración y un segundo para el intervalo para grabar un vídeo de calibración de cinco segundos a un fotograma por segundo. Utilice una pipeta de vidrio de cinco mililitros para añadir 1,2 mililitros de tampón de medio de crecimiento de nematodos a una placa de gusanos sincronizados y agite suavemente la placa para desplazar los gusanos al tampón. Pipetee el tampón de la placa y dispense los gusanos en el tampón en un tubo de microcentrífuga limpio.
Deje reposar los tubos durante uno o dos minutos para permitir que los gusanos se asienten en el fondo. A continuación, utilice una punta de pipeta de plástico para eliminar la mayor cantidad posible de tampón de lavado de los tubos sin alterar la pelletizada de gusanos agregados en la parte inferior de los tubos. Vuelva a llenar el tubo con un mililitro de tampón de medio de crecimiento de nematodos limpios y repita el procedimiento de lavado dos veces más.
A continuación, pegue con cinta adhesiva una plantilla de colocación de solución en la parte superior de la platina de un microscopio de disección. Luego, coloque una tira de cinta adhesiva de doble cara a cada lado de una plantilla de alineación de placas. Alinee el perímetro de la placa de ensayo con el círculo de la plantilla de alineación de placas y presione hacia abajo hasta que la plantilla se adhiera a la parte inferior de la placa.
A continuación, alinee los marcadores de miembros de la plantilla de la placa de ensayo con los marcadores de los miembros de la plantilla de colocación de la solución en el microscopio de disección. A continuación, utilice una pipeta P2 para colocar un microlitro del tampón M13, en los cuadrantes uno y cuatro. Use una punta nueva para colocar un microlitro de solución de CuCl2 de 10 milimolares en los cuadrantes dos y tres.
Utilice una pipeta pasteur de vidrio para transferir los gusanos lavados a las placas de ensayo una vez que las gotas de solución se hayan absorbido completamente en el agar. Coloque una gota de lombrices en las áreas por encima y por debajo de las regiones circulares tratadas. Doble el tejido cuatro veces y utilice el borde romo para absorber el exceso de tampón de lavado en las placas de ensayo.
Coloque inmediatamente las placas de ensayo debajo de las cámaras del microscopio en la cámara de comportamiento alineando los números de las esquinas de la plantilla. Espere de dos a tres minutos para permitir que los gusanos se aclimaten a las placas de ensayo. A continuación, haz clic en el icono de grabación de vídeo timelapse en el lado izquierdo de la alimentación de la cámara e introduce 10 minutos para la duración y un segundo para el intervalo para grabar un vídeo de 10 minutos de un fotograma por segundo.
Finalmente, haga clic en iniciar, para iniciar la grabación de video. Para cada fotograma de vídeo, la función de índice de preferencias cuenta el número de píxeles de gusano en cada región de interés y calcula el porcentaje de un píxel del número total de píxeles en la región de interés. A continuación se muestran los valores del índice de preferencia obtenidos para los diferentes emparejamientos de genotipos y tratamientos.
Un valor de índice de preferencia positivo indica una atracción hacia el tratamiento, mientras que un valor de índice de preferencia negativo indica repulsión. Se obtiene un índice de preferencia de 0,02 cuando la solución tampón M13 se colocó tanto en la región de control como en la experimental de interés, lo que demuestra que no hay sesgo espacial. Este gráfico también muestra que los gusanos N2 evitaron fuertemente los iones de cobre, lo que resultó en un índice de preferencia de 0,67.
Además, osm-3, que son defectuosos en la formación de cillos sensoriales, y los mutantes ocr-2, que son defectuosos en las respuestas nociceptivas mediadas por ASH, mostraron una menor evitación e incluso una leve atracción por los iones de cobre. Al intentar este protocolo, es importante trabajar rápido pero también de manera fluida y consistente. La configuración del registro y el protocolo de ensayo se pueden adaptar fácilmente para caracterizar las respuestas conductuales basadas en la población que surgen de las interacciones entre las diferentes variedades sensoriales de C. elegans.
Resumen
Este artículo presenta un montaje y un protocolo de registro de comportamiento para analizar el nematodo Caenorhabditis elegans en un ensayo basado en poblaciones. Se describe detalladamente la construcción de una cámara de comportamiento, el protocolo del ensayo conductual y el uso de software de análisis de video para el análisis automatizado.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Mutantes genéticos
Antecedentes
- El entendimiento de las preferencias quimiosensoriales en C. elegans puede proporcionar información sobre la neurobiología.
- El análisis automatizado permite evaluaciones conductuales más rápidas y estandarizadas.
- Los ensayos basados en poblaciones posibilitan el monitoreo de múltiples réplicas bajo condiciones idénticas.
- Este método mejora el estudio de las dinámicas temporales en respuesta a señales solubles.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la preferencia quimiosensorial de C. elegans por compuestos solubles.
- Facilitar la investigación en neurobiología mediante técnicas mejoradas de análisis del comportamiento.
- Mostrar el montaje y uso de una cámara de comportamiento para experimentos.
Métodos Utilizados
- Construcción de una cámara de comportamiento utilizando barras de extrusión de aluminio y láminas de poliéster.
- Sistema de adquisición de video con múltiples cámaras para grabar el comportamiento de nematodos.
- Análisis automatizado de video para cuantificar respuestas a compuestos solubles.
- Preparación de placas de ensayo con medio de crecimiento para nematodos para experimentos.
Resultados principales
- El montaje permite ensayos simultáneos de múltiples réplicas.
- El análisis automatizado proporciona datos consistentes y confiables sobre las respuestas conductuales.
- El método captura la dinámica temporal de las respuestas de C. elegans a estímulos.
- Se demostró la facilidad de ensamblaje y operación de la cámara de comportamiento.
Conclusiones
- Este protocolo mejora la eficiencia de los estudios conductuales en C. elegans.
- El análisis automatizado de videos es una herramienta valiosa para la investigación en neurobiología.
- El diseño de la cámara de comportamiento es práctico para diversas configuraciones experimentales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la cuantificación estandarizada y de alto rendimiento de respuestas quimiosensoriales a nivel de población en C. elegans, apoyando la validación temprana de objetivos y el cribado fenotípico. Al automatizar la adquisición y el análisis de videos, reduce la variabilidad experimental y aumenta el rendimiento en campañas de cribado genético y de compuestos. El enfoque proporciona resultados cuantitativos del índice de preferencia (PI) que facilitan la reducción del riesgo mecanicista de dianas neuroactivas y la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la atracción o repulsión hacia compuestos solubles a través de mediciones del índice de preferencia.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos mediante lecturas conductuales reproducibles y basadas en poblaciones que aclaran las interacciones gen-compuesto.
- Valor predictivo: Genera datos cuantitativos que ayudan en la selección de carteras al distinguir compuestos activos de inactivos según fenotipos de evitación o atracción.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Produce ensayos conductuales estandarizados y reproducibles compatibles con formatos de placas de múltiples pocillos y sistemas de imagen automatizados.
- Escalabilidad: Permite el análisis simultáneo de múltiples réplicas en condiciones idénticas, aumentando el rendimiento del cribado para bibliotecas de mutantes o colecciones de compuestos.
- Normalización de resultados: Genera valores de índice de preferencia (PI) como lecturas cuantitativas y normalizadas adecuadas para la selección de resultados positivos y la modelización de respuesta a dosis.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Pertinencia para la enfermedad: Facilita el estudio de las vías quimiosensoriales conservadas entre especies de nematodos, lo que apoya la validación cruzada de dianas terapéuticas.
- Continuidad traslacional: Permite la selección fenotípica de mutantes genéticos asociados al procesamiento sensorial, aportando información para modelos mecanicistas de trastornos neurológicos.
- Reducción predictiva de riesgos: Registra la dinámica temporal de las respuestas poblacionales, ayudando a distinguir comportamientos agudos de los adaptativos y reduciendo los falsos positivos en la optimización de fármacos líderes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar fenotipos conductuales cuantitativos que vinculan la perturbación genética y la respuesta a compuestos, apoyando la identificación de candidatos principales mediante cribados estandarizados y multiplexados.
- Biología del Descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre la función génica en la quimiosensación mediante la medición de respuestas poblacionales de evitación o atracción frente a señales solubles.
- Selección: Aporta estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante análisis automatizado de video, minimizando el sesgo del operador y aumentando la fiabilidad de los datos.
- Análisis: Genera valores de índice de preferencia (IP) como resultados cuantitativos que permiten comparaciones entre genotipos, tratamientos y puntos temporales.
- Investigación Translacional: Facilita la continuidad desde el descubrimiento génico hasta la validación fenotípica, vinculando mutantes de genes sensoriales con respuestas quimiosensoriales alteradas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección de mutantes genéticos y bibliotecas químicas en múltiples proyectos, gracias a su diseño modular y lectura automatizada.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la fenotipificación conductual cuantitativa y basada en poblaciones.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante análisis automatizado de video y paralelización con múltiples cámaras, reduciendo el tiempo de manipulación manual y la variabilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en la identificación de candidatos al proporcionar lecturas fenotípicas claras y cuantificables que reducen el abandono en fases tardías debido a una mala interacción con el objetivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos y objetivos genéticos basada en datos robustos de cribado conductual de alto rendimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de C. elegans, diseño de ensayos conductuales y operación básica de software de análisis de video.
- Depende de un sistema de microscopía con múltiples cámaras, una cámara ambiental controlada y tuberías de análisis de imágenes para el cálculo del índice de preferencia.
- Necesita la estandarización de la preparación de los gusanos, la densidad de siembra y el tiempo de aclimatación para garantizar la consistencia del ensayo entre repeticiones.
- La adaptación a otras especies de nematodos o modalidades sensoriales puede requerir ajustes en el diseño del área experimental, la entrega del estímulo o los parámetros de seguimiento.
- No es adecuado para estudiar quimiotaxis en gradientes o ensayos con números muy bajos de gusanos debido a las restricciones espaciales y al resultado dependiente de la población.
