La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

El objetivo general de este método de cultivo espaciado microfluídico es cultivar plantas directamente a partir de semillas en un entorno estructurado que también se puede utilizar para el tratamiento controlado y la obtención de imágenes de alta resolución de las raíces de las plántulas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como por ejemplo, cómo el crecimiento de las raíces de las plantas responde a las señales físicas y químicas en múltiples escalas de longitud. La principal ventaja de esta plataforma es que las reparaciones se limitan a un solo plano, lo que hace imposible tratarlas e imagenizarlas sin perder el enfoque óptico.

Sahar Hasim, profesora asociada de investigación en la Universidad de Tennessee. Para empezar, vierta una proporción de 10:1 de PDMS a agente de curado en una oblea maestra prefabricada y selenizada. Desgasificar el PDMS en una cámara de vacío y luego curar el polímero en un horno a 70 grados centígrados durante una hora.

A continuación, utilice un bisturí para cortar los dispositivos PDMS y despegarlos del maestro. Luego, use una biopsia de 1.5 mililitros para perforar la entrada de la semilla en un ángulo de 45 grados, para estimular el crecimiento de la raíz en el canal principal. Además, use el mismo punzón para despejar las entradas de tratamiento.

Use cinta adhesiva para eliminar cualquier residuo del dispositivo y colóquelo con el diseño hacia abajo en un portaobjetos con cubierta de vidrio. Una vez ensamblados, autoclave los dispositivos. Coloque las semillas de Arabidopsis thaliana en un tubo de microfuga y agregue una mezcla de lejía y detergente para esterilizar las semillas.

Luego, lava las semillas cuatro veces con agua estéril. A continuación, estratifique las semillas refrigerándolas en el tubo de microfuga durante la noche o almacenándolas hasta por una semana a cuatro grados centígrados. Antes de usar los dispositivos estériles, colóquelos en una cámara de desgasificación al vacío, para eliminar el aire del PDMS permeable al gas y los canales fluídicos.

Esto mejorará el llenado posterior de los dispositivos. Retire los dispositivos de la cámara de vacío e sumérjalos inmediatamente en una placa de Petri llena de líquido de un medio vegetal de un cuarto de concentración, a un pH de 5,7. Con una pipeta, extraiga el líquido a través de las entradas para llenar el dispositivo.

Asegúrese de que no queden burbujas de aire dentro de los canales inspeccionándolas visualmente antes de transferirlas a placas de Petri frescas y secas individuales. A continuación, vierta agar caliente alrededor del dispositivo hasta que el nivel de agar esté casi al ras de la parte superior del dispositivo. En un entorno estéril, utilice una pipeta pequeña y transfiera una semilla esterilizada a la entrada de cada dispositivo.

Luego, cubra cada placa de Petri con una película de cera y colóquelas en una cámara de crecimiento cíclica oscura y clara a temperatura ambiente. Oriente la placa de Petri en la cámara de crecimiento a temperatura ambiente, verticalmente, para que la gravedad anime a las raíces a crecer a través del canal. En el momento deseado y el desarrollo de la plántula, use una pipeta para agregar una cantidad prescrita del tratamiento experimental a cada uno de los ocho puertos laterales de los dispositivos.

Cuando termine, vuelva a sellar las placas de Petri con una película de cera. Luego, devuélvalos a la cámara de crecimiento. Ajuste el aumento de un microscopio de campo claro invertido, entre 4x y 20x.

Coloque toda la placa de Petri que contiene el dispositivo y la plántula bajo el microscopio para obtener imágenes de contraste de interferencia diferencial o de campo brillante. Optimice las condiciones de iluminación ajustando los tiempos de exposición, el brillo de la lámpara, la apertura y la polaridad de la luz para dilucidar las características morfológicas que le interesan. Luego, conduzca la etapa al área deseada de la raíz y concéntrese en la raíz o el pelo de la raíz de interés.

Adquiera un solo punto de tiempo o una serie de imágenes para visualizar el crecimiento de los pelos radiculares. Para las series temporales, imagine los pelos de la raíz en crecimiento una vez por minuto. Para visualizar el crecimiento de la raíz principal, adquiera una imagen cada 30 minutos.

Cuando termine, regrese la placa de Petri y las plántulas a la cámara de crecimiento, en posición vertical. Una vez que la plántula haya crecido durante el tiempo deseado, use un par de pinzas para quitar el cubreobjetos y el dispositivo del agar. Luego, humedezca un pañuelo de laboratorio con etanol y utilícelo para limpiar la parte inferior del cubreobjetos.

Aplique el aceite adecuado a un objetivo de inmersión en aceite de 63x y coloque el deslizamiento de la cubierta hacia abajo en la platina del microscopio. A continuación, levanta el escenario para contactar con los medios de inmersión en el objetivo. Optimiza las condiciones de iluminación, ajustando los tiempos de exposición, el brillo de la lámpara, la apertura y la polaridad de la luz.

Luego, conduzca la etapa al área deseada de la raíz y concéntrese en los pelos de la raíz de interés. Para cuantificar el crecimiento del vello radicular a lo largo del tiempo, configure el software para adquirir una imagen por minuto, en la ubicación de interés. Para visualizar la autofluorescencia de la planta o los marcadores de fluorescencia, minimice el tiempo de exposición a la fluorescencia, al tiempo que conserva una señal fluorescente identificable.

Adquiera imágenes de los orgánulos tan rápido como lo permita el tiempo de exposición. Una vez que la plántula haya crecido durante el tiempo deseado, retire el dispositivo y cubra la placa de Petri. Dé la vuelta al dispositivo y retire suavemente el cubreobjetos para que la raíz permanezca dentro del canal PDMS.

Coloque el dispositivo PDMS sobre un sustrato reflectante plano, como un microrrecubierto de oro, y luego monte el dispositivo en el soporte de muestras AFM, con la raíz hacia arriba. Después de asegurar un accesorio de pozo líquido en la parte superior del dispositivo PDMS, llénelo con agua para mantener las raíces hidratadas durante la toma de imágenes. Una vez que la muestra se haya cargado en el AFM, ajuste el control z para el grosor del dispositivo PDMS y conduzca el voladizo a la región de interés en la raíz.

Usando una cámara como guía, alinee el láser con la punta del voladizo y use la imagen en modo de contacto para ejercer una fuerza mínima sobre la raíz durante el escaneo. Baje lentamente el mecanismo de escaneo hasta que el voladizo haga contacto con la muestra. A continuación, ajuste el tamaño de escaneo para la región deseada y elija una velocidad de escaneo de una línea por segundo con 256 puntos de voltaje por línea.

Finalmente, adquiera el escaneo. Los dispositivos microfluídicos PDMS de dos capas descritos aquí, tienen un canal central de 200 micrómetros de altura para la raíz principal de Arabidopsis y dos cámaras laterales de 20 micrómetros de altura, para confinar los pelos radiculares que crecen lateralmente. Esto asegura que los pelos de la raíz estén en el mismo plano de imagen que la raíz principal.

Dentro de la plataforma microfluídica, los pelos radiculares se pueden cuantificar a nivel celular, en términos de su longitud, densidad y la angulosidad de su crecimiento desde la raíz. Una de las ventajas más fuertes de usar una plataforma microfluídica es la capacidad de agregar uniformemente concentraciones precisas de tratamientos químicos a los organismos. Aquí, se obtiene una imagen de una plántula antes y después de la adición de perlas de poliestireno carboxilado fluorescente.

La adición de este tratamiento abiótico no alteró la orientación del foco óptico de los pelos radiculares de las plántulas. Usando marcadores fluorescentes, se puede ver el flujo citoplasmático en un cabello de la raíz. El movimiento de estos tres orgánulos se captura en este gráfico de distribución acumulativa.

Además de las imágenes ópticas, esta plataforma también permite la obtención de imágenes AFM y SEM, debido a su capacidad de desmontaje, sin perturbar la raíz. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluidas las imágenes químicas, para responder preguntas adicionales como cómo se ven los perfiles químicos alrededor de la raíz.