Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

El objetivo general de esta transferencia génica mediante un vector de virus adenoasociado es manipular genéticamente el cerebro y la médula espinal de la rata a una escala amplia y extensa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transferencia génica. Es una manera muy eficiente de introducir genes in-vivo y, por lo tanto, una técnica muy potente y versátil.

Este procedimiento es rápido y altamente reproducible. Hemos utilizado este enfoque de transferencia génica a gran escala para expresar una proteína relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica en toda la médula espinal de ratas en varias publicaciones. Mi colega, Robert Dayton, demostrará el procedimiento.

Mychal Grames ayudará a Robert. Comience por preparar la estación de trabajo: primero, limpie la superficie con etanol al 70 %. Luego coloque una almohadilla térmica en el área de trabajo y ajústela para calentar a 37 grados Celsius.

Coloque una almohadilla de banco encima de la almohadilla calefactora. Verifique que haya oxígeno e isoflurano suficientes para el procedimiento. Limpie la cámara de inducción y la máscara de anestesia con etanol al 70 % y coloque la máscara de anestesia sobre la almohadilla de banco.

Asegúrese de tener a mano lo siguiente: un cuadrado de película de parafina de aproximadamente 5 x 5 centímetros por animal, una toallita con alcohol y dos o tres compresas de gasa por animal, puntas de pipeta y una micropipeta. A continuación, descongele el vector a temperatura ambiente y etiquete un tubo estéril de microcentrífuga para cada animal. Transfiera con pipeta el volumen requerido de AAV al tubo correspondiente y complete hasta el volumen deseado para la inyección con solución de Ringer lactato o solución salina.

Agite la muestra en un vórtex durante uno o dos segundos y luego, centrifugue brevemente durante cinco segundos para reunir la muestra en el fondo del tubo. Pipetee el volumen total de inyección fuera del tubo y sobre un cuadrado de película de parafina. A continuación, coloque una aguja de calibre 30 en una jeringa de un mililitro.

Coloque la aguja con el bisel hacia abajo en el vector sobre la película de parafina. Retire el émbolo de la jeringa hasta que todo el virus esté dentro de la aguja y la jeringa. Anestesie adecuadamente la rata utilizando el sistema de anestesia.

Asegúrese de un plano adecuado de anestesia mediante la ausencia de reacción a un pellizco en el dedo del pie. Luego, coloque la rata en el área de trabajo sobre su costado y mantenga la anestesia utilizando el cono nasal. Con la rata acostada de lado, una vena lateral de la cola debe quedar orientada hacia arriba.

La inyección se realiza a dos tercios de la longitud de la cola. Limpie el sitio de inyección con la gasa preparada con alcohol. Sujete firmemente la cola ligeramente por encima del área de inyección, con un dedo directamente sobre la vena lateral de la cola; esto dilatará la vena.

Con el bisel hacia arriba, alinee la aguja con la vena caudal visible en la misma dirección. Perfore la piel sobre la vena caudal, teniendo mucho cuidado de evitar la otra mano que sostiene la cola y presiona la vena caudal. Libere la presión de la vena caudal para permitir el flujo sanguíneo normal.

Luego mueva la aguja hacia la vena. Para asegurarse de que la aguja ha perforado la vena de la cola, tire ligeramente del émbolo hacia atrás. Si la aguja está dentro de la vena, la sangre fluirá hacia la aguja.

Después de reposicionar la aguja si es necesario, estabilice la aguja sosteniendo el extremo de la jeringa contra la cola. Inyecte lentamente el vector en la cola a aproximadamente 20 microlitros por segundo. En caso de una inyección deficiente, el animal solo será transducido parcialmente y los resultados probablemente no serán útiles.

Sin embargo, con práctica, las inyecciones adecuadas son muy reproducibles y confiables. Si se ha administrado el vector, retire la aguja de la cola y presione una gasa contra el sitio de inyección para ayudar a detener la hemorragia durante 30 a 60 segundos. Apague la anestesia con isoflurano y el oxígeno.

Monitoree la rata hasta que recupere la conciencia y luego devuélvala a su jaula. Deseche los materiales que podrían estar contaminados con AAV en un contenedor adecuado para biohazard y limpie la estación de trabajo con etanol al 70%. Obtenga secciones coronales de 50 micrones del cerebro fijado y crioprotegido de un animal inyectado con AAV, utilizando un microtomo deslizante con platina refrigerante.

Después de la inmunotinción para GFP y el montaje sobre portaobjetos, tome una fotomicrografía de cada sección en la región de interés definida con una lente de baja magnificación utilizando un microscopio. Mantenga los ajustes de la cámara iguales en todas las muestras que se analizarán y guarde los datos como archivos TIFF. Abra la fotomicrografía en el programa ampliamente disponible Scion Image.

Se abrirán dos ventanas; cierre la ventana indicada como color de índice. Elija opciones y luego corte por densidad. Un rango de tonos se indicará en rojo en la ventana de la tabla de búsqueda.

En la ventana, utilice el cursor para rellenar únicamente la etiqueta específica de GFP y deténgase cuando comience a detectarse el fondo no específico en la imagen. A continuación, haga clic en analizar y establecer escala. En la cuarta línea debe aparecer unidades; en el menú desplegable, seleccione píxeles y luego haga clic en aceptar.

Para medir el área fluorescente, haga clic en analizar y luego en medir. A continuación, haga clic en analizar y mostrar resultados. Aparecerá una ventana de resultados y la medición del área fluorescente se encontrará bajo el encabezado etiquetado como área.

Una vez que se hayan registrado todas las mediciones, promedie los valores de tres a seis secciones por animal. Utilice una prueba estadística adecuada para comparar las áreas transducidas entre los grupos. Esta imagen representativa muestra la inmunofluorescencia de GFP en el cerebelo de rata, cuatro semanas después de una inyección intravenosa en la cola de AAV 9 GFP.

Se utilizó un software de análisis de imágenes para resaltar selectivamente el área fluorescente y cuantificar los píxeles resaltados. Esta es la imagen GFP de un animal no transducido. El análisis de esta imagen, utilizando los mismos parámetros que en el animal inyectado con GFP, detecta efectivamente un nivel muy bajo de señal de fondo.

Una vez dominada, la inyección puede realizarse en aproximadamente cinco minutos por rata. En conclusión, esta técnica describe una forma de introducir eficientemente genes en el SNC de la rata; una administración única de genes produce expresión duradera y efectos a largo plazo. Lo más importante es que el sistema nervioso central se manipula desde la periferia.

Una inyección intravenosa de vector relativamente no invasiva alcanza el cerebro y la médula espinal, el SNC.