Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

El objetivo general de esta transferencia de genes de vectores virales adenoasociados es manipular genéticamente el cerebro y la médula espinal de la rata a gran escala. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transferencia de genes. Es una forma muy eficiente de introducir genes in vivo y, por lo tanto, una técnica muy potente, muy versátil.

Este procedimiento es rápido y altamente reproducible. Hemos utilizado este enfoque de transferencia génica a gran escala para expresar una proteína relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica en toda la médula espinal de ratas en varias publicaciones. Mi colega, Robert Dayton, hará una demostración del procedimiento.

Mychal Grames asistirá a Robert. Comience preparando la estación de trabajo, primero, limpie la superficie con etanol al 70%. Luego coloque una almohadilla térmica en el área de trabajo y configúrela para que se caliente a 37 grados centígrados.

Coloque una almohadilla de banco encima de la almohadilla térmica. Verifique que haya suficiente oxígeno e isoflurano para el procedimiento. Limpie la cámara de inducción y la máscara de anestesia con etanol al 70% y coloque la máscara de anestesia en la almohadilla del banco.

Asegúrese de tener a mano: un cuadrado de película de parafina de unos 5 x 5 centímetros por animal, una almohadilla de preparación de alcohol y dos o tres almohadillas de gasa por animal, puntas de pipeta y una micropipeta. A continuación, descongele el vector a temperatura ambiente y etiquete un tubo de microcentrífuga estéril para cada animal. Pipetear el volumen requerido de AAV en el tubo apropiado y aumentar el volumen hasta el volumen de inyección deseado con solución de ringer lactato o solución salina.

Coloque el vórtice de la muestra durante uno o dos segundos y luego, centrifugar por pulso durante cinco segundos para llevar la muestra al fondo del tubo. Pipetear el volumen total de inyección fuera del tubo y colocarlo en el cuadrado de la película de parafina. A continuación, coloque una aguja de calibre 30 en una jeringa de un mililitro.

Coloque la aguja con el bisel hacia abajo en el vector de la película de parafina. Tire hacia atrás del émbolo de la jeringa hasta que todo el virus esté en la aguja y la jeringa. Anestesiar adecuadamente a la rata utilizando el sistema de anestesia.

Asegurar un plano adecuado de anestesia mediante la ausencia de reacción a un pellizco en el dedo del pie. Luego, coloque la rata en el área de trabajo de lado y mantenga la anestesia usando el cono nasal. Con la rata acostada de lado, una vena lateral de la cola debe estar hacia arriba.

La inyección es dos tercios a lo largo de la cola. Limpie el lugar de la inyección con la almohadilla de preparación de alcohol. Sostenga firmemente la cola ligeramente por encima del área de inyección, con un dedo directamente sobre la vena lateral de la cola, esto dilatará la vena.

Con el bisel hacia arriba, alinee la aguja con la vena de cola visible en la misma dirección. Perfore la piel sobre la vena de la cola, teniendo mucho cuidado de evitar que la otra mano sostenga la cola y presione la vena de la cola. Libere la presión de la vena de la cola para permitir el flujo sanguíneo normal.

A continuación, mueva la aguja por la vena. Para asegurarse de que la aguja haya perforado la vena de la cola, tire ligeramente hacia atrás del émbolo. Si la aguja está en la vena, la sangre fluirá hacia la aguja.

Después de volver a colocar la aguja si es necesario, estabilice la aguja sosteniendo el extremo de la jeringa contra la cola. Inyecte lentamente el vector en la cola a aproximadamente 20 microlitros por segundo. En el caso de una mala inyección, el animal solo se transducirá parcialmente y los resultados probablemente no serán útiles.

Sin embargo, con la práctica, las buenas inyecciones son muy reproducibles y fiables. Si se ha administrado el vector, retire la aguja de la cola y presione una gasa contra el sitio de la inyección para ayudar a detener el sangrado durante 30 a 60 segundos. Apague la anestesia con isoflurano y el oxígeno.

Vigila a la rata hasta que recupere la conciencia y luego devuélvela a su jaula. Deseche los materiales que puedan estar contaminados con AAV en un contenedor de riesgo biológico adecuado y limpie la estación de trabajo con etanol al 70%. Obtención de secciones coronales de 50 micras del cerebro fijo y crioprotegido de un animal inyectado con AAV, utilizando un micrótomo deslizante con etapa de congelación.

Después de la inmunotinción para GFP y el montaje en portaobjetos, fotomicrifique cada sección en la región de interés definida con una lente de bajo aumento utilizando un microscopio. Mantenga la misma configuración de la cámara en todas las muestras que se van a analizar y guarde los datos como archivos TIFF. Abra la fotomicrografía en el programa Scion Image, ampliamente disponible.

Se abrirán dos ventanas, cierre la ventana indicada como color de índice. Elija opciones y, a continuación, corte de densidad. Una gama de tonos se indicará en rojo en la ventana de la tabla de consulta.

En la ventana, use el cursor para completar solo el etiquetado GFP específico y deténgase cuando el fondo no específico comience a recogerse en la imagen. A continuación, haga clic en analizar y establecer la escala. La cuarta línea debe decir unidades, de la lista desplegable, elija píxeles y luego haga clic en Aceptar.

Para medir el área fluorescente, haga clic en analizar y, a continuación, en medir. A continuación, haga clic en analizar y mostrar resultados. Aparecerá una ventana de resultados y la medición del área fluorescente estará bajo el encabezado etiquetado, área.

Una vez que se hayan registrado todas las mediciones, promedie los valores de tres a seis secciones por animal. Utilice una prueba estadística apropiada para comparar las áreas transducidas entre los grupos. Esta imagen representativa muestra la inmunofluorescencia de GFP en el cerebelo de la rata, cuatro semanas después de una inyección de AAV 9 GFP en la vena de la cola.

Se utilizó un software de análisis de imágenes para resaltar selectivamente el área fluorescente y cuantificar los píxeles resaltados. Esta es la imagen GFP de un animal no transducido. El análisis de esta imagen, utilizando los mismos parámetros para el animal inyectado con GFP, detecta un nivel muy bajo de señal de fondo.

Una vez dominada, la inyección se puede realizar en unos cinco minutos por rata. En conclusión, esta técnica describe una forma eficiente de introducir genes en el SNC de la rata, una entrega de genes de una sola vez produce una expresión duradera y efectos a largo plazo. Lo más importante es que el sistema nervioso central se manipula desde la periferia.

Una inyección vectorial intravenosa relativamente no invasiva llega al cerebro y la médula espinal, el SNC.