Name: Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprende microirradiación con láser UVA para estudiar reparación del ADN en células vivas HeLa. Este método optimizado permite inducir lesiones específicas preservando el ciclo celular normal y analizar la cinética de proteínas reparadoras.

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Este trabajo fue financiado por la Agencia de donación de la República Checa, proyecto P302-12-G157. Los experimentos también fueron apoyados por la CZ09 de programa de investigación Checa-Noruega, que es supervisado por los fondos noruegos y por el Ministerio de educación, juventud y deporte de la República Checa (número: 7F14369).

<ol><li>Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+damage+to+cellular+DNA%3A+direct+and+photosensitized+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions.</a> Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+UV-induced+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.</a> J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).</li>
<li>Lahtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+irradiation+does+not+induce+detectable+changes+in+DNA+methylation+directly+following+exposure+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44858(2012).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+chromosome+aberrations+in+the+human+interphase+nucleus+by+visualization+of+specific+target+DNAs+with+radioactive+and+non-radioactive+in+situ+hybridization+techniques%3A+diagnosis+of+trisomy+18+with+probe+L1.84%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84.</a> Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).</li>
<li>Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+UV+microirradiation+of+interphase+nuclei+and+post-treatment+with+caffeine.+A+new+approach+to+establish+the+arrangement+of+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes.</a> Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).</li>
<li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Oct4+protein+to+UV-damaged+chromatin+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (12), e27281(2011).</li>
<li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1beta-dependent+recruitment+of+UBF1+to+irradiated+chromatin+occurs+simultaneously+with+CPDs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs.</a> Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39(2014).</li>
<li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microscopy+techniques+used+for+comparison+of+UVA-+and+gamma-irradiation-induced+DNA+damage+in+the+cell+nucleus+and+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus.</a> Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).</li>
<li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+recruited+to+various+types+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage.</a> J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).</li>
<li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coilin+is+rapidly+recruited+to+UVA-induced+DNA+lesions+and+gamma-radiation+affects+localized+movement+of+Cajal+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies.</a> Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).</li>
<li>Franek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Image+Acquisition+and+Analytical+Techniques+for+Studies+of+Living+Cells+and+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).</li>
<li>Lemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+conventional+fluorescent+markers+for+far-field+fluorescence+localization+nanoscopy+allows+resolution+in+the+10-nm+range%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range.</a> J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).</li>
<li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Lakowitz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowitz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+and+polarization-resolved+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology.</a> Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+properties+of+aequorin%2C+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan%2C+Aequorea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li>
<li>Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+cellular+proteins+that+bind+to+wild-type+but+not+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Binding+protein+53BP1+is+required+for+DNA+damage+responses+and+tumor+suppression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice.</a> Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).</li>
<li>Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+order+in+HeLa+cells+changes+during+mitosis+and+early+G1%2C+but+is+stably+maintained+during+subsequent+interphase+stages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.</a> J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+silhouette+of+individual+cells+in+S%2FG2%2FM+phases+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence.</a> Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).</li>
<li>Sorokin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+movement+and+morphology+of+UBF1-positive+nucleolar+regions+are+changed+by+gamma-irradiation+in+G2+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle.</a> Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).</li>
<li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET%3A+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS One. 7 (11), e49593(2012).</li>
<li>Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+detectors+improved+time-lapse+confocal+microscopy+of+PML+and+53BP1+nuclear+body+colocalization+in+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions.</a> Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).</li>
<li>Suchankova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+kinetics+of+DNA+repair+protein+accumulation+at+DNA+lesions+and+cell+cycle-dependent+formation+of+gammaH2AX-+and+NBS1-positive+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci.</a> Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).</li>
<li>Bártová, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+is+recruited+to+irradiated+chromatin+in+late+S+phase+and+is+most+pronounced+in+G2+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle.</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Krejci, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Translational+Modifications+of+Histones+in+Human+Sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm.</a> J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).</li>
<li>Chou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+localization+screen+reveals+poly+%28ADP+ribose%29-regulated+recruitment+of+the+repressive+polycomb+and+NuRD+complexes+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).</li>
<li>Sustackova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation-dependent+nuclear+arrangement+and+recruitment+of+BMI1+protein+to+UV-damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin.</a> J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).</li>
<li>Smirnov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+replication+and+transcription+domains+in+nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of replication and transcription domains in nucleoli.</a> J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).</li>
<li>Bastiaens, P. I., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).</li>
<li>Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+interactions+using+Forster+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Methods. 66 (2), 200-207 (2014).</li>
<li>Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23867337">High-resolution multiphoton cryomicroscopy.</a> Methods. 66 (2), 230-236 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses.

Técnicas de microscopía representan herramientas básicas en laboratorios de investigación. Aquí, una breve descripción de los métodos utilizados para el estudio de reclutamiento de la proteína y se presenta la cinética en las lesiones del ADN. Destaca especialmente la experiencia experimental en el campo de la microirradiation local de las células vivas, y discutimos el estudio de la cinética de la proteína por interacción proteína-proteína y FRAP en las lesiones del ADN por blanqueo de aceptador traste...

Daños en el ADN conduce a la aparición de las lesiones del ADN de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine y sola o doble cadena rompe1,2. Los rayos γ son la forma de radiaciones ionizantes con la más alta energía y alta penetrancia, así esta fuente de radiación es ampliamente utilizada en radioterapia3. Por otro lado, experimentalmente inducida por daño en el ADN causada por lásers imitadores naturales la exposición Ultravioleta a los rayos UV. Microirradiation UVA, como un método microscópico, representa una herramienta experimental para el estudio de daño de la DNA en células vivas individuales. Microirradiation fue utilizado por primera vez hace 40 años para revelar la organización del cromosoma regiones4,5. Esta técnica es altamente dependiente de cualquiera de las propiedades funcionales de microscopios confocales o los límites técnicos de nanoscopía moderno. Para inducir las lesiones del ADN, las células pueden ser presensitized por 5' bromodeoxiuridina (BrdU) o Hoechst 33342 antes de la irradiación UV. Bártová et al. 6 había descrito anteriormente el paso presensitization, y recientemente hemos optimizado esta técnica de microirradiation para evitar la muerte celular o apoptosis. Por ejemplo, el uso de un láser UV de 405 nm (sin presensitization de Hoechst 33342) conduce a la inducción de roturas de doble cadena 53BP1 positivo (distritales) a expensas de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). Por otro lado, pasos presensitization combinados con microirradiation UV inducen niveles muy altos de CPDs y distritales simultáneamente7,8. Esta metodología es difícil de aplicar al estudio de una sola vía de reparación de ADN.
Con microirradiation, es posible analizar el reclutamiento de proteínas, cinética y la interacción en las lesiones del ADN en las células vivas. Un ejemplo de este método fue publicado por Luijsterburg et al. 9 1β de proteína de la heterocromatina, y recientemente se demostró para la primera vez que los factores de pluripotencia Oct4 y una proteína vinculada con los cuerpos de Cajal, coilina, son reclutados al ADN inducido por UV lesiones6,10. Cinética de la proteína en estas lesiones de ADN también pueden ser estudiadas usando el FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo)11,12,13 o traste técnicas (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia)14 ,15. Estos métodos tienen el potencial para revelar la simple difusión de proteínas en las lesiones del ADN o las interacciones proteína-proteína. Una herramienta útil para la caracterización adicional de las proteínas es FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) o su combinación con FRET tecnología (FLIM-FRET)16. Estos métodos permiten el estudio de los procesos en la vida las células que son estable o transitorio expresando la proteína de interés con la etiqueta por una molécula fluorescente17. Aquí, se muestra un ejemplo de decaimiento exponencial de tiempo (τ) para proteína p53 tagged GFP y su socio de la interacción, etiquetado mCherry 53BP1, desempeñando un papel importante en el daño de ADN respuesta18,19 . El parámetro τ, la vida útil del fluorocromo proporcionado por cálculos del FLIM, es específico para un colorante de fluorescencia dado, sus capacidades de Unión y su entorno celular. Por lo tanto, este método puede nos muestran diferencias entre subpoblaciones de la proteína, sus habilidades de enlace y sus propiedades funcionales después de, por ejemplo, daños en el ADN.
Aquí, un resumen de los enfoques metodológicos de las técnicas de microscopía avanzada que se utiliza en nuestro laboratorio para estudiar el reclutamiento de proteínas específicos, cinética, difusión y las interacciones de la proteína-proteína en el sitio de la cromatina microirradiated se presenta. La metodología paso a paso para la inducción de lesiones locales del ADN en las células vivas y una descripción de las metodologías útiles para estudios de eventos relacionados con el daño de DNA en lesiones de ADN localmente inducidas causadas por láseres UV son proporcionados.

<table><tbody><tr><td><Cultivo > células fuertes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2TM</td><td></td></tr><tr><td>ES-D3 [D3]</td><td>ATCC</td><td>CRL-11632TM</td><td></td></tr><tr><td>HeLa -Fucci células</td><td></td><td></td><td>http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN-Biotech</td><td>P03-0710</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SV30180.03</td><td></td></tr><tr><td>ES Cell</td><td>FBS Gibco</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>mLIF (factor inhibidor de la leucemia en ratones)</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>MTG (1-tioglicerol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Biosera</td><td>XC-A4122/100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina - EDTA</td><td>Biosera</td><td>XC-T1717/100</td><td>diluido con 1 &times; PBS en proporción 1:6</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular Nunclon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7866</td><td>cultivo de mESCs células D3</td></tr><tr><td>&micro;-Plato 35m+A15:I35m Grid-500</td><td>Ibidi GmbH</td><td>81166</td><td>placa microscópica</td></tr><tr><td>0,2% Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>diluida en agua destilada y autoclave</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cell transfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-p53 plásmido</td><td>Addgene</td><td>12091</td><td></td></tr><tr><td>mCherry-PCNA plásmido</td><td></td><td></td><td>generoso regalo de Cristina Cardoso, Technische Universit&auml; t Darmstadt</td></tr><tr><td>mCherry-53BP1 plásmido</td><td>Addgene</td><td>19835</td><td></td></tr><tr><td>Metafeceteno</td><td>Biontex Laboratories GmbH</td><td>T020&ndash; 2.0</td><td></td></tr><tr><td>10 y veces; PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>para uso en transfección 1 y veces; PBS diluido en agua libre de nucleasas</td></tr><tr><td>5-bromo-2'-desoxi-uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Confocal Microscopcopy</td><td></td><td></td><td></td>Microscopio</tr><tr><td> Leica TCS SP5</td><td>Microscopio Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láser de luz blanca</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láser de 355 nm</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td>potencia del láser 80 mW</td></tr><tr><td>Láser de 405 nm Potencia</td> del láser de <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>50 mW</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Immunofluorescence staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR International Ltd</td><td>631-1580</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194854</td><td></td></tr><tr><td>Saponina de corteza de quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>53BP1</td><td>Abcam</td><td>ab21083</td><td>anticuerpo</td></tr> <tr><td>primarioAlexaFluore 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27040</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories Ltd</td><td>H-1000</td><td>medio de montaje</td></tr></tbody></table>

avanzadas técnicas de microscopía confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del adn

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Microirradiation local con láser representa una herramienta útil para estudios de procesos relacionados con la reparación de DNA en células vivas. Aquí, describimos un enfoque metodológico para el análisis de la cinética de la proteína en las lesiones del ADN sobre interacciones proteína-proteína o tiempo en localmente microirradiated cromatina. También nos enseña a reconocer las fases individuales del ciclo celular utilizando el sistema celular Fucci para estudiar la cinética de la proteína dependiente de ciclo celular en las lesiones del ADN. Una descripción metodológica de la utilización de dos láseres UV (355 nanómetro y 405 nm) inducir diferentes tipos de daño de la DNA también se presenta. Sólo el microirradiated de las células por el láser de 405 nm diodo procedió normalmente a través de la mitosis y se desprovisto de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). También mostramos cómo las células de microirradiated pueden ser fijo en un momento dado para llevar a cabo la inmunodetección de proteínas endógenas de interés. Para los estudios de reparación de ADN, además se describe el uso de métodos biofísicos como FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo) FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) en las células con que se producen espontáneamente focos de daño de ADN. También se muestra una aplicación de FLIM-FRET (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia) en los estudios experimentales de las interacciones proteína-proteína.

Utilizando microscopía confocal avanzada, se observó una acumulación de proteínas 53BP1 y PCNA mCherry mCherry etiquetadas en las lesiones del ADN. Se realizaron análisis por microirradiation local de las células vivas. Para reconocer los patrones de distribución nuclear de proteínas relacionadas con la reparación de ADN en cada ciclo celular fases, hemos utilizado el sistema celular Fucci, por la que es posible determinar la G1, S temprano, y las fases G2 de la célula (<strong class="xfi...

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

El objetivo general de estos experimentos es inducir lesiones en el ADN mediante microirradiación localizada de células y observar el reclutamiento de proteínas implicadas en los procesos de reparación del ADN. Este método puede ayudarnos a comprender una pregunta muy compleja y profunda, como es la forma en que las células normales y cancerosas responden al daño en el ADN. La principal ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la respuesta al daño en el ADN en células individuales vivas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sona Legartova, posdoctoranda, y Jana Suchankova, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, cultive células HeLa en DMEM suplementado con 10 % de SFB y los antibióticos adecuados. Incube las células a 37 °C

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Aquí, se demuestra el estudio de diferentes enfoques de reconocimiento de lesiones de ADN a través de imágenes AFM de una sola molécula con el sistema de reparación de escisión de nucleótidos como ejemplo. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas, así como los detalles experimentales y analíticos de los experimentos de AFM.

Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Aprende microirradiación con láser UVA para estudiar reparación del ADN en células vivas HeLa. Este método optimizado permite inducir lesiones específicas preservando el ciclo celular normal y analizar la cinética de proteínas reparadoras.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

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