Name: Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a sintetizar péptidos amiloide-β42 e inyectarlos en cerebro de pez cebra adulto para modelar la enfermedad de Alzheimer. Este método permite estudiar la toxicidad amiloide sobre células madre neuronales y respuestas de rejuvenecimiento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por DZNE y la Asociación Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) y DFG (KI1524/6) (CK); y por la Asociación de Leibniz (Sierra-2011-IPF-2) y el BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). También nos gustaría agradecer a Ulrike Hofmann para síntesis de péptidos y Nandini Asokan, Prayag Murawala y Elly Tanaka durante la filmación del procedimiento.

este protocolo es un procedimiento estándar sugerido por las directrices de la UE (2010/63) y la sociedad europea de modelos de peces en biología y medicina (EuFishBioMed) en Karlsruhe Instituto de tecnología (KIT). Todos los métodos descritos después de aquí han sido aprobados por la Comisión de ética (Landesdirektion Dresden; número TVV-52/2015).
 1. preparación de Aβ42 péptido <ol><li>sintetizar péptidos (ver tabla 1) utilizando la química estándar 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) como el reactivo de acoplamiento en un sintetizador de péptidos de fase sólida automatizada 52. La escala de la síntesis fue μmol 100.</li>
	<li>Carga el sintetizador de péptidos automatizada con 500 mg de la resina de Fmoc-protegido como la fase sólida (capacidad de 0,2 mmol/g de carga). Los aminoácidos Fmoc-protegidos disueltos a una concentración 0,5 M de la carga en el volumen requerido y calculado para el sintetizador respectivo. 
	Nota: Los cálculos se hacen para permitir el acoplamiento de cada aminoácido protegido de Fmoc dos veces con el exceso de 5 veces de cada bloque de edificio para la resina 47.</li>
	<li>Disolver los reactivos necesarios para la síntesis de péptidos en dimethlyformamide (DMF). Por ejemplo, preparar el activador, HBTU, en una concentración de 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (la base) y el 5% v/v anhídrido acético (la mezcla que capsula) para los grupos aminos no reaccionó.</li>
	<li>Desdoblan los péptidos de la resina mezclando continuamente el soporte sólido mediante un mezclador en una mezcla de escote recién preparada de ácido trifluoroacético (TFA): Triisopropylsilane(TIS): agua: Dithiothreitol (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), para 4 h. Use 10 mL para la escala de síntesis de 100 μmol.</li>
	<li>Precipitar el producto exfoliado mediante la adición de la mezcla de escote a 100 mL de éter de dietilo helada. Pasar a través de una unidad de filtración con un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de poro de 0,45 μm y lavado con éter dietílico helada de 20 mL.</li>
	<li>Recoger el péptido filtrado desde el papel de filtro y disolver 100 mg de péptido precipitado en 5 mL de agua destilada desionizada agua: acetonitrilo 1:1.</li>
	<li>Purificar por cromatografía líquida alta presión fase inversa (CLAR) en un HPLC semi-preparativa equipado con una columna porosa poliestireno divinilbenceno de grano tamaño 10 μm.
	<ol><li>Calentar previamente la columna y se mantiene a 50 ° C utilizando una columna de aparato de la calefacción. Se recogerán todas las fracciones principales utilizando un colector de fracciones automatizada aplicando un gradiente de 5% a 100% solvente B durante 25 min a 4 mL/min 
		Nota: A solvente es 0.1% TFA en el agua y el solvente B es 0.1% TFA en acetonitrilo 52.</li>
		<li>Monitorear el cromatograma a 220 nm, recoger los picos adecuados y analizar mediante LC-MS.</li>
	</ol></li> <li>Confirmar la pureza de marcha analítica fase ultra alta presión líquida cromatografía (UPLC) a 220 nm controlando con un Detector Ultravioleta pasando la muestra por una columna C18 analítica (grano tamaño 1.7 μm). Espectrometría de masas para confirmar el producto péptido. 
	Nota: La UPLC es acoplada a una espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) y el tándem cuadrupolo Detector.</li>
	<li>Liofilizar las fracciones correcta del péptido deseado en un matraz de fondo redondo, aplicando un vacío de 0.052 mbar, para un polvo mullido. Acoplar la bomba de vacío a una unidad de congelación mantenida indefinidamente a-78 ° C. tienda a-80 ° C,.</li>
	<li>Utilizar el péptido liofilizado para preparar una solución stock de 1 mM en una mezcla de acetonitrilo: DMF: agua de grado analítico en el 1:1:1 para los experimentos. Esta solución se puede conservar durante al menos 6 meses, como los péptidos no se agregan en esta solución.</li>
</ol> 2. Preparación de la mezcla de inyección <ol><li>preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) para la dilución de los péptidos liofilizados.</li>
	<li>Disolver el péptido a una concentración final de 20 μm en PBS. Preparar esta solución fresca. Mezcla bien y almacenar en hielo hasta la inyección. No exceda 30 min para evitar la agregación en solución.</li>
</ol> 3. Anestesia sistema <ol><li>Prepare la solución de los anestésicos, 0.1% etil-m-aminobenzoato methanesulphonate (MESAB), en agua de pescado regular de la circulación. Preparar la solución para la anestesia a una concentración final de 0.0025% (v/v).</li>
	<li>Quitar el número deseado de peces de los tanques en un recipiente de transporte con 5 L de agua del sistema.</li>
	<li>Mitad-llenar un plato de Petri (90 mm) con anestésicos de 40 mL de plástico. Utilizar este plato para las inyecciones.</li>
	<li>Incubar los peces en los anestésicos hasta que haya cesado el movimiento opercular.</li>
</ol> 4. Cerebroventricular microinyección <ol><li>preparación de aparatos de inyección <ol><li>preparar el vidrio capilares de inyección utilizando un extractor de aguja con los siguientes parámetros: calefacción de ciclo, 537, tirando ciclo, 250, velocidad, 1.5 s; tiempo, la Sra. 80</li> <li>hacer el ajuste de presión en la fuente de presión 25 psi.</li>
		<li>Configurar los parámetros de microinyectora para lo siguiente: Mantenga presión de 20 psi, presión de expulsión 10 psi; período valor 2.5 bloquea la Sra. valor 100</li>
		<li>Cargar el capilar de vidrio con la solución de la inyección. Introduzca el capilar de vidrio en el soporte de microinyección. Ajustar el ángulo de inyección de 45°. 
		Nota: Los protocolos más detallados pueden encontrarse como se describe en referencias 27 , 46.</li>
	</ol></li> <li>Llenan de un peces lugar en una nueva placa de Petri con solución para la anestesia (como en el paso 3.3).</li>
	<li>Mantener el pescado con las pinzas y Oriente para la inyección.</li>
	<li>Generar un corte con la punta de una aguja de 30 G en el cráneo en El tectum óptico donde se unen las dos placas laterales. No introduzca la punta en el tejido cerebral, esto causaría sangrado y daño. Ver referencias 27 , 45 , 46 para obtener más detalles.</li>
	<li>Introduzca el capilar de vidrio en la abertura.
	<ol><li>Usar la punta de la aguja y no penetran más de 1 mm a través del cráneo. Sigue aguantando el pescado e inserte la punta del vaso capilar a través del sitio de incisión.</li>
		<li>Orientar la punta del vaso capilar hacia el telencéfalo a un ángulo de 45°. Inyectar 1 μl de la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección.</li>
	</ol></li></ol> 5. Recuperación <ol><li>lugar los peces hacia un contenedor de transporte hasta que recupera. Conectar el recipiente para el agua de peces regularmente circulante para asegurar la calidad óptima de agua. 
	Nota: La recuperación debe tomar 1 minuto. Si tarda más, el pescado debe mantenerse en los anestésicos durante un tiempo más corto (esto debe de ser optimizado por el experimentador).</li>
</OL &gt; 6. Preparación de tejido y secciones <ol><li>esperar un período de tiempo antes de sacrificar a los peces. 
	Nota: Esto depende de la pregunta experimental. Deposición amiloidea puede verse tan solo 1 día después de la inyección.</li>
	<li>Sacrificar a los peces utilizando el método apropiado dependiendo de las normas éticas (por ejemplo, tratar a los peces con 0,1 M MESAB).</li>
	<li>Abrir el cráneo sobre El tectum óptico utilizando pinza puntiaguda en la parte dorsal y disecar la cabeza justo detrás de la aleta pectoral con un bisturí.</li>
	<li>Fijar las cabezas usando 2% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C. utilizar 3 mL de PFA por cabeza en un tubo de plástico con una tapa del tornillo de. 
	PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección personal cuando maneje PFA.</li>
	<li>Para crioprotección y descalcificación, lavarse la cabeza tres veces en 0.1M tampón fosfato (pH 7,4), transferencia en 20% sucrose/20% etilendiaminotetracético (EDTA) solución e incubar durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Para incrustar el tejido en la resina, de seccionamiento congelar las cabezas en la solución de sacarosa 7,5% gelatin/20% en moldes de histología plástica en hielo seco (aproximadamente 3-5 min para congelar un bloque). Almacenar las muestras a-80 ° C o seguir el siguiente paso (cryosectioning).</li>
	<li>Sección las cabezas en cryosections gruesa de 12 μm utilizando un criostato como descrito 28 , 42. Transferir los cryosections directamente sobre los portaobjetos de vidrio y conservarlo a-20 ° C para uso a largo plazo.</li>
</ol> 7. Tinción inmunohistoquímica y la microscopia Nota: realizar todos los pasos de incubación en una cámara humidificada. Y todos los pasos de lavado son de 10 minutos cada uno.
<ol><li>Secar las secciones durante 30 min a temperatura ambiente. Después de descongelar, lavar las secciones dos veces en PBS y una vez en PBSTx (PBS con 0,03% Tritón X-100).</li>
	<li>Incubar con el anticuerpo primario (anticuerpo anti-Aβ42; dilución 1: 500 en PBSTx) a 4 ° C durante la noche tras día, lavar una vez en PBS y dos veces en PBSTx.</li>
	<li>Incubar las secciones con el anticuerpo secundario (detección de fluorescencia junto, dilución 1: 500) junto con DAPI (1 μg/mL) en PBSTx por 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavado tres veces en PBSTx. Después del lavado final, montar el portaobjetos con un cubreobjetos usando glicerol de 70% de 100 μL.</li>
	<li>Adquirir imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal (por ejemplo con objetivo 20 X PL APO N.A. 0.7 con 488 rango de excitación y un filtro verde estándar; figura 2) 39.</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Los péptidos amiloides pueden modificarse para incluir variaciones de secuencia o varias etiquetas. Por ejemplo, se puede generar un péptido amiloide revuelto, y los péptidos pueden ser marcados con etiquetas fluorescentes en el N-terminal del extremo del péptido o etiquetados portador péptidos39. Del mismo modo, en el presente Protocolo, el péptido portador es el penetrar en la célula péptido TR debido a su eficacia para el transporte de carga profunda en el tejido cerebral del3...

AD es una enfermedad progresiva crónica caracterizada por la pérdida de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral1,2,3,4,5. Los sellos clásicos de neuropathological del anuncio son los depósitos de péptidos amiloides y formación de los ovillos enredos (NFTs)6. Las placas seniles, también conocido como placas amiloideas, están compuestas de péptidos amiloide-β (Aß) que forman estructuras de β-plisadas en el parénquima cerebral del5. La acumulación de Aβ42 en pacientes con EA tiene un papel temprano y crítico en la progresión de la enfermedad. Anuncio desencadena una cascada de eventos que llevan a disfunción sináptica y plasticidad deteriorada pérdida neuronal7,8,9,10.
El cerebro adulto del pez cebra teleósteos sirve como un excelente modelo para estudiar la regulación de la célula de vástago plasticidad11,12,13,14,15, 1617,de,18,19,20 y diversas enfermedades en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo AD21,22,23 ,24. Debido a una gran variedad de métodos experimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, estos estudios son informativos y factible. Pez cebra puede llenar el CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en parte mediante el uso de programas moleculares activados después de la pérdida neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Por lo tanto, establecer un modelo de enfermedad neurodegenerativa en el pez cebra puede ayudar a resolver las preguntas novela sobre biología Regenerativa de capacidad y células madre en cerebros vertebrados.
Recientemente, hemos desarrollado un modelo de la toxicidad del amiloide en cerebro de pez cebra adulto inyectando sintético Aβ42 péptidos (tabla 1)39. Esta inyección causa neurodegeneración fenotipos de patología del cerebro humano (p. ej., muerte celular, la activación microglial, degeneración sináptica y déficits de la memoria), que indica ese pez cebra puede ser utilizado para la obtención de neurodegeneración en cerebro de pez cebra, Aβ42 péptidos pueden ser detectados con los stainings de immunohistochemical y mecanismos moleculares de la regeneración en pez cebra adulto que CNS puede ser identificado39. En este protocolo, demostramos la inyección de péptidos sintéticos de amiloide en el cerebro de pez cebra con cerebroventricular inyección (CVMI) método27,39,45,46 para imitar la deposición amiloidea (figura 1). CVMI ofrece una forma novedosa de entregar los péptidos, que agregan a inyección como estructuras de β-hoja y ejercen toxicidad. Los péptidos se distribuyen uniformemente a través del cerebro, a la zona ventricular a lo largo del eje rostro caudal entero45. Además, este método permite analizar la respuesta morfológica y molecular de las NSPCs en cerebro de pez cebra adulto después de inclusiones amiloideas. Este tipo de estudios nos dará una idea para la reparación exitosa del cerebro en mamíferos. Nuestro método puede utilizarse para comprender el mecanismo molecular necesario de una respuesta exitosa regeneración después de los síntomas de AD-como para inducir la reposición de las neuronas perdidas y recuperación funcional.

<table><tbody><tr><td>Aminoácidos protegidos contra Fmoc</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)</td><td></td><td>Aminoácidos basados en Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS)</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de uronio (HBTU)</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)</td><td>Activador RL-1030</td><td></td></tr><tr><td>Oxyma</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)</td><td>RL-1180</td><td>Supresor de racemización</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)</td><td>SOL-003</td><td>Base</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)</td><td>SOL-004</td><td>Disolvente</td></tr><tr><td>N-metilmorfolina</td><td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Alemania</td><td>A12158</td><td>Base</td></tr><tr><td>1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, EE. UU.)</td><td>157260 ALDRICH</td><td>Activador</td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)</td><td>822299</td><td>Reactivo de desprotección Fmoc</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)</td><td>106050</td><td>Disolvente</td></tr><tr><td>Ácido fórmico (FA)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)</td><td>100264</td><td>Componente tampón para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>MERCK KGaA ( Darmstadt, Alemania)</td><td>808260</td><td>Reactivo de mezcla Clevage</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIS)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)</td><td>233781 ALDRICH</td><td>Clevage Reactivo de mezcla</td></tr><tr><td>Acetonitrilo (para UPLC/LCMS)</td><td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td><td>34967-1L</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Acetonitrilo (para HPLC)</td><td>VWR International Ltd, Inglaterra</td><td>83639.320</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR International Ltd, Inglaterra</td><td>23811.326</td><td>Disolvente para la precipitación de péptidos</td></tr><tr><td>Dithiotritol (DTT)</td><td>VWR International Ltd, Inglaterra</td><td>0281-25G</td><td>Clevage Reactivo</td></tr><tr><td>de mezcla TentaGel S RAM Resina de amida para pista Fmoc</td><td>Rapp Polymere GmbH (Tubinga, Alemania)</td><td>S30023</td><td>Fase sólida para</td></tr><tr><td>síntesis de péptidos SPPS Jeringas de 5 ml con filtros incluidos</td><td>Intavis AG (Colonia, Alemania)</td><td>34.274</td><td>Tubo de reacción para SPPS y para clevage del filtro de</td></tr><tr><td>politetrafluoroetileno (PTFE)</td> en fase sólida <td>Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)</td><td>11806-50-N</td><td>Filtración de péptidos precipitados Filtro</td></tr><tr><td>de jeringa de fluoruro de polivinilideno (PVDF)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td><td>KC78.1</td><td>Prefiltración para HPLC</td></tr><tr><td>Sintetizador de péptidos</td><td>Intavis, Colonia, Alemania</td><td>ResPep SL</td><td>Sintetizador automatizado de péptidos en fase sólida</td></tr><tr><td>Water Alliance HPLC</td><td>Waters, Milford Massachusetts, EE. UU.</td><td>Waters 2998, Waters e2695</td><td>Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) semipreparativa en fase</td></tr> <tr><td>inversaPolymerX, tamaño de perla 10&mu; m, 250x10 mm</td><td>Phenomenex Ltd. Alemania</td><td>00G-4328-N0</td><td>Columna de HPLC de poliestireno divinilbenceno poroso</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10, con filtro Milli-Q</td><td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU</td><td>. LCPAK0001</td><td>Sistema de purificación de agua</td></tr><tr><td>Unidad de filtración</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)</td><td>16307</td><td>Unidad de filtración para precipitación de péptidos</td></tr><tr><td>UPLC Aquity con detector UV</td><td>Waters, Milford Massachusetts, EE. UU.</td><td>M09UPA 664M</td><td>Fase inversa analítica ultra HPLC para LC-MS</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18, tamaño de cordón 1.7 &mu; m, 50x2.1 mm</td><td>Waters, Milford Massachusetts, EE. UU.</td><td>186002350</td><td>Columna analítica C18</td></tr><tr><td>Detector ACQUITY TQ</td><td>Waters, Milford Massachusetts, EE. UU.</td><td>QBB908</td><td>Espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS)</td></tr><tr><td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Alemania</td><td>16706, 101542</td><td>Liofilizador con bomba de vacío</td></tr><tr><td>Lector de placas Paradigm</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MESAB (metanosulfonato de etil-m-aminobenzoato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Aguja</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varía según el fabricante</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección Gillies</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501265</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de inyección</td><td>de vidrio World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de anillo neumático PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>; Guía de luz anular</td><td>Parkland</td><td>Scientific ILL-RLG</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr></tbody></table>

toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una debilitante enfermedad neurodegenerativa en la que la acumulación de amiloide tóxico-β42 (Aβ42) péptidos conduce a degeneración sináptica, inflamación, muerte neuronal y déficit de aprendizaje. Los seres humanos no pueden regenerar las neuronas perdidas en el caso de AD en parte debido a la deteriorada capacidad proliferativa de las células progenitoras neuronales (NSPCs) y reducción de la neurogénesis. Por lo tanto, terapias regenerativas eficaces también deben aumentar la proliferación y capacidad neurogénica NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) es un organismo regenerativo y podemos aprender los programas moleculares básicos que podríamos diseñar enfoques terapéuticos para hacer frente a AD. Por esta razón, fue necesaria la generación de un modelo de AD-como en el pez cebra. Con nuestra metodología, podemos introducir derivados sintéticos de Aβ42 péptido con capacidad penetrante de tejido en el cerebro del pez cebra adulto y analizar la patología de la enfermedad y la respuesta regenerativa. La ventaja sobre los métodos existentes o modelos animales es que pez cebra puede enseñarnos cómo un cerebro vertebrado puede regenerar naturalmente y así nos ayudan a tratar mejor las enfermedades neurodegenerativas humanas dirigiéndose NSPCs endógenas. Por lo tanto, el modelo de toxicidad del amiloide en el cerebro del pez cebra adulto puede abrir nuevas avenidas para la investigación en el campo de la neurología y la medicina clínica. Además, la ejecución simple de este método permite la evaluación experimental rentable y eficiente. Este manuscrito describe la síntesis y la inyección de péptidos de Aβ42 en cerebro de pez cebra.

HPLC se utiliza para purificar el péptido sintetizado y espectrometría de masas se ha utilizado para caracterizar los péptidos β amiloide purificada. La columna HPLC se calienta a 50 ° C para mejorar la separación de los péptidos Aβ y se recolectaron las fracciones. Para identificar el péptido sintetizado correctamente, se realizó análisis de espectrometría de masas para todas aquellas fracciones. El cromatograma UPLC muestra la pureza del compuesto. La fracción HPLC que produjo un pico e...

Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

El objetivo general de este método es sintetizar péptidos de beta amiloide 42 e inyectarlos en el cerebro de peces cebra adultos, con el fin de generar un modelo específico de dosis de amiloide como las observadas en la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ayudarnos a abordar preguntas importantes en el campo de la neurociencia, tales como el efecto de la toxicidad del amiloide sobre las células madre neurales y cómo podemos inducir una respuesta de rejuvenecimiento en estas condiciones perjudiciales. Las principales ventajas de esta técnica son que es fiable, reproducible y que los fenotipos que obtenemos recuerdan en gran medida a la enfermedad de Alzheimer en cerebros humanos.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la enfermedad de Alzheimer porque proporciona un modelo vertebrado natural, capaz de activar células madre neurales en condiciones de enfermedad; por lo tanto, el pez cebra puede enseñarnos cómo recuperar la neurodegeneración. Para preparar el péptido beta amiloide 42, cargue un sintetizador automático de péptidos con 500 miligramos de resina protegida con FMOC como fase sólida. Luego, cargue aminoácidos protegidos con FMOC disueltos e

modeling-amyloid-42-toxicity-neurodegeneration-adult-zebrafish

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, los embriones fertilizados de pez cebra se descorionan bajo un microscopio estereoscópico y luego se exponen a un inhibidor de la síntesis de colesterol, lo que lleva al desarrollo de rupturas de vasos sanguíneos y hemorragias cerebrales en las larvas. Las larvas hemorrágicas, identificables por manchas rojas distintivas, se separan posteriormente bajo un microscopio para su posterior análisis.

Modelado de hemorragia inducida por fármacos en larvas de pez cebra

Este video muestra el procedimiento de inyectar péptidos amiloides monoméricos en el prosencéfalo de un pez cebra adulto para generar toxicidad amiloide, imitando el daño neuronal observado en la enfermedad de...

Establecimiento de un modelo de enfermedad de Alzheimer en el cerebro de pez cebra mediante la inyección de péptido amiloide

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Las manipulaciones dirigidas para causar estrés dirigido o muerte en células individuales han sido relativamente difíciles de lograr. Aquí, se describe un enfoque de ablación de resolución de una sola célula para estresar selectivamente y matar células individuales en cultivos celulares y animales vivos basado en un láser UV confocal estándar.

Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía

Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.

Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

Presentamos una cámara conductual diseñada para evaluar el rendimiento cognitivo. Proporcionamos datos que muestran que una vez adquirido, el pez cebra recuerda la tarea 8 semanas después. También mostramos que el pez cebra hiperglucémico ha alterado el rendimiento cognitivo, lo que indica que este paradigma es aplicable a los estudios que evalúan la cognición y la memoria.

La tarea de comportamiento de elección de tres cámaras utilizando el pez cebra como sistema modelo

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

El aprendizaje y la memoria son métricas potentes en el estudio de los deterioros cognitivos del desarrollo, dependientes de enfermedades o inducidos por el medio ambiente. La mayoría de las evaluaciones cognitivas requieren equipo especializado y amplios compromisos de tiempo. Sin embargo, el ensayo de caja de transporte es una herramienta de aprendizaje asociativo que utiliza una caja de gel convencional para una evaluación rápida y confiable de la cognición del pez cebra adulto.

Shuttle Box Assay como herramienta de aprendizaje asociativo para la evaluación cognitiva en estudios de aprendizaje y memoria utilizando pez cebra adulto

Este protocolo demuestra la microinyección de lipopolisacárido en la región ventricular cerebral en un modelo larvario de pez cebra para estudiar la respuesta neuroinflamatoria resultante y la neurotoxicidad.

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

El objetivo del protocolo actual es esbozar los pasos necesarios para establecer y utilizar un ensayo de preferencia social para el pez cebra adulto y demostrar que puede utilizarse para caracterizar los defectos sociales inducidos por el etanol.

Modelado de trastornos del espectro alcohólico fetal en pez cebra para caracterizar el impacto de un entorno embrionario adverso en el comportamiento social adulto

Este protocolo proporciona un método estandarizado y de alto rendimiento de cribado de compuestos utilizando pez cebra in vivo para cuantificar la pérdida de neuronas dopaminérgicas y los déficits conductuales locomotores, permitiendo un cribado eficiente de compuestos neuroprotectores.

Fenotipado in vivo de la neurodegeneración dopaminérgica en larvas de pez cebra mediante análisis conductual e imágenes de alto contenido

Aprende a sintetizar péptidos amiloide-β42 e inyectarlos en cerebro de pez cebra adulto para modelar la enfermedad de Alzheimer. Este método permite estudiar la toxicidad amiloide sobre células madre neuronales y respuestas de rejuvenecimiento.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Explorar más videos