Name: Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a realizar hepatectomía parcial e injerto intrasplénico de hepatocitos en ratones NOD.SCID. Este protocolo demuestra técnicas quirúrgicas para investigar terapias celulares en modelos de insuficiencia hepática aguda.

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Este trabajo fue apoyado por la concesión de la base recibida del Departamento de biotecnología, gobierno de la India en el Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. Dirección actual del Dr. Bhattacharjee es la división de Gastroenterología, Hepatología y nutrición, Hospital Los Ángeles de los niños.

En este protocolo los procedimientos han sido aprobados por el Comité institucional de ética Animal del Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. El número de serie de referencia de la aprobación es AICE #319/13.
Nota: Hay excelentes recursos en procedimientos de cirugía general20 y protocolos específicos para roedores cirugía21. Para aquellos haciendo cirugía animal por primera vez, se recomienda ampliamente practicar procedimientos quirúrgicos en maniquíes antes de operar a los animales.
1. preparación
<ol><li>Antes del experimento, se mantenga estéril tamponada de fosfato salino (PBS) o solución salina preparada.</li>
	<li>Montar un kit de cirugía contiene tijeras, pinzas dentadas, pinzas de tejido, algodón, bastoncillos de algodón, hilos de nylon y portaagujas diferentes micro. Autoclave el kit de cirugía. Debe tener especial cuidado si un GUIÑO inmuno-comprometidos. Ratón SCID está incluido en el protocolo.</li>
	<li>Realizar el procedimiento experimental completo, desde la preparación hasta el final de la cirugía, en la bio-seguridad clase I gabinete.</li>
	<li>Pesar un GUIÑO. Ratón SCID de 6-8 semanas antes de la cirugía. Ratones que pesen entre 14-18 g son utilizados en este estudio.</li>
	<li>Afeitado de la región abdominal central e hipocondríaco superior del ratón con el recortador de vellos. Aplicar el cabello eliminación crema uniformemente en toda la región con una espátula para eliminar completamente el vello recortado. Quite los pelos con la ayuda de un trozo de algodón estéril húmedo después de 2-5 minutos.</li>
	<li>Colocar el ratón en la cámara de isoflurano y abrir la válvula de la botella de oxígeno. Mantener el flujo de oxígeno a razón de 4 L/min y la vaporización de isoflurano en el 4% para inducir anestesia.<ol>
<li>Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado correctamente pellizcando suave del dedo del pie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque un tablero de cirugía dentro de una bioseguridad gabinete. Coloque el animal en el tablero de la cirugía, tal que la porción ventral del ratón es hacia arriba y la porción anterior del ratón se coloca dentro del cono de nariz conectado a la fuente de isoflurano y el oxígeno.</li>
	<li>Reducir la vaporización de isoflurano al 2% y mantener durante todo el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Desinfectar la piel del ratón y esterilizar limpiándolo con algodón estéril empapado etanol al 70%.</li>
</ol>2. quirúrgico
<ol><li>
Hepatectomía parcial
	<ol>
<li>Realizar una incisión transversal de aproximadamente 1 cm en la piel justo debajo del esternón, perpendicular en el proceso de xiphoid y paralelo a la caja torácica, con la ayuda de tijeras de operación recta.</li>
		<li>Separe suavemente la piel atada con la capa del músculo abdominal en las cercanías de la zona Incisa con puntas de algodón estéril humedecido para distinguir entre la piel y la capa de músculo abdominal o fórceps. Empape la región intradérmica con PBS utilizando puntas de algodón estéril para evitar la desecación.</li>
		<li>Exponga el área del lóbulo izquierdo suavemente haciendo una incisión transversal a través de la capa peritoneal justo por debajo del xifoides. Utilizar dos puntas de algodón humedecido para exponer y levantar el lóbulo izquierdo del hígado.</li>
		<li>Una de las puntas de algodón en el lado abdominal del corte y otra punta de algodón en el lado del diafragma. Suavemente presione la punta a hacia el diafragma y dar un impulso corredero por el otro extremo para levantar el lóbulo izquierdo del hígado.</li>
		<li>Deslice un hilo de nylon con un bucle el lóbulo izquierdo levantado y deslice el lazo hacia la base del lóbulo izquierdo cerca del hilio con la ayuda de los consejos micro pinzas o algodón. Presione suavemente el bucle de hilo de nylon a la base del lóbulo izquierdo.</li>
		<li>Atar dos extremos del hilo de nylon en la parte superior del lóbulo izquierdo con un Portaagujas de microcirugía y las micro pinzas. Hacer dos nudos adicionales en el otro lado.</li>
		<li>Disecan hacia fuera del lóbulo atado con la ayuda de tijeras. No intente cortar muy cerca del hilo. En caso de que el procedimiento dura más de 5 min, mantener la cavidad peritoneal y órganos húmedos con PBS estéril para evitar la desecación debido a la pérdida de líquidos.</li>
		<li>Coser el peritoneo utilizando sutura continua sutura Catgut 4-0. Posteriormente, cerca de la piel por la sutura discontinua lo antes posible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasplante de la célula Nota: Los hepatocitos expresan GFP fueron aislados de ratones transgénicos GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), según el procedimiento descrito por Lee et al. 22 y Shen et al. 23 hepatocito-como las células (NeoHep) de origen humano diferenciado de monocitos24 también fueron utilizadas para el trasplante. Sin embargo, las células derivadas de otras fuentes pueden utilizarse también en el protocolo.<ol>
<li>Suspender las células viables 0,2 millones en alrededor de 50 μl de medio de modificado Dulbecco de Iscove (IMDM) y aspirar en una jeringa de insulina 1 mL con aguja de 30 G. Mantenga la jeringa fría puesta en hielo.</li>
		<li>Colocar el ratón de manera que la parte lateral izquierda se enfrenta hacia la persona que realiza la cirugía. Identificar el área esplénico y transversalmente disecar la piel cerca de la región hipocondríaco, seguida de una corta incisión a través de la capa peritoneal para exponer el bazo.</li>
		<li>Levante el bazo suavemente y mantener que fuera de la cavidad con la ayuda de dos PBS humedecido puntas de algodón.</li>
		<li>Sostenga el bazo cuidadosamente con las dos puntas de algodón en una mano y coloque la aguja de la jeringa vertical exactamente en el bazo. Perforar el bazo y empuje la aguja muy lentamente en el interior; la aguja no debe recibir más de 2 mm.</li>
		<li>Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para inyectar las células en el bazo. Después del trasplante, mantener estable la aguja de la jeringa y retire lentamente desde el bazo para evitar sangrado o pérdida de las células.</li>
		<li>Después de colocar el bazo hacia la cavidad peritoneal con las puntas de algodón, cerca de la capa peritoneal continua de sutura con una sutura de Catgut 4-0. Coser la piel discontinuo con la misma sutura. Evitar el uso de clips de herida para el cierre de la piel; en cambio, cerrarla por una sutura de 4-0. Los clips de herida restringen el movimiento natural del ratón, y a menudo clips soltarse y salen rápidamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. postoperatorio cuidado
<ol><li>Tras el cierre de la piel, limpie los alrededores de los sitios de sutura con solución de yodo (betadine) usando una punta de algodón estéril.</li>
	<li>Inyectar una dosis de antibiótico cefotaxima como 600 mg/kg de peso (típicamente 12 mg cefotaxima en 100 μl de solución salina y el ratón) corporal por vía intraperitoneal utilizando jeringa de 1 mL.</li>
	<li>Dar dosis diarias de analgésico Meloxicam 1 mg/kg peso corporal (típicamente 12 μg Meloxicam en 100 μl de solución salina y el ratón) a los animales por vía intraperitoneal, hasta tres días después de la cirugía.</li>
	<li>Después de la terminación de la cirugía, detener el flujo de gas isoflurano y volver a colocar el ratón en la jaula individualmente ventilada.</li>
</ol>4. euthanization y caracterizaciones
<ol><li>Después de las variables experimentales (1 día y 10 días post cirugía), eutanasia a los ratones según las pautas del ética animal institucional.</li>
	<li>Recoger la sangre por hemorragia terminal los animales, pinchar el plexo terminal ocular.</li>
	<li>Aislar el suero de la sangre.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hepatectomía parcial es una técnica establecida para investigar la regeneración hepática y hepatectomía excesiva se divulga para imitar el modelo de AHF. Entre los modelos animales de AHF, roedores, especialmente ratones, son el modelo más investigado. Para obtener un modelo de daño hepático en ratones, hasta una hepatectomía del 70% se ha divulgado con una buena supervivencia tasa25,26. Sin embargo en nude y otro ratón inmunodeficiente, una hepatectomía del 70% ...

Actualmente, trasplante de hepatocitos es propuesto como una alternativa al trasplante de órgano entero para tratar a los pacientes tener severos trastornos hepáticos. Se cree que puede superar a los pacientes de trasplante de órgano entero1. Además de los hepatocitos alogénicos2, hepatocitos xenogénica3 y hepatocitos derivados de las células4 también están siendo investigados en modelos animales. En este contexto, el engraftment y autoguiado hacia el blanco potencial de las células trasplantadas en el receptor es un criterio importante para la terapia celular basada en la insuficiencia hepática aguda (AHF).
Para investigando el trasplante de hepatocitos o de hepatocitos como las células5, AHF se crea en un modelo animal por quirúrgico6 o procedimientos farmacológicos7 , seguidos de transplante de células. Para hacer un modelo animal de la AHF por reactivos farmacológicos, muchas hepatotoxins como la d-galactosamina8, acetaminofén9, tetracloruro de carbono10, tioacetamida11, concanavalina A12, lipopolysaccharide13 , etcetera., se han utilizado. De esta lista, cada reactivo genera un conjunto de características únicas para AHF, pero lamentablemente no solo reactivo imita el humano AHF. Por otra parte, el AHF inducido por hepatotoxins lleva mucho tiempo, que pone a los animales bajo estrés crónico, y son difíciles de obtener resultados reproducibles.
Por otra parte, la intervención quirúrgica de hepatectomía parcial (PHx) es dependiente de la habilidad y la reproducibilidad es fácil de obtener después de desarrollar las habilidades necesarias. Para inducir AHF por solo la intervención quirúrgica, la resección de más del 70% del hígado se requiere; sin embargo, menos de una hepatectomía del 70% todavía puede ser utilizada para estudiar el engraftment y proliferación de trasplantar las células en el hígado para analizar su capacidad terapéutica en daño hepático14. El trasplante de hepatocitos han sido realizadas post hepatectomía por el peritoneo15, cola vena16, vena hepática17o el18del bazo. Actualmente, la infusión de la vena hepática y intrasplenic trasplante de hepatocitos son los procedimientos preferidos, ya que son fáciles de reproducir.
En este trabajo hemos descrito un procedimiento de una hepatectomía parcial del 30% en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/J) ratones en el que el lóbulo izquierdo del hígado es suprimido. Es seguida por el trasplante de hepatocitos de ratón (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expresando GFP 0,2 millones así como origen humano NeoHep19 en el bazo. Este procedimiento conduce al engraftment de células trasplantadas en el hígado. Este procedimiento es menos invasivo y una técnica mínimamente dolorosa.

<table><tbody><tr><td>Sistema de anestesia gaseosa</td><td>Ugo Basile; Italia</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Báscula</td><td>Goldtech ; Gabinete</td> de seguridad biológica de <td>adquisiciones locales</td>de la India <td></td></tr><tr><td>(Clase I)</td><td>Kartos international; &nbsp; Recortadora</td> de pelo <td>de adquisición local</td>de la India <td></td></tr><tr><td></td><td>Panasonic; &nbsp; Japón &nbsp;</td><td>ER-GY10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tijera de operación recta con cuchillas afiladas / afiladas</td><td>Major Surgicals; Pinzas</td><td>de adquisición local</td>de la India <td></td></tr><tr><td>con dentados quirúrgicos</td><td>mayores; Adquisición</td><td>local de</td>la India <td></td></tr><tr><td>Micro portaagujas&nbsp; recto y curvo&nbsp;</td><td>Merciano ; &nbsp; Inglaterra &nbsp;</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 1 ml con 30G *5/16 agujas&nbsp;</td><td>Furgoneta Dispo; Jeringa India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 1 ml con 26 G * 1/2 aguja</td><td>BD ; EE. UU.</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Hilos de nylon&nbsp; &nbsp;</td><td>poderoso; India</td><td></td><td>(1-0) Adquisiciones locales</td></tr><tr><td>MERSUTURAS 4-0 Sutura quirúrgica esterilizada con aguja</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, India</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>TRUGUT 76 cm 4-0 sutura quirúrgica absorbible</td><td>Suturas India Pvt. Ltd; India</td><td>SN 5048</td><td>Sutura quirúrgica con aguja esterilizada Catgut Brotes de algodón crómico</td></tr><tr><td></td><td>hisopos puros Pvt Ltd ; &nbsp; Cinta</td> quirúrgica <td>de adquisición local</td>de la India <td></td></tr><tr><td></td><td>3M India ; India</td><td>1530-1</td><td>Micropore Cinta quirúrgica</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Histo-Line Laboratories, Italia</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; </td> Microscopio de barrido láser confocal estadounidense <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss; Alemania &nbsp;</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo brillante</td><td>Olympus, Japón</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Analizador automatizado</td><td>Tulip, Alto Santracruz, India</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Analizador bioquímico para pruebas funcionales hepáticas</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD ; EE. UU.</td><td>BD FACSverse</td><td>Evaluación de la presencia de células post trasplante</td></tr><tr><td>Veet crema depilatoria&nbsp;</td><td>Reckitt Benckiser , India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FORANE</td><td>Abbott ; Isoflurano de EE. UU</td><td></td><td>. USP 99.9%&nbsp;</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>AlKem ; India</td><td></td><td>cefotaxima sodio inyección</td></tr><tr><td>de povidona solución de yodo &nbsp;</td><td>Ganar-Medicare; &nbsp; India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine Paraformaldehído</td><td>Himedia; India</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US</td><td>12200-036</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma ; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura; US</td><td>25608-930</td><td>O.C.T. compuesto</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Himedia; India</td><td>MB 097</td><td></td></tr><tr><td>anti-albúmina cabra policlonal</td><td>Thermo Scientific, Pierce, EE. UU.</td><td>PA126081</td><td></td></tr><tr><td>anti-conexina 32/GJB1 Abcam policlonal</td><td>, Reino Unido</td><td>ab64609-500</td><td></td></tr><tr><td>antiGFP conejo policlonal&nbsp;</td><td>Biotecnología de Santa Cruz; US</td><td>SC 8334</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 burro anti-cabra</td><td>&nbsp; Sondas moleculares, Thermo Fisher Scientific; &nbsp; US</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-ovejas</td><td>&nbsp; Sondas moleculares, Thermo Fisher Scientific; &nbsp; US</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 pollo anti conejo</td><td>&nbsp; Sondas moleculares, Thermo Fisher Scientific; &nbsp; US</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti conejo IgG HRP</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; EE. UU.</td><td>65-6120</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ki67 anticuerpo</td><td>abcam, Reino Unido</td><td>ab15580</td><td></td></tr><tr><td>Solución de desenmascaramiento de antígenos, base de ácido cítrico</td><td>Laboratorios de vectores, EE. UU.</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond montante antidecoloración</td><td>Tecnologías de vida, Thermo Fisher scientific; US</td><td>P36966</td><td></td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Sistema Clínico de Coral, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIT SGPT (ALAT)</td><td>Sistema Clínico de Coral, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Fosfatasa Alcalina (DEA)</td><td>Sistema Clínico de Coral, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de Hematoxilina, Sigma de Mayer</td><td>; Solución de</td> eosina <td>Y MHS16</td><td></td>de EE. UU</tr><tr>., Sigma<td>alcohólico</td><td>; Montaje</td> DPX <td>de HT110132</td><td></td>de EE. UU</tr><tr><td>.&nbsp;</td><td>sigma; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Melonex (Analgésico)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td><td></td><td>Inyección de Meloxicam &nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de sustrato líquido mejorado DAB tetraclorhidrato Sigma</td><td>; </td><td>D3939</td><td></td> de EE. UU</tr></tbody></table>.

intrasplenic trasplante de hepatocitos después de hepatectomy parcial en cabeceo. ratones de scid

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Hepatectomía parcial es un método versátil y reproducible para el estudio de la regeneración hepática y el efecto de la terapéutica celular basado en diversas condiciones patológicas. Hepatectomía parcial también facilita el engraftment aumento y proliferación de las células trasplantadas por neovascularización aceleración y migración de células hacia el hígado. Aquí, describimos un protocolo simple para realizar 30% hepatectomía y trasplante de células en el bazo de un no obeso diabético grave había combinado NOD inmunodeficiente. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratón.
En este procedimiento, se realizan dos pequeñas incisiones. La primera incisión es para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, y otra pequeña incisión para exponer el bazo para el intrasplenic trasplante de células. Este procedimiento no requiere ninguna habilidad quirúrgica especializada y puede realizarse en 5-7 minutos con menos estrés y dolor, una recuperación más rápida y mejor supervivencia. Hemos demostrado el trasplante de hepatocitos aislados de una proteína fluorescente verde (GFP) expresando su ratón (transgénicos C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), así como los hepatocitos como células de origen humano (NeoHep) en hepatectomized parcialmente NOD. Ratones de SCID.

Proliferación de hepatocitos después de hepatectomy parcial 30%: La proliferación de hepatocitos en el resto de hígado después de hepatectomy 30% fue examinada por inmunohistoquímica (IHC) para un marcador de proliferación celular, Ki-67. Un día post hepatectomía, los ratones fueron sacrificados, los lóbulos de hígado restantes fueron suprimidos y se obtuvieron secciones de la parafina. Las secciones fueron teñidas con anticuerpos Ki-67, seguido por etiquetado con rábano peroxidasa (HRP) conjugado de ant...

Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Para tratar pacientes con insuficiencia hepática aguda, el trasplante de hepatocitos es una alternativa al trasplante de órgano completo. La hepatectomía parcial se utiliza como técnica para inducir la IHA. Además, también se emplea para investigar el injerto y la proliferación celular durante la terapia basada en células.El ratón es uno de los modelos más estudiados para realizar hepatectomía con estos objetivos. En este video mostraremos un procedimiento de hepatectomía parcial seguido de trasplante de hepatocitos en el bazo de un ratón NOD. SCID.Antes de comenzar, asegúrese de contar con la aprobación necesaria del comité de ética animal correspondiente para realizar el experimento. En este procedimiento realizaremos dos incisiones pequeñas. La primera incisión es para la hepatectomía parcial, que tendrá aproximadamente un centímetro de longitud y se hará justo debajo del apéndice xifoides para exponer el hígado.Para trasplantar las células, se realiza otra incisión más pequeña en la porción lateral izquierda para exponer el bazo del animal. Las ventajas son que provoca menos trauma y dolor al animal, una recuperación más rápida y una supervivencia cercana al cien por ciento. Además, este procedimiento no requiere habilidades quirúrgicas especializadas y puede completarse rápidamente en cinco a siete minutos.En este video demostraremos el trasplante de células similares a hepatocitos denominadas NeoHep y hepatocitos aislados de un ratón transgénico GFP en un ratón NOD. SCID sometido a hepatectomía parcial. El procedimiento no restringe el tipo de células para el trasplante.Todas las herramientas quirúrgicas y el PBS fueron debidamente autoclavados y mantenidos listos previamente a la cirugía. Pese el ratón. Se incluyen en este procedimiento ratones NOD.SCID de seis a ocho semanas de edad que pesan entre catorce y dieciocho gramos.Afeite la región central, superior e izquierda del abdomen del ratón. Para eliminar el vello recortado, aplique una crema depilatoria sobre la zona afeitada. Espere de cuatro a cinco minutos y retire suavemente el vello.Abrir la válvula del cilindro de oxígeno. Colocar el ratón en la cámara de isoflurano. Ajustar el flujo de oxígeno a cuatro litros por minuto.Ajuste la vaporización de isoflurano al cuatro por ciento para inducir la anestesia. Asegúrese de que el ratón haya sido anestesiado adecuadamente mediante un suave pellizco en los dedos de los pies. Coloque una tabla quirúrgica dentro de una cabina de seguridad biológica.Coloque el animal sobre la tabla de cirugía de modo que la parte ventral del ratón quede hacia arriba y la parte anterior del ratón se coloque dentro del cono nasal conectado al suministro de isoflurano y oxígeno. Reduzca la vaporización de isoflurano al dos por ciento para mantener la anestesia. Desinfecte la piel pasando un algodón estéril empapado en etanol al setenta por ciento.Realice una incisión transversal de aproximadamente un centímetro en la piel justo debajo del esternón, perpendicular al apéndice xifoides y paralela a la caja torácica. Separe suavemente la piel y el peritoneo cerca de la incisión. Haga una incisión transversal a través de la capa peritoneal justo debajo del apéndice xifoides para exponer el lóbulo izquierdo del hígado.Se utilizarán dos hisopos de algodón humedecidos. Coloque uno de los hisopos en el lado abdominal del corte y coloque otro hisopo en el lado del diafragma. Ahora presione suavemente el hisopo colocado hacia el diafragma y realice un empujón deslizante con el otro hisopo para levantar el lóbulo izquierdo del hígado.Coloque un lazo de hilo de seda en la base del lóbulo lateral izquierdo cerca del hilio hepático utilizando la pinza de disección microquirúrgica. Después de cerrar ligeramente el nudo, deslice el hilo de seda todo lo posible hacia la base del lóbulo hepático. Apriete el nudo y coloque dos nudos adicionales en el otro lado.Corte el lóbulo atado utilizando una tijera de microcirugía. Esta imagen muestra la parte restante del lóbulo izquierdo tras la resección. Suture el peritoneo mediante sutura continua con una sutura absorbible de catgut cero cuatro.Cierre la piel mediante sutura discontinua o interrumpida utilizando el mismo catgut absorbible de calibre cuatro cero. Aplique Betadine en la zona cercana a las suturas. Mantenga los hepatocitos o NeoHep suspendidos en cincuenta microlitros de IMDM preparados en una jeringa de insulina de un mililitro con aguja de calibre veintinueve.Coloque el ratón de manera que la parte lateral izquierda quede hacia arriba. Identifique la región del bazo y seccione transversalmente la piel. Haga un corte de dos a tres milímetros en la capa peritoneal para exponer el bazo.Coloque el bazo entre dos hisopos de algodón húmedos y levántelo suavemente. Introduzca la aguja suavemente en la corteza del bazo y libere la suspensión celular dentro del bazo. Cierre el peritoneo mediante sutura continua con hilo de calibre cuatro ceros y cierre la piel mediante sutura discontinua.Aplique Betadine sobre las suturas. Inyecte cien microlitros de solución salina por vía intraperitoneal que contenga doce miligramos del antibiótico Cefotaxima. Inyecte cien microlitros de solución salina por vía intraperitoneal que contenga doce microgramos del analgésico Meloxicam.Esto debe administrarse diariamente durante tres días posteriores a la cirugía. Cierre el vaporizador de isoflurano y coloque el ratón en la jaula. El animal recuperará la conciencia en cuestión de segundos.La proliferación de hepatocitos en el hígado tras veinticuatro horas de hepatectomía del treinta por ciento se examinó mediante tinción inmunohistoquímica de secciones hepáticas con Ki-67, que es un marcador de proliferación celular. Después de la tinción, estas secciones se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-Ki-67 para su detección, y se utilizó diaminobencidina como sustrato para desarrollar un color marrón. El núcleo se contratinó con hematoxilina.En esta imagen, las células de color marrón son hepatocitos proliferativos positivos para Ki-67. Diez días después del trasplante, se sacrificó al ratón y se examinó el hígado. Aquí se muestra una imagen representativa.De hígado regenerado se resecaron el lóbulo lateral derecho, el lóbulo medial derecho y los lóbulos mediales izquierdos, y se obtuvieron secciones de cinco micrones. Estas secciones se tiñeron con anticuerpo primario policlonal de conejo anti-GFP y anticuerpos secundarios Alexa Fluor 594 anti-conejo. El núcleo se contratiñó con DAPI.Esta imagen muestra la migración de hepatocitos que expresan la proteína verde fluorescente, visible como roja. Cuando se trasplantaron células similares a hepatocitos de origen humano denominadas NeoHep, observamos la expresión de Albúmina humana y de Conexina 32 humana en secciones hepáticas de ratón hepatectomizado receptor. Diez días después de la cirugía, el análisis bioquímico de enzimas hepáticas secretadas en suero confirmó que los niveles de aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa y fosfatasa alcalina se restablecieron a valores normales.De manera similar, el examen histológico de secciones de hígado mediante tinción con hematoxilina y eosina no mostró anomalías diez días después de la cirugía, lo que indica una recuperación adecuada del hígado. Es importante tomar algunas precauciones. Intente colocar el nudo del hilo de nailon en la base del lóbulo hepático.No olvide hacer dos nudos firmes adicionales en el lado opuesto y no intente cortar demasiado cerca del hilo. Para trasplantar células en el bazo, introduzca la aguja exactamente en posición vertical y no debe penetrar más de dos milímetros. Para cerrar la piel, evite usar grapas quirúrgicas.En cambio, ciérrelo con una sutura de cuatro ceros. Los clips para heridas restringen el movimiento natural del ratón y, a menudo, se aflojan y se salen en poco tiempo. Después de devolver al animal a la jaula, puede colocar algunos trozos de hojuelas de maíz estériles en la jaula y proporcionar agua estéril con cinco por ciento de glucosa.Si no tiene experiencia previa en cirugía animal, practique por separado la hepatectomía parcial y el trasplante en ratones inmunocompetentes normales y luego realice ambos procedimientos en un solo animal. Realice los procedimientos en ratones inmunodeficientes NOD. SCID únicamente después de alcanzar una tasa de supervivencia del cien por ciento en ratones inmunocompetentes.

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Medicina

El trasplante de células madre neurales (NSC) en la médula espinal de ratones con desmielinización establecido se detalla. La preparación de los comités directivos nacionales, la laminectomía de vértebra torácica 9 (T9), y el trasplante de NSCs se perfila, junto con la atención pre y post-operatorio de los ratones.

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

Aquí, presentamos un nuevo modelo de hígado de ratón humanizado generado en ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID tras el trasplante de células madre hepáticas humanas inmaduras y expandibles.

Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

Aquí, presentamos un nuevo método para la resección parcial del lóbulo izquierdo hepático en ratones neonatales (día 0). Este nuevo protocolo es adecuado para el estudio de la lesión del higado aguda y la respuesta de lesiones en el ámbito neonatal.

Hepatectomía parcial lobulado: Un modelo quirúrgico para regeneración hepática morfológico

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Este es un modelo valioso para probar nuevos tratamientos para la hipercolesterolemia.

Un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar con hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

En este protocolo, discutimos la implementación de un modelo de trasplante hepático ortotópico (OLT) exitoso en ratones. Además, también se discuten los adyuvantes para analizar más a fondo la permeabilidad del aloinjerto después de una OLT exitosa en un ratón, específicamente utilizando exploraciones de microtomografía computarizada (microCT).

Trasplante hepático ortotópico exitoso en ratones mediante angiografía por microtomografía computarizada

El modelo murino de hepatectomía parcial 2/3 (66%) está bien descrito en la literatura, pero rara vez se han utilizado hepatectomías más extendidas que imitan el síndrome de tamaño pequeño después del trasplante hepático. Describimos un procedimiento de hepatectomía extendida del 78% en un modelo de ratón que resulta en aproximadamente un 50% de letalidad postoperatoria en ratones sanos.

Hepatectomía extendida al 78% en un modelo quirúrgico de ratón

Aprenda a realizar hepatectomía parcial e injerto intrasplénico de hepatocitos en ratones NOD.SCID. Este protocolo demuestra técnicas quirúrgicas para investigar terapias celulares en modelos de insuficiencia hepática aguda.

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

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