Name: Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprende a identificar cuantitativamente componentes del microambiente tumoral en glioblastoma mediante inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ. Este protocolo permite analizar muestras de pacientes y determinar ratios celulares relevantes.

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Los autores agradecen a los Dres. Fahad Bafakih y Jim Mandell para la adquisición e identificación de muestras de pacientes, Garrett F. Beeghly para la ayuda con inmunohistoquímica, y el Biorepository and Tissue Research Facility, el Centro de Investigación Cardiovascular Histology Core y el Biomolecular Analysis Facility de la Universidad de Virginia para asistencia con Adquisición de muestras, inmunohistoquímica e imágenes.

Este protocolo identifica los componentes celulares en las muestras fijadas con formalina fijadas en parafina (FFPE), como es típico para las muestras clínicas bancadas. La inclusión de parafina permite el mejor mantenimiento de la morfología celular y de los tejidos, así como una mejor longevidad de las secciones. Las muestras utilizadas para este análisis se accedieron a través de la Universidad de Virginia Biorepository y Tissue Research Facility. Las muestras de pacientes fueron seleccionadas por un neuropatólogo basado en un diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grado IV de la OMS) que había completado resecciones tumorales en la Universidad de Virginia entre 2010 y 2013, y fueron de-identificados antes de este análisis [ 11] . 1. Desparafinación y Rehidratación de Muestras de FFPE NOTA: Esta parte del protocolo es específica para las muestras de FFPE. Mientras que las muestras embebidas en parafina pueden ser más útiles para este análisis debido a la preservación de células y tMorfología de la cuestión, este análisis también se puede hacer con secciones congeladas. Si se utilizan secciones congeladas, esta porción puede omitirse y proceder directamente a la inmunohistoquímica cromogénica. <ol><li> Realizar los siguientes lavados durante 5 min cada uno: Xileno, Xileno, Etanol al 100%, Etanol al 100%, Etanol al 95%, Etanol al 95%, Etanol al 70%, Agua desionizada, Agua desionizada </li></ol> 2. Recuperación de antígenos NOTA: Esta parte del protocolo es necesaria para romper los puentes de metileno formados durante la fijación de formalina de las muestras de FFPE y exponer los sitios de antígeno para detectar anticuerpos. <ol><li> Diluya la solución de desenmascaramiento del antígeno de alto pH basada en Tris en la recomendación del fabricante en agua destilada. </li><li> Realizar la recuperación de antígeno mediada por calor utilizando un microondas. Otras formas de recuperación mediada por calor (tales como olla a presión, vapor de verduras, o agua hirviendo) también serían suficientes. <ol><li> Añadir la solución de desenmascaramiento diluida en un recipiente no sellable para microondasbuque. Coloque los portaobjetos en el recipiente. Coloque los portaobjetos en el microondas. </li><li> Hervir durante 20 min a alta potencia. Controle los niveles de líquido para la evaporación y rellene con agua destilada según sea necesario. </li></ol></li><li> Dejar enfriar las muestras en solución durante 1 h a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Inmunohistoquímica cromogénica <ol><li> Esboce la muestra de tejido con una pluma hidrófoba para minimizar el volumen de reactivos necesarios para cubrir la muestra. NOTA: Asegúrese de mantener las muestras de tejido hidratadas y no deje que se sequen, ya que esto afectará la eficacia de la tinción. </li><li> Pipetar suficiente solución de permeabilización (solución salina tamponada con Tris (TBS) + Triton-X al 0,01%) para cubrir la muestra de tejido (típicamente alrededor de 100 - 200 μl). </li><li> Retire y deseche la solución y repita el paso 3.2. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente con solución de bloqueo (suero de caballo al 2,5% + solución de permeabilización). </li><li> Incubar las muestras durante la noche a 4 ºC con anticuerpos primarios diluidosEn la solución de bloqueo. NOTA: Todos los anticuerpos primarios usados ​​aquí se diluyen a 1: 200, pero las diluciones óptimas se pueden determinar usando diluciones en serie comenzando con la recomendación del fabricante. Información detallada sobre anticuerpos utilizados en este protocolo se publicó anteriormente [ 11] . </li><li> Detectar los anticuerpos primarios utilizando un reactivo de polímero de peroxidasa de rábano picante correspondiente al animal huésped del anticuerpo primario, siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Pipet suficiente solución de permeabilización para cubrir la muestra de tejido e incubar durante 5 min. </li><li> Retire y deseche la solución y repita el Paso 3.7. </li><li> Incubar los portaobjetos en H 2 O 2 al 0,3% en 1x TBS durante 15 min. </li><li> Desarrollar muestras con un sustrato de peroxidasa diaminobenzidina (DAB) durante 2 - 10 min hasta que se alcance la intensidad de tinción deseada. </li><li> Contraste las muestras para identificar núcleos celulares, como con hematoxilina, siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Deshidrate las muestras con 100%Etanol y xileno. </li><li> Monte las muestras permanentemente con medios de montaje. </li></ol> 4. Identificación de regiones de interés <ol><li> La imagen se desliza bajo microscopía de campo claro capaz de imágenes de alta resolución. NOTA: Utilice componentes celulares de generación de imágenes con una resolución mínima de 20x. </li><li> Mueva la cámara a regiones específicas de interés a través de muestras de tejido. </li><li> Guardar imágenes como archivos TIFF para la cuantificación. </li></ol> 5. Análisis de imágenes <ol><li> Abra imágenes en ImageJ para la cuantificación del porcentaje de cobertura. </li><li> Utilice el complemento Color Umbral para eliminar el color púrpura de los núcleos teñidos con hematoxilina. </li><li> Convierte la imagen a 8 bits. </li><li> Añadir umbral sin fondo oscuro. </li><li> Procese la imagen usando uno de los 17 filtros de umbral de ImageJ pre-cargado ( es decir, MaxEntropy) para que solo las partes teñidas de DAB se incluyan en el umbral. NOTA: Seleccione el filtro de umbral pre-cargado óptimo que minimizEs inclusión de tinción de fondo. Esto puede depender de la calidad de la tinción y la especificidad del anticuerpo. Utilice el mismo umbral para todas las réplicas técnicas dentro de cada muestra de paciente. </li><li> Aplicar umbral. </li><li> Medir el área de porcentaje de la imagen de umbral. </li><li> Porcentaje promedio de cobertura de área para múltiples regiones dentro de cada muestra. </li></ol>

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</ol>

Nuestro método propuesto aquí es un enfoque cuantitativo para analizar las muestras histológicas teñidas usando inmunohistoquímica cromogénica tradicional. La metodología actual para este tipo de análisis incluye protocolos de tinción similares seguidos de clasificación por patólogos independientes. Este método ha sido confiable, sin embargo, para una serie de aplicaciones, se requiere una comprensión más precisa del maquillaje celular, tal como una mejor comprensión de la heterogeneidad asociada con tumores y una recap...

El glioblastoma (GBM), el cáncer de cerebro más común y maligno, se caracteriza por una invasión altamente difusa desde el tumor primario al parénquima cerebral sano circundante 1 , 2 . Esta invasión difusa hace que el tumor sea particularmente difícil de resecar completamente, y las células cancerosas invasoras que permanecen después de la terapia es la razón más común para la recurrencia inevitable 2 , 3 , 4 . Anteriormente, se encontró inhibir la invasión difusa de células de glioma de ser terapéuticamente beneficioso [ 5] , sin embargo poco se sabe sobre los complejos mecanismos que contribuyen a GBM invasión. El microambiente tumoral, o tejido que rodea el cáncer, ha sido implicado en la progresión de tumores en múltiples cánceres [ 6 , 7] . El microambiente tumoral del glioblastoma, en pArticular, está relativamente sub-caracterizada y es singularmente compleja, compuesta de múltiples células gliales, tales como astrocitos, microglia y oligodendrocitos, así como matriz extracelular, factores solubles y factores biofísicos. Experimentalmente, se ha demostrado que los astrocitos y microglia aumentan la progresión e invasión de glioma 8 , 9 , 10 , pero se desconoce la composición de todas las células gliales en el microambiente humano nativo del cerebro. Anteriormente hemos demostrado que los componentes microambientales pueden predecir la supervivencia de los pacientes mediante el análisis cuantitativo de los componentes celulares del glioblastoma microambiente e incorporar nuestros análisis en un modelo de riesgos proporcionales [ 11] . En este sentido, describimos el método de análisis cuantitativo para identificar las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastomaS Se utilizó inmunohistoquímica cromógena para identificar las poblaciones de células gliales y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción de cada población glial. La evaluación del porcentaje de cobertura crea una medición simple para determinar las diferencias morfológicas de las células, particularmente las afectadas por las interacciones con las células cancerosas. Los estudios previos para cuantificar la tinción histopatológica usan tinción estándar como la hematoxilina y la eosina 12 o el tricromo 13 de Masson, que no aprovechan la especificidad de la tinción inmunohistoquímica basada en anticuerpos. Nuestro método fue desarrollado para cuantificar directamente las poblaciones gliales dentro de las resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma, que se pretende utilizar para elucidar el complejo microambiente glioblastoma.

<table><tbody><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P Etanol</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución desenmascarante de antígenos de pH</td><td>alto Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td></td><td></td><td></td>de caballo</tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Proteína específica anti-oligodendrocitos1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-cabra</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-ratón/conejo)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT Sustrato DAB</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Contratinción de hematoxilina</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Medios de montaje</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP</td><td>Pen Research Products International 195506</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inmunohistoquímica cuantitativa del microambiente celular en resecciones de glioblastoma paciente

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Con el creciente interés en el microambiente tumoral, nos propusimos desarrollar un método para determinar específicamente los componentes del microambiente dentro de muestras de pacientes de glioblastoma, el cáncer de cerebro más mortífero y más invasivo. No sólo son métodos cuantitativos beneficiosos para describir con precisión los tejidos enfermos, sino que también pueden contribuir a un pronóstico más preciso, el diagnóstico y el desarrollo de sistemas de ingeniería de tejidos y reemplazos. En el glioblastoma, las células gliales, tales como microglia y astrocitos, se han correlacionado independientemente con un mal pronóstico basado en la clasificación de patólogos. Sin embargo, el estado de estas células y otros componentes de las células gliales no ha sido bien descrito cuantitativamente. Esto puede ser difícil debido a los grandes procesos que marcan estas células gliales. Además, la mayoría de los análisis histológicos se centran en la muestra de tejido total o sólo dentro de la mayor parte del tumor, en lugar de delinear cuantificaciones basadas en regiones conHin el tejido altamente heterogéneo. Aquí, describimos un método para identificar y analizar cuantitativamente las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma. Se utilizó inmunohistoquímica cromogénica para identificar las poblaciones de células gliales en resecciones tumorales de pacientes y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción para cada población glial. Con estas técnicas podemos describir mejor las células gliales a través de las regiones del microambiente tumoral glioma.

Para este análisis, se identificaron dos regiones de intereses dentro de nuestras resecciones tumorales - el tumor primario y las regiones adyacentes, principalmente compuestas de tejido sano con células difusas invasoras de cáncer ( Figura 1A , 1B ) - fueron identificadas por neuropatólogos colaboradores en hematoxilina y eosina Muestras. Dentro de cada muestra de pacientes, se identificó tinción positiva para astrocitos ( <strong class="xf...

Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.

Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

El objetivo general de este protocolo es identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma mediante inmunohistoquímica cromogénica y el software ImageJ. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral, como cómo se ven estos componentes en muestras de pacientes y cómo podemos determinar proporciones de células fisiológicamente relevantes. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla para el análisis en muestras de pacientes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la elucidación del complejo microambiente tumoral del glioblastoma, que hasta ahora ha sido poco caracterizado.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el tiempo de desarrollo cromogénico debe vigilarse cuidadosamente para evitar un desarrollo excesivo y la saturación del tejido. Comience el protocolo realizando los lavados especificados en el protocolo de texto adjunto. Diluya la solución desenmascarante de antígenos con base en tris y pH alto con agua destilada siguiendo las recomendaciones del fabricante.Continúe con la recuperación de antígenos mediada por calor agregando la solución reveladora diluida a un recipiente apto para microondas no sellado. Coloque los portaobjetos en el recipiente. Luego, coloque el recipiente con los portaobjetos en el microondas.A continuación, hierva el recipiente durante 20 minutos a potencia alta. Controle los niveles de líquido por evaporación y rellene el recipiente con agua destilada según sea necesario. Deje enfriar las muestras en solución durante una hora a temperatura ambiente.Delinee la muestra de tejido con un marcador hidrófobo para minimizar el volumen de reactivos necesario para cubrir la muestra. A continuación, agregue suficiente solución de permeabilización, entre 100 y 200 microlitros, para cubrir la muestra de tejido. Retire y deseche la solución, y vuelva a cubrir la muestra de tejido con solución de permeabilización.Incube las muestras a temperatura ambiente con la solución de bloqueo durante una hora. Luego, incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius con los anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo. Al día siguiente, detecte los anticuerpos primarios utilizando un reactivo polimérico de peroxidasa de rábano picante correspondiente al animal huésped del anticuerpo primario.Vierta suficiente solución de permeabilización para cubrir la muestra de tejido e incube la muestra durante cinco minutos. Retire y deseche la solución, y vuelva a cubrir la muestra de tejido con solución de permeabilización una vez más durante cinco minutos. Incube los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 0,3 % y TBS 1X durante 15 minutos.Desarrolle las muestras con un sustrato de diaminobencidina o dab de peroxidasa durante dos a 10 minutos hasta alcanzar la intensidad de tinción deseada. Contratiña las muestras para identificar los núcleos celulares, por ejemplo, con hematoxilina siguiendo el protocolo del fabricante. Deshidrate las muestras con etanol al 100 % y xileno.Finalmente, monte las muestras de forma permanente con medio de montaje. Un neuropatólogo colaborador identificó dos regiones de interés dentro de nuestras resecciones tumorales, la región principal del tumor y la región adyacente, compuesta principalmente de tejido sano con células cancerosas invasoras difusas, en muestras teñidas con hematoxilina y eosina de pacientes. La inmunohistoquímica cromogénica identificó tinción positiva para astrocitos, microglía y oligodendrocitos en cada muestra de paciente.Realizamos la tinción sin anticuerpo primario como control negativo. El fabricante recomendó diluciones adicionales antes de establecerse en una dilución de uno a 200 debido a la tinción positiva óptima del cuerpo celular y los procesos, minimizando así el fondo para el anticuerpo anti ALDH 1l1. Mediante el uso de Image J, se cuantificó el porcentaje de cobertura de la tinción de oligodendrocitos positivos para OSP-1 para finalmente comparar las diferencias en nuestras regiones de interés.Una vez que se ha aplicado el umbral adecuado a la imagen, se puede medir y comparar el porcentaje de cobertura a partir del umbral para múltiples pacientes. Se compararon cinco regiones adyacentes y regiones masivas de muestras de pacientes con glioblastoma o GBM, junto con tejido cerebral sano, en cuanto al porcentaje de cobertura de la proteína específica de oligodendrocitos uno o OSP1. Una vez dominada, la técnica de tinción puede realizarse en cuatro horas el primer día y dos horas el segundo día si se realiza correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar monitorear cuidadosamente la intensidad de la tinción del tejido y su hidratación.

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Fuente: Núñez, F. J., et al. Evaluación de biomarcadores en glioma por inmunohistoquímica en cultivos de neurosfera de glioma 3D embebidos en parafina. J. Vis. Exp. (2019). Este video muestra una técnica inmunohistoquímica para marcar biomarcadores tumorales en neuroesferas tumorales cerebrales incluidas en parafina. Las secciones de la neurosfera se someten a una eliminación de parafina y rehidratación, seguida de un tratamiento para exponer los sitios de biomarcadores. A continuación, se...

Tinción inmunohistoquímica de biomarcadores en secciones de la neurosfera de tumores cerebrales

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Aquí se describe un método para separar y enriquecer los componentes del microambiente tumoral inmune y no inmune en tumores subcutáneos establecidos. Esta técnica permite el análisis separado de infiltrado inmune tumor y fracciones de tumor no inmune que pueden permitir una caracterización completa del microambiente tumoral inmune.

Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Presentamos un método para replicar el microambiente tumoral de glioma en el frente invasivo que incorpora flujo de líquido intersticial. Este modelo es un hidrogel de hialuronano-colágeno I en un inserto de cultivo de tejidos donde se puede aplicar un cabezal de presión de fluido. La invasión se puede cuantificar y las células se pueden aislar o lisar.

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

Este protocolo preparó con éxito suficiente tejido neovascular de alta calidad a partir de muestras de glioma utilizando microdissección por captura láser para el análisis proteómico cuantitativo de la angiogénesis tumoral, superando las limitaciones de estudios que tradicionalmente se centran principalmente en factores angiogénicos y proporcionando un perfil proteómico a gran escala de la angiogénesis del glioma.

Preparación de tejidos neovasculares de tejidos de glioma humanos para el análisis proteómico cuantitativo de la angiogénesis tumoral

Aprende a identificar cuantitativamente componentes del microambiente tumoral en glioblastoma mediante inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ. Este protocolo permite analizar muestras de pacientes y determinar ratios celulares relevantes.

Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

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