Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente
31 de julio de 2017
Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.
El objetivo general de este protocolo es identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma mediante inmunohistoquímica cromogénica y el software ImageJ. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral, como cómo se ven estos componentes en muestras de pacientes y cómo podemos determinar proporciones de células fisiológicamente relevantes. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla para el análisis en muestras de pacientes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la elucidación del complejo microambiente tumoral del glioblastoma, que hasta ahora ha sido poco caracterizado.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el tiempo de desarrollo cromogénico debe vigilarse cuidadosamente para evitar un desarrollo excesivo y la saturación del tejido. Comience el protocolo realizando los lavados especificados en el protocolo de texto adjunto. Diluya la solución desenmascarante de antígenos con base en tris y pH alto con agua destilada siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Continúe con la recuperación de antígenos mediada por calor agregando la solución reveladora diluida a un recipiente apto para microondas no sellado. Coloque los portaobjetos en el recipiente. Luego, coloque el recipiente con los portaobjetos en el microondas.
A continuación, hierva el recipiente durante 20 minutos a potencia alta. Controle los niveles de líquido por evaporación y rellene el recipiente con agua destilada según sea necesario. Deje enfriar las muestras en solución durante una hora a temperatura ambiente.
Delinee la muestra de tejido con un marcador hidrófobo para minimizar el volumen de reactivos necesario para cubrir la muestra. A continuación, agregue suficiente solución de permeabilización, entre 100 y 200 microlitros, para cubrir la muestra de tejido. Retire y deseche la solución, y vuelva a cubrir la muestra de tejido con solución de permeabilización.
Incube las muestras a temperatura ambiente con la solución de bloqueo durante una hora. Luego, incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius con los anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo. Al día siguiente, detecte los anticuerpos primarios utilizando un reactivo polimérico de peroxidasa de rábano picante correspondiente al animal huésped del anticuerpo primario.
Vierta suficiente solución de permeabilización para cubrir la muestra de tejido e incube la muestra durante cinco minutos. Retire y deseche la solución, y vuelva a cubrir la muestra de tejido con solución de permeabilización una vez más durante cinco minutos. Incube los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 0,3 % y TBS 1X durante 15 minutos.
Desarrolle las muestras con un sustrato de diaminobencidina o dab de peroxidasa durante dos a 10 minutos hasta alcanzar la intensidad de tinción deseada. Contratiña las muestras para identificar los núcleos celulares, por ejemplo, con hematoxilina siguiendo el protocolo del fabricante. Deshidrate las muestras con etanol al 100 % y xileno.
Finalmente, monte las muestras de forma permanente con medio de montaje. Un neuropatólogo colaborador identificó dos regiones de interés dentro de nuestras resecciones tumorales, la región principal del tumor y la región adyacente, compuesta principalmente de tejido sano con células cancerosas invasoras difusas, en muestras teñidas con hematoxilina y eosina de pacientes. La inmunohistoquímica cromogénica identificó tinción positiva para astrocitos, microglía y oligodendrocitos en cada muestra de paciente.
Realizamos la tinción sin anticuerpo primario como control negativo. El fabricante recomendó diluciones adicionales antes de establecerse en una dilución de uno a 200 debido a la tinción positiva óptima del cuerpo celular y los procesos, minimizando así el fondo para el anticuerpo anti ALDH 1l1. Mediante el uso de Image J, se cuantificó el porcentaje de cobertura de la tinción de oligodendrocitos positivos para OSP-1 para finalmente comparar las diferencias en nuestras regiones de interés.
Una vez que se ha aplicado el umbral adecuado a la imagen, se puede medir y comparar el porcentaje de cobertura a partir del umbral para múltiples pacientes. Se compararon cinco regiones adyacentes y regiones masivas de muestras de pacientes con glioblastoma o GBM, junto con tejido cerebral sano, en cuanto al porcentaje de cobertura de la proteína específica de oligodendrocitos uno o OSP1. Una vez dominada, la técnica de tinción puede realizarse en cuatro horas el primer día y dos horas el segundo día si se realiza correctamente.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar monitorear cuidadosamente la intensidad de la tinción del tejido y su hidratación.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para identificar cuantitativamente los componentes del microentorno tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma mediante inmunohistoquímica cromogénica y ImageJ. Esta técnica tiene como objetivo proporcionar información sobre el complejo microentorno tumoral del glioblastoma.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Histología
Antecedentes
- El glioblastoma es un tumor cerebral altamente agresivo.
- El microambiente tumoral desempeña un papel crucial en la progresión del tumor.
- Comprender la composición de este entorno es esencial para desarrollar terapias dirigidas.
- La inmunohistoquímica cromogénica permite la visualización detallada de los componentes del tejido.
Objetivo del estudio
- Evaluar cuantitativamente el microambiente tumoral en muestras de glioblastoma.
- Determinar las proporciones fisiológicamente relevantes de diferentes tipos celulares.
- Proporcionar un método de análisis sencillo para muestras de pacientes.
Métodos Utilizados
- Inmunohistoquímica cromogénica para la tinción de tejidos.
- Software ImageJ para análisis cuantitativo.
- Protocolos de lavado y desenmascaramiento de antígenos según las recomendaciones del fabricante.
- Monitoreo cuidadoso del tiempo de desarrollo cromogénico.
Resultados principales
- Identificación exitosa de diversos componentes del microambiente tumoral.
- Establecimiento de métodos para determinar las proporciones celulares en muestras de glioblastoma.
- Conocimientos sobre la complejidad del microambiente del glioblastoma.
- Demuestra la aplicabilidad del método a muestras de pacientes.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para estudiar los microentornos del glioblastoma.
- Contribuye a comprender las interacciones dentro del microentorno tumoral.
- Las investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para mejorar las estrategias de tratamiento del glioblastoma.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo del microambiente tumoral en muestras de glioblastoma derivadas de pacientes permite la reducción mecanicista de riesgos de dianas en células gliales en el descubrimiento de fármacos en neuro-oncología. Al proporcionar mediciones reproducibles y específicas de regiones de astrocitos, microglía y oligodendrocitos, este método apoya la validación de dianas y el cribado fenotípico en sistemas relevantes para la enfermedad. Mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al vincular la composición del microambiente con mecanismos de respuesta terapéutica y resistencia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de fenotipos de células gliales y sus estados funcionales dentro de regiones tumorales heterogéneas.
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en imágenes para evaluar la interacción con el blanco y la modulación del microambiente.
- Valor predictivo: Apoya la selección de blancos alineados con biomarcadores mediante la correlación de la abundancia glial con gradientes patológicos en muestras de pacientes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Establece protocolos estandarizados de inmunohistoquímica compatibles con sistemas de análisis e imagen de alto rendimiento.
- Resultado cuantitativo: Proporciona métricas de porcentaje de cobertura mediante ImageJ que permiten comparaciones entre muestras y entre regiones.
- Reproducibilidad: Define controles críticos de tiempo para el desarrollo cromogénico para garantizar la especificidad de la señal y minimizar el ruido de fondo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Pertinencia para la enfermedad: Utiliza muestras reales de resección de pacientes para mantener la fidelidad fisiopatológica en estudios de validación de dianas.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos del descubrimiento con modelos preclínicos mediante la definición de puntos de referencia cuantitativos para la composición de células gliales.
- Reducción de riesgos: Disminuye la incertidumbre en la desviación biológica de terapias dirigidas a células gliales mediante la caracterización del contexto microambiental.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, particularmente para programas de neuro-oncología centrados en la modulación del microentorno.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al permitir el perfilado espacial y cuantitativo de poblaciones gliales en tejido humano.
- Cribado: Genera patrones de tinción estandarizados y cuantificables que pueden utilizarse para evaluar los efectos de compuestos sobre la composición del microentorno.
- Análisis: Proporciona mediciones del porcentaje de cobertura basadas en umbrales que permiten comparaciones estadísticas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se alinea con estrategias de biomarcadores al vincular las densidades de células gliales con regiones histopatológicas de interés.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo transferible de IHC/ImageJ aplicable en modelos de glioma y otros tumores del SNC.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el blanco mediante un análisis cuantitativo y resuelto espacialmente de células gliales en muestras de pacientes.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de recuperación de antígenos, bloqueo y tiempos de revelado.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad en las interacciones del microentorno del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapéuticos moduladores de células gliales basada en datos de interacción con el microentorno.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunohistoquímica y manejo de muestras neuropatológicas.
- Depende del tiempo optimizado de desarrollo cromogénico para evitar la saturación de la señal.
- Necesita protocolos estandarizados de umbralización en ImageJ para una cuantificación consistente.
- Requiere acceso a muestras de resección de glioblastoma derivadas de pacientes con regiones de interés anotadas.
- Limitado por la heterogeneidad del tejido y la necesidad de un análisis específico por regiones para evitar señales engañosas.
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