Láser Doppler: Una herramienta para medir islote pancreático AMPc Microvascular en Vivo
8 de marzo de 2018
Islote pancreático microvascular AMPc regula la distribución de sangre del islote y mantiene la función fisiológica de las células β del islote. Este protocolo describe el uso de un monitor Doppler láser para determinar el estado funcional del islote pancreático AMPc microvascular en vivo y para evaluar las contribuciones de la microcirculación de islotes pancreáticos para enfermedades relacionadas con el páncreas.
El objetivo general de este procedimiento es determinar el estado funcional de la vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos in vivo para evaluar su impacto en enfermedades relacionadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo circulatorio médico, como si la vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos cambia en estado patológico. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando demostramos que existe una circulación mecano-funcional que se ha desarrollado durante la evolución de la diabetes.
La principal ventaja de esta técnica es que puede evaluar el estado funcional de la vasomoción microvascular de tejidos y órganos tanto en entornos clínicos como de laboratorio. Este método puede proporcionar información sobre enfermedades relacionadas con los islotes pancreáticos. También puede aplicarse a otros sistemas, como enfermedades microvasculares relacionadas con el riñón y la retina.
Las aplicaciones de esta técnica también se extienden hacia la comprensión de la naturaleza de las tendencias en el estado funcional de la vasomoción microvascular. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque existen grandes cantidades de datos académicos microvasculares derivados del láser doppler durante los experimentos. Es fundamental que la demostración de este método sea rigurosa, ya que muchos factores pueden afectar negativamente la recolección precisa de datos de la microcirculación.
Este protocolo comienza con la administración diaria de inyecciones de STZ a ratones durante cinco días consecutivos. Disuelva el STZ en tampón de citrato sódico hasta una concentración de trabajo de cinco miligramos por mililitro. A continuación, administre inyecciones intraperitoneales mediante una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 25.
Los ratones deben ayunar durante cuatro horas antes de la inyección, pero no se debe restringir su acceso al agua. Inyecte a los ratones de control con el mismo volumen de tampón de citrato de sodio puro. Después de las inyecciones, proporcione a los ratones alimento normal y agua con 10% de sacarosa.
Después del quinto día de inyección de STZ, sustituya el agua con sacarosa al 10 % por agua normal. Nueve días después, analice la glucosa sanguínea. Primero, ayune a los ratones durante seis horas con acceso libre al agua.
Luego, tome sangre de sus venas de la cola y utilice un glucómetro estándar portátil para medir la sangre. Considere diabéticos a cualquier ratón con niveles de glucosa en sangre superiores a 200 miligramos por decilitro. Antes de usar el aparato de Doppler láser, primero limpie las superficies ópticas de la punta del sensor y del conector del sensor con un paño suave y no abrasivo, luego conecte el cable al puerto del instrumento.
A continuación, arme el soporte de calibración. Primero permita que el patrón de flujo almacenado alcance la temperatura ambiente. Esto tarda aproximadamente media hora.
Luego, agite suavemente el estándar de flujo durante 10 segundos y déjelo reposar sobre la base de calibración durante dos minutos. A continuación, eleve la pinza todo lo posible y asegure la sonda en la pinza. Ahora, sumerja lentamente la sonda en el estándar de flujo y fije la sonda utilizando los soportes de la sonda.
Para continuar, atenúe las luces de la habitación y presione calibración en el aparato de doppler láser. Ahora seleccione el canal de trabajo al que está conectada la sonda y ejecute el programa de calibración. Coloque un ratón anestesiado en posición supina sobre una plataforma de trabajo y fíjelo utilizando cinta quirúrgica.
A continuación, esterilice la piel abdominal con etanol al 75% desde la región cervical hasta la cola, luego cubra la periferia de la zona con una gasa seca que tenga un orificio de tres centímetros de ancho en el centro. A continuación, levante la piel abdominal con pinzas y realice una incisión vertical inicial a lo largo de la línea media del abdomen utilizando un bisturí o tijeras para piel. Luego, sujete el músculo subyacente con pinzas e incise para acceder a la cavidad abdominal.
No dañe ningún órgano. Para exponer la cavidad abdominal, doble la piel y el músculo subyacente sobre el pecho, luego exponga suavemente el cuerpo pancreático y el bazo utilizando un par de pinzas de punta roma. A continuación, en el software de control del aparato de Doppler láser, cree un nuevo archivo de medición y configure las pantallas conectadas.
En la pestaña general, configure la duración del monitoreo en modo de ejecución libre y utilice el valor predeterminado de fábrica para la pestaña del monitor LDF. A continuación, abra el cuadro de diálogo de configuración de visualización y seleccione los canales adecuados. Luego, active los siguientes parámetros: fuente de datos para el canal y etiqueta, unidades y color, y haga clic en siguiente.
A continuación, ingrese la información de identificación sobre el sujeto y la medición en el cuadro de diálogo de información del archivo y continúe haciendo clic nuevamente en siguiente. Ahora, la configuración está completa y aparecerá una ventana de medición. A continuación, avance manualmente el electrodo hasta situarlo a un milímetro del páncreas.
La precisión de la medición está relacionada con la distancia entre la sonda y el tejido de los islotes pancreáticos. La lectura del flujo sanguíneo será inexacta a menos que se mantenga cuidadosamente una separación de un milímetro entre los tejidos y la sonda. Para comenzar la grabación, haga clic en el ícono de inicio y los datos de flujo sanguíneo microvascular en unidades PU comenzarán a guardarse.
Haga esto durante un minuto completo y utilice los botones de compresión y expansión de la pantalla y los botones de aumento o disminución de la altura de las trazas del gráfico para ajustar el efecto mostrado durante la grabación, y luego detenga la grabación. A continuación, guarde el archivo con un nombre adecuado. Ahora, reposicione manualmente la sonda para evitar efectos aditivos y el agotamiento localizado de la capacidad contráctil y de relajación.
En total, recolecte datos de PU de tres puntos aleatorios del páncreas para cada ratón. En algún momento durante el experimento, mida los datos de PU de una placa no reflectante para obtener un valor de control de línea base. Después de tomar las tres mediciones, use suturas de tres-oh para cerrar las capas musculares y luego suturas de cuatro-oh para cerrar la capa de piel.
Ahora supervise al ratón en una jaula de recuperación hasta que esté listo para ser trasladado a una jaula domiciliaria limpia. En general, el estado microcirculatorio del islote pancreático se representa mediante fases periódicas de contracción y relajación. Los fenómenos hemodinámicos generales crean un patrón de perfusión del flujo sanguíneo.
Utilizando el aparato de Doppler láser, se recopilaron datos de PU para mostrar el patrón de distribución de la perfusión sanguínea microvascular en ratones no diabéticos y diabéticos. Los resultados fueron completamente diferentes. El ritmo de contracciones y relajaciones de la vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos era caótico e irregular en ratones diabéticos inducidos por STZ, mientras que los controles no diabéticos presentaban oscilaciones rítmicas.
A continuación, la vasomoción se cuantificó mediante perfiles de PU. En comparación con los controles, la perfusión sanguínea promedio de la microcirculación del islote pancreático se redujo en ratones diabéticos inducidos por STZ. Estos ratones también mostraron disminuciones significativas en la amplitud y frecuencia de esta vasomoción, así como en la velocidad relativa de la perfusión sanguínea hacia el islote pancreático.
Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que la distancia entre la sonda y el tejido pancreático esté dentro de un milímetro. Una distancia inadecuada produce una lectura de flujo sanguíneo artificialmente aumentada o disminuida.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el speckle láser y el oxígeno translocante para responder preguntas adicionales, como la visualización de la isquemia, la evaluación del flujo sanguíneo y el estado funcional de la evaluación de la vasomoción microvascular. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores y clínicos en el campo de la endocrinología y el metabolismo exploraran los mecanismos microcirculatorios ocultos tras las enfermedades relacionadas con los islotes pancreáticos. No olvide que trabajar con instrumentos láser puede ser extremadamente peligroso debido a la exposición a la radiación, y siempre se deben tomar precauciones, como mantener al menos 200 milímetros de distancia entre el entorno lateral y el ojo, durante la realización de este procedimiento.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para evaluar el estado funcional de la vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos in vivo. Comprender este proceso es fundamental para evaluar su papel en enfermedades relacionadas con el páncreas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Fisiología microvascular
- Endocrinología
Antecedentes
- La vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos es esencial para la distribución sanguínea.
- Desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la función fisiológica de las células β del islote.
- Los cambios en la vasomoción podrían estar relacionados con condiciones patológicas como la diabetes.
- Este método también puede aplicarse a otros sistemas microvasculares.
Objetivo del estudio
- Determinar el estado funcional de la vasomoción microvascular en los islotes pancreáticos.
- Evaluar el impacto de la vasomoción en enfermedades relacionadas con el páncreas.
- Explorar la posible aplicación de este método en otros sistemas orgánicos.
Métodos Utilizados
- Uso de un monitor láser Doppler para la evaluación in vivo.
- Evaluación de la vasomoción microvascular en los islotes pancreáticos.
- Comparación del estado funcional en estados sanos frente a patológicos.
- Aplicación de los hallazgos a otras enfermedades microvasculares.
Resultados principales
- Identificación de cambios funcionales en la vasomoción de los islotes pancreáticos.
- Conocimientos sobre la relación entre la vasomoción y la diabetes.
- Implicaciones potenciales para las estrategias de tratamiento en enfermedades relacionadas.
- Demuestra la versatilidad del método para otros sistemas orgánicos.
Conclusiones
- La vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos es vital para la función del islote.
- Los cambios en la vasomoción pueden indicar condiciones patológicas.
- Este método proporciona información valiosa sobre la salud microvascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación del vasomovimiento microvascular en los islotes pancreáticos proporciona una medida funcional de la salud de la microcirculación que puede orientar la validación de objetivos en la investigación de la diabetes y la pancreatitis. La cuantificación de parámetros del vasomovimiento, como la amplitud, la frecuencia y la perfusión, permite reducir riesgos mecanicistas al vincular la disfunción vascular con la fisiopatología del islote. Este enfoque fortalece la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al identificar las contribuciones vasculares a la progresión de la enfermedad antes de comprometerse con objetivos posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Cuestionar hipótesis terapéuticas determinando si la vasomoción microvascular de los islotes pancreáticos se altera en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Establecer parámetros basales de vasomoción en tejido sano para detectar desviaciones patológicas.
- Valor científico: Apoyar la reducción de riesgos biológicos al aclarar el papel de la microcirculación en la función y disfunción del islote.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Preparar sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la confirmación de la respuesta microvascular.
- Valor operativo: Abordar la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante el control de la distancia sonda-tejido y la calibración de la línea base.
- Valor científico: Permitir la evaluación confiable de compuestos al proporcionar salidas cuantitativas sobre la dinámica de la vasomoción.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Discutir la relevancia de la enfermedad conectando la vasomoción alterada en modelos diabéticos con la disfunción endocrina.
- Valor operativo: Describir la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento de la vasomoción como biomarcador de la salud de los islotes.
- Valor científico: Abordar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante el uso de métricas de vasomoción para priorizar dianas con mecanismos vasculares.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la validación preclínica, al proporcionar datos vasculares funcionales que complementan los puntos finales moleculares e histológicos.
- Biología del Descubrimiento: Explique cómo el método apoya la prueba de hipótesis, la aclaración de vías o la reducción del riesgo biológico al vincular los cambios en la vasomoción con fenotipos diabéticos.
- Selección: Describa la preparación del ensayo, la reproducibilidad o las salidas cuantitativas cuando el artículo lo respalde mediante métricas estandarizadas de perfusión y oscilación.
- Análisis: Destaque las mediciones, lecturas o salidas estadísticas que ayudan a los equipos a comparar condiciones, como la perfusión sanguínea promedio, la amplitud, la frecuencia y la velocidad relativa.
- Investigación Traducional: Relacione el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores solo cuando la fuente lo respalde al posicionar la vasomoción como un indicador funcional de la salud microcirculatoria de los islotes.
- Reutilización Empresarial: Presente el método como una capacidad reutilizable y no como una técnica de uso único debido a su aplicabilidad en sistemas microvasculares como el riñón y la retina.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en fisiología microvascular y en imagenología in vivo.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo monitor de Doppler láser y estándares de calibración.
- Requisitos de estandarización entre equipos para la colocación de sondas e interpretación de datos.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, como ajustes por profundidad del tejido y motilidad.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía, incluyendo la necesidad de una distancia precisa entre la sonda y el tejido dentro de un milímetro para evitar lecturas inexactas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
1:49
Using Streptozotocin and Sugar-water to Make Mice Diabetic
3:12
Preparing and Calibrating the Laser Doppler
4:24
Laser Doppler Analysis of Microvascular Vasomotion in Pancreatic Islet
7:56
Results: Microvascular Vasomotion in the Pancreatic Islet of STZ-induced Diabetic Mice
9:11
Conclusion
