Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y
14 de julio de 2017
Se describe un método basado en HPLC para la determinación de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en hígado y leche de ratón.
El objetivo general de esta metodología es la detección de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicilneuramínico en el hígado y la leche de ratones de tipo silvestre y ratones knock-out de CMAH mediante análisis por HPLC. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la glicosciencia, específicamente el efecto que los genotipos de modelos de ratones CMAH tienen sobre los contenidos reales de ácidos siálicos en estos animales. La principal ventaja que tiene esta técnica en comparación con las pruebas genéticas es que se pueden determinar los niveles relativos de ácidos siálicos también en ratones heterocigotos.
La evaluación de este método estará a cargo de Cui Cao y Wang Wenjiao, dos estudiantes de posgrado de nuestro laboratorio. Comience este procedimiento con la recolección de leche de ratón y tejido hepático de ratones con nulificación del gen CMAH, tal como se describe en el protocolo escrito. Para aislar los ácidos siálicos de la leche, transfiera 50 microlitros de leche a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y agregue 1,2 mililitros de solución acuosa de ácido acético preparada.
Para aislar ácidos siálicos del tejido hepático, descongele suavemente de 20 a 50 miligramos de hígado de ratón y transfiéralos a un homogeneizador de tejidos Dounce. Añada 1,2 mililitros de la solución acuosa de ácido acético y homogeneice el tejido mediante cizallamiento suave durante 10 segundos. Transfiera la suspensión resultante a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
A continuación, incube la leche acidificada o la suspensión de tejido durante cuatro horas a 80 grados Celsius. Luego, centrifugue la muestra a 14 mil veces g durante 10 minutos. Transfiera los 1000 microlitros superiores del sobrenadante a un tubo cónico fresco de 1,5 mililitros.
Elimine el disolvente mediante evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad completa. Reconstituya la muestra en 500 microlitros de agua destilada. A continuación, prepare una columna micro de intercambio aniónico transfiriendo 200 miligramos de resina de intercambio aniónico por muestra a tubos vacíos de 3 mililitros con llave de paso acoplada.
Añada 2 mililitros de la solución acuosa de ácido acético para reemplazar los iones cloruro en la resina con ion acetato. Cierre la llave de paso tan pronto como el disolvente alcance la parte superior de la resina. Añada suavemente 2 mililitros de agua destilada y abra la llave de paso.
Detenga el flujo tan pronto como la mayor parte del disolvente alcance la parte superior de la resina. Asegúrese de que la resina esté siempre cubierta con disolvente. Luego, lave la columna de resina dos veces más con dos mililitros de agua destilada para eliminar el exceso de acetato.
Transfiera los 500 microlitros resultantes del disolvente de la muestra a la columna de resina y deseche el flujo atravesante. Lave suavemente la resina con 2 mililitros de agua destilada. Eluya los aniones de la muestra de la resina utilizando 1 mililitro de una solución de acetato de amonio 50 milimolar en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Elimine el disolvente mediante evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad. Pese entre 5 y 8 miligramos de ácido N-acetilneuramínico en una balanza analítica y colóquelos en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Anote el peso exacto y agregue 164 microlitros de agua destilada por cada miligramo.
Obtenga ácido N-glicolilneuramínico en cantidades pequeñas y a un precio moderado, por ejemplo en alícuotas de 1 miligramo. Añada 154 microlitros de agua destilada directamente al compuesto para obtener una solución stock de aproximadamente 20 milimolar de Neu5Gc. Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Esta solución puede almacenarse a menos 20 grados Celsius durante hasta 12 meses. Combine 5 microlitros de cada solución stock en un tubo centrífugo nuevo de 1,5 mililitros. Luego, elimine el disolvente mediante evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad.
Agregue 20 microlitros de la solución de OPD a las muestras de ácido siálico obtenidas de leche de ratón, hígado de ratón o al estándar mixto de ácidos siálicos. Vortexee la muestra vigorosamente durante 30 segundos. A continuación, incube las muestras durante cuatro horas a 80 grados Celsius en la oscuridad.
Después de dejar que las muestras se enfríen durante cinco minutos, agregue 80 microlitros de agua destilada. Luego, centrifugue los tubos a 14 mil veces g durante un minuto. A continuación, transfiera 80 microlitros del sobrenadante a un vial de HPLC de recuperación alta de 300 microlitros.
Las muestras de ácido siálico derivatizado se pueden almacenar entre cuatro y seis grados Celsius durante hasta una semana. Analice las muestras utilizando un sistema estándar de HPLC conectado a un detector de fluorescencia en línea. Utilice una columna de fase reversa C18 con una longitud de 250 milímetros y un diámetro de 4,6 milímetros para el análisis.
Después de preparar el disolvente A y el disolvente B, y configurar el análisis por HPLC según se detalla en el protocolo, inyecte 50 microlitros de la muestra en el sistema de HPLC. Monitoree la elución utilizando la longitud de onda de excitación del detector de fluorescencia de 373 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 448 nanómetros. Finalmente, calcule la cantidad relativa de Neu5Gc según se describe en el protocolo escrito.
Se muestran aquí cromatogramas representativos de HPLC de ácidos siálicos marcados con fluorescencia a partir de muestras de leche, derivadas de ratones CMAH knock-out homocigotos y ratones CMAH knock-out heterocigotos. También se incluyen ratones de tipo silvestre. De manera similar, se presentan cromatogramas de ácidos siálicos marcados con fluorescencia derivados del hígado de ratón.
La comparación de las cantidades relativas de Neu5Gc muestra que los ratones homocigotos con deleción del gen CMAH no contienen Neu5Gc, mientras que los ratones heterocigotos con deleción del gen CMAH y los ratones de tipo salvaje contienen entre un 10 y un 75 % de Neu5Gc. Una vez dominado el procedimiento, las muestras pueden prepararse en menos de ocho horas si se realiza adecuadamente. Además, las muestras pueden analizarse mediante muestreo automático por HPLC durante la noche.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el aislamiento del ácido siálico y la derivatización deben llevarse a cabo el mismo día. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis mediante espectrometría de masas, para confirmar la naturaleza de las señales fluorescentes obtenidas. El desarrollo de esta técnica permite a los investigadores explorar la distribución del ácido siálico en muestras biológicas.
No olvide que trabajar con ácido acético y ácido fórmico concentrados puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar equipo de protección mientras se realiza este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para detectar ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicilneuramínico en hígado y leche de ratón mediante análisis por HPLC. La metodología tiene como objetivo explorar el impacto de los genotipos CMAH en los niveles de ácidos siálicos en ratones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Glicosciencia
- Bioquímica
- Biología molecular
Antecedentes
- El ácido N-acetilneuramínico y el ácido N-glicilneuramínico son ácidos siálicos importantes.
- Comprender sus niveles puede proporcionar información sobre los procesos metabólicos.
- Los ratones knock-out para CMAH sirven como modelo para estudiar las variaciones de los ácidos siálicos.
- La HPLC es un método confiable para cuantificar estos compuestos.
Objetivo del estudio
- Determinar los niveles de ácido siálico en hígado y leche de ratón.
- Evaluar los efectos del genotipo CMAH sobre el contenido de ácido siálico.
- Proporcionar un método que permita evaluar ratones heterocigotos.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras de hígado y leche de ratones con knock-out de CMAH.
- Aislamiento de ácidos siálicos utilizando una solución acuosa de ácido acético.
- Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) para el análisis.
- Evaluación de los resultados por estudiantes de posgrado en el laboratorio.
Resultados principales
- Detección exitosa de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilneuramínico.
- Diferencias demostradas en los niveles de ácidos siálicos entre genotipos.
- Se validó la eficacia del método tanto para ratones homocigotos como heterocigotos.
- Proporcionó una base para futuras investigaciones en glicosciencia.
Conclusiones
- El método de HPLC es efectivo para analizar ácidos siálicos en muestras biológicas.
- Los hallazgos contribuyen a comprender el papel de CMAH en el metabolismo de los ácidos siálicos.
- Este enfoque puede facilitar estudios futuros en glicosciencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La determinación cuantitativa de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicilneuramínico en hígado y leche de ratón permite una correlación precisa entre genotipo y fenotipo en la investigación de glicosciencia. Este flujo de trabajo basado en HPLC apoya la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en estudios de la vía de los ácidos siálicos, aportando información para la investigación preclínica y traslacional. La capacidad del método para distinguir entre modelos de tipo salvaje, heterocigotos y knock-out mejora la confianza predictiva en la selección de carteras dentro de las líneas de investigación metabólica y nutricional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la medición directa de metabolitos del ácido siálico para la validación funcional de dianas.
- Apoya la desactivación de riesgos mecanicistas mediante la correlación del genotipo CMAH con el rendimiento metabólico.
- Facilita la confianza predictiva en estudios de modulación de vías.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un ensayo validado por HPLC para la cuantificación reproducible de ácidos siálicos.
- Normaliza la preparación de muestras y la derivatización para permitir la comparabilidad entre estudios.
- Permite un cribado confiable de muestras biológicas para determinar su contenido de ácidos siálicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona la cuantificación del ácido siálico con fenotipos metabólicos relevantes para la enfermedad.
- Apoya la continuidad desde la manipulación genética hasta la lectura bioquímica en modelos preclínicos.
- Proporciona información para tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo en estudios de intervención metabólica y nutricional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de cuantificación basado en HPLC se integra en la continuidad del descubrimiento, desde estudios iniciales de genotipo-fenotipo hasta la validación preclínica de rutas metabólicas.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis sobre la función de CMAH y el metabolismo de los ácidos siálicos.
- Detección: Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas para el desarrollo de ensayos y la comparación de muestras.
- Análisis: Ofrece datos cromatográficos y de fluorescencia robustos para el análisis estadístico de las diferencias metabólicas.
- Investigación Traducional: Conecta modelos genéticos con fenotipos bioquímicos relevantes para la investigación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Adaptable para el análisis de ácidos siálicos en diversas matrices biológicas más allá de los modelos de ratón.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de la vía del ácido siálico.
- Valor operativo: Ofrece procesamiento y análisis de muestras estandarizados, escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Apoya decisiones informadas de avance/no avance y una gestión eficiente del capital en la cartera de investigación metabólica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y modelos para su desarrollo posterior.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la operación de HPLC y en la química de derivatización de muestras.
- Necesita acceso a detección por fluorescencia e infraestructura cromatográfica.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de manejo de muestras y análisis de datos.
- Adaptable a diversas muestras de tejido y leche con pasos de extracción validados.
- Se requieren precauciones de seguridad debido a los reactivos peligrosos utilizados en la preparación de muestras.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
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Title
0:55
Isolation of Sialic Acids from Milk and from Liver Tissue
7:05
Conclusion
6:15
Results: Quantification of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice
3:26
Preparation of a Mixed Sialic Acid Standard
5:18
HPLC Analysis of Sialic Acid Derivatives
4:26
Fluorescence Derivatization of Sialic Acids
