Name: Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y CMAH Ratones knock-out. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a detectar ácidos siálicos en hígado y leche de ratones CMAH usando cromatografía HPLC. Este método permite cuantificar N-acetilneuramínico y N-glicolilneuramínico en genotipos homocigotos y heterocigotos.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias Naturales de China (los números de subvención 31471703, A0201300537 y 31671854 a JV y LL), y el plan de 100 Talentos Extranjeros (concesión número JSB2014012 a JV).

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Ético del Centro Experimental de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing de acuerdo con las Directrices Nacionales para el Bienestar Animal Experimental (Ministerio de Ciencia y Tecnología, RP de China, 2006) con los animales alojados en un SPF (ID de permiso: SYXK-J-2011-0037). 1. Cmah Knock-out modelo de ratón <ol><li> Utilizar ratones C57B1 / 6 de tipo salvaje del Centro de Medicina Comparada de la Universidad de Yangzhou (China). NOTA: Se generaron ratones knock-out Cmah basándose en la información proporcionada a partir de estudios de knock-out Cmah anteriores 17 , 19 y obtenidos comercialmente usando una estrategia CRISPR / Cas9 20 mediante la eliminación de 92 pares de bases del exón 6 del gen Cmah que también es Suprimido en el gen humano CMAH [ 19] . Positivo F 0 &lt;/ sub&gt; -mice (2 individuos) se cruzaron con ratones de tipo salvaje para obtener heterocigotos F 1 -mice. Después de cruzar heterocigotos F 1 -mice (5 personas), homocigoto CMAH ronda F 2 -mice se podría obtener con éxito (3 individuos). </li><li> Realizar el genotipado de ratones utilizando ADN genómico de acuerdo con el método mostrado por Zangala 21 utilizando un kit comercial de purificación de ADN. <ol><li> Amplificar un fragmento de ADN correspondiente del gen Cmah utilizando DNA polimerasa comercial y el par de cebadores 5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;y 5&#39;tttaaaatgtccggggtgagaagc3&#39;. Realizar la amplificación génica utilizando 34 ciclos de PCR consistentes en desnaturalización a 94 ° C durante 40 s, hibridación a 63 ° C durante 40 s, y elongación a 72 ° C durante 1 min. </li><li> Visualizar los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Se debe observar una banda única (0,5 kb) para el individuo de tipo salvaje, una banda doble (0,4 y 0,5 kb) para elHeterocigotos knock-out individual, y una sola banda (0,4 kb) para el homocigotos knock-out individual. </li></ol></li></ol> 2. Recolección de muestras <ol><li> Recoger la leche del ratón utilizando el protocolo descrito por Willingham et al. 22 . </li><li> Recoger el tejido del hígado de ratón utilizando el protocolo descrito por Gonçalves et al. 23 y almacenar las muestras a -80 ° C. </li></ol> 3. Aislamiento de los ácidos siálicos de la leche <ol><li> Preparar 100 ml de una solución de ácido acético 2 M mediante la adición de 12 ml de ácido acético glacial en 88 ml de H2O destilada </li><li> Transferir 50 μL de leche en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y agregar 1,2 ml de la solución acuosa de ácido acético preparada. </li><li> Incubar la suspensión durante 4 h a 80 ° C y centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 10 min. </li><li> Transferir los 1000 μL superiores del sobrenadante en un tubo de centrífuga de 1,5 ml nuevo y remDel disolvente por evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad completa (dependiendo de la bomba de vacío conectada esto tomará 4 - 20 h). Volver a disolver la muestra en 500 μl de H 2 O destilada. </li><li> Preparar una columna de intercambio micro-anión. Esta etapa enriquecerá específicamente compuestos aniónicos y eliminará los compuestos catiónicos y neutros de las muestras de leche y de hígado, y por lo tanto aumenta la selectividad del agente de marcaje de OPD fluorogénico para la derivatización del ácido siálico. <ol><li> Transferir para cada muestra 200 mg de la resina de intercambio aniónico (Dowex 1X8) en tubos de columna vacíos de 3 ml con una llave de paso adjunta. </li><li> Añadir 2 ml de la solución acuosa de ácido acético preparada en la etapa 3.1 para reemplazar los iones cloruro en la resina con iones acetato. Cierre la llave de paso tan pronto como el solvente alcance la parte superior de la resina. </li><li> Añadir con cuidado 2 ml de H2O destilada, abrir la llave de paso y detener el flujo tan pronto como la mayoría de los alcances de disolventeLa parte superior de la resina. Asegúrese de que la resina esté siempre cubierta con disolvente. </li><li> Lavar la columna de la resina dos veces más con 2 ml de H 2 O destilada para retirar el exceso de etilo. </li></ol></li><li> Transferir los 500 μl resultantes del disolvente de la muestra de la etapa 3.4. Sobre la columna de resina y descartar el flujo. Lavar suavemente la resina con 2 ml de H2O destilada Eluir los aniones de muestra de la resina usando 1 ml de una solución de acetato de amonio 50 mM (386 mg de acetato de amonio disueltos en 100 ml de H2O destilada) en un 1,5 ml tubo centrífugo. Eliminar el disolvente por evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad. NOTA: Las muestras secas pueden almacenarse a 4-6 ° C durante un máximo de 12 meses. </li></ol> 4. Aislamiento de los ácidos siálicos del tejido del hígado <ol><li> Descongelar suavemente 20 - 50 mg de hígado de ratón y transferirlo a un triturador de tejidos Dounce (1 mL o 2 mL de volumen). Añadir 1,2 ml de la solución acuosa de ácido acéticoPreparada en el paso 3.1 y homogeneizar el tejido por cizallamiento suave durante 10 s. Transferir la suspensión resultante a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Siga los pasos 3.3. A 3.6. NOTA: Las muestras secas pueden almacenarse a 4-6 ° C durante un máximo de 12 meses. </li></ol> 5. Preparación de una norma de ácido siálico mixto <ol><li> Pesar entre 5 - 8 mg de ácido N-acetilneuramínico sobre un equilibrio analítico en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Tenga en cuenta el peso exacto y añadir 164 l de H2O destilada por cada mg (es decir, si el peso de Neu5Ac es de 7,2 mg a continuación, añadir 7,2 x 164 = 1, 181 l de H2O destilada). Esto da como resultado una solución madre de Neu5Ac 20 mM que puede almacenarse a -20ºC durante hasta 12 meses. </li><li> Obtener ácido N-glicolilneuramínico en cantidades más pequeñas a un precio moderado tal como en alícuotas de 1 mg. Añadir 154! L de H2O destilada directamente en el compuesto con el fin de obtener una Neu5Gc mM solución madre ~ 20. Transferir elEn un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Esta solución se puede almacenar a -20 ° C durante un máximo de 12 meses. </li><li> Combinar 5 μL de cada solución madre de la etapa 5.1 y 5.2 en un tubo de centrifugación fresco de 1,5 ml y eliminar el disolvente por evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad. NOTA: El estándar de ácido siálico mixto se puede almacenar a 4 - 6 ° C por hasta 12 meses. </li></ol> 6. Derivatización de la fluorescencia de los ácidos siálicos <ol><li> Preparar 10 ml de OPD-solución, que consiste en 100 mg de o-fenilendiamina y 208 mg de sulfito de hidrógeno de sodio en 10 ml de H 2 O. destiló </li><li> Añadir 20 μl de solución de OPD a las muestras de ácido siálico derivadas de la leche de ratón (etapa 3), hígado de ratón (etapa 4) o el estándar de ácido siálico mixto (paso 5). Vortex vigorosamente durante 30 s e incubar las muestras durante 4 h a 80 ° C en la oscuridad ( es decir, envolver los microtubos en papel de aluminio). </li><li> Deje que las muestras se enfríen durante 5 min, agregue 80 μ; L de H 2 O destilada y centrifugar los tubos a 14.000 xg durante 1 min. </li><li> Transferir 80 μL del sobrenadante a un frasco de HPLC de alta recuperación de 300 μl. Las muestras derivatizadas de ácido siálico se pueden almacenar a 4-6 ° C durante una semana. </li></ol> 7. Análisis por HPLC de derivados de ácido siálico <ol><li> Analizar las muestras utilizando un sistema de HPLC estándar conectado a un detector de fluorescencia en línea. </li><li> Utilizar una columna de fase inversa C18 con las dimensiones estándar de 250 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro para el análisis. </li><li> Preparar el disolvente A diluyendo 200 ml de solución madre con 800 ml de agua de grado LCMS (LCMS - cromatografía líquida espectrometría de masas). La solución madre en sí puede prepararse como sigue: <ol><li> Añadir 46 g de ácido fórmico a 800 ml de H _ { 2} O de grado LCMS. </li><li> Ajustar el pH a 4,5 por adición gota a gota de solución de hidróxido de amonio (puriss pa). </li><li> Transferir el disolvente a unaY llenar hasta 1.000 ml con H 2 O de grado LCMS. Esta solución madre se puede almacenar a 4-6 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol></li><li> Para el disolvente B, utilice acetonitrilo de grado LCMS. </li><li> Se separan los derivados de los ácidos siálicos a un caudal de 1 ml / min con la siguiente elución con gradiente: <ol><li> Comience añadiendo el 10% de disolvente B mezclado al disolvente A. </li><li> De 0 min a 15 min, aumentar gradualmente la proporción de disolvente B con un gradiente lineal hasta 60%. </li><li> De 15 minutos a 16 minutos, aumentar rápidamente la proporción de disolvente B con un gradiente lineal de 60% a 90%. Esto inicia el lavado de la columna de HPLC. </li><li> Para lavar adicionalmente la columna de HPLC, mantener el nivel de disolvente B al 90% entre 16 min y 18 min antes de reducir gradualmente el nivel de disolvente B de nuevo a 10% entre 18 min y 19 min. </li><li> Reequilibrar la columna de HPLC a las condiciones de partida de 10% de B entre 19 y 24 min. </li></ol></li><li> En50 μL de muestra en el sistema de HPLC. </li><li> Los eluyentes de monitorización que utilizan las longitudes de onda de excitación / emisión de detector de fluorescencia de 373/448 nm, y los ácidos siálicos derivatizados se pueden esperar a los tiempos de retención aproximados de 9 min (para Neu5Gc-OPD) y 10 min (para Neu5Ac-OPD). </li><li> Calcular la cantidad relativa de Neu5Gc (F Neu5Gc ) de las áreas de pico de fluorescencia de Neu5Ac (A Neu5Ac ) y Neu5Gc (A Neu5Gc ) como sigue: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). En el caso de la leche y las muestras de hígado de homocigotos Cmah knockout ratón F Neu5Gc debe ser de 0%, mientras que los valores de F Neu5Gc de heterocigotos y de tipo salvaje ratones pueden variar ampliamente dependiendo de la edad del ratón y el tipo de tejido (entre el 2% Y&gt; 90%) con márgenes de error esperados de ± 12%. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí permite la evaluación fenotípica de ratones knock-out homocigóticos Cmah analizando y cuantificando las cantidades relativas de Neu5Gc de leche y muestras de hígado. El análisis se realizó utilizando una configuración de HPLC estándar con detección de fluorescencia. El paso más crítico de este procedimiento es la preparación de las columnas de intercambio aniónico y la realización de la cromatografía de intercambio aniónico; Para sedimentar la resina adecuadamente y para re...

El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) son los ácidos siálicos más comunes en la mayoría de los mamíferos 1 . Aunque son capaces de sintetizar endógenamente Neu5Ac, los seres humanos no son capaces de producir Neu5Gc debido a una deleción primaria de exón en el gen CMAH que codifica para una hidroxilasa 2 , 3 de CMP-Neu5Ac. Sin embargo, los productos alimenticios de origen animal pueden ser fuentes dietéticas de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , lo que conduce a la producción de anticuerpos anti-Neu5Gc y por lo tanto, desencadenar una respuesta inmune hacia Neu5Gc 7 . Se sospecha que este efecto en la dieta de Neu5Gc contribuye a la inflamación crónica ya otras diversas enfermedades 8 , 9 , 10 . Con el fin de comprender ampliamente los efectos de Neu5Gc en hUn modelo animal para el estudio sistemático de los efectos de los ácidos siálicos transmitidos por los alimentos es altamente deseable. Aunque los protocolos basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el análisis de ratones knock-out están bien establecidos y una manera conveniente para la evaluación genotípica, el análisis funcional del fenotipo en el nivel metabólico requiere métodos de análisis más específicos. El fenotipo de un modelo de ratón knock-out Cmah se puede evaluar aislando y analizando la composición de ácidos siálicos en muestras de hígado o leche. Varios métodos para la detección de ácidos siálicos en tejidos animales han sido reportados previamente: la reacción de ácidos siálicos con resorcinol 11 o ácido tiobarbitúrico 12 da como resultado la formación de un producto cromóforo y puede analizarse simplemente usando una configuración basada en platereader, pero sólo la sialic total Se puede determinar el contenido de ácido. Alternativamente, el análisis de ácidos siálicos también se describió usando cromatografía de gases13 , espectrometría de masas MALDI-ToF 14 o métodos amperométricos 15 . Sin embargo, los métodos de análisis de ácido siálico más comúnmente aplicados se basan en la liberación hidrolítica, seguido por derivatización de fluorescencia y cromatografía líquida subsiguiente de alto rendimiento 16 , 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td><fuerte>químicos:</fuerte></td>N-acetilneuramínico ácido Sigma A0812 N-glicolilneuramínico Sigma 50644 1 mg alícuota debería ser suficiente o-fenilendiamina Sigma 694975 Sulfito de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> hidrógeno de sodio J&<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Herramientas/Materiales:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL Tubos SPE</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>columnas de extracción vacías en fase sólida</td></tr><tr><td>Luer llave de paso Sigma</td><td></td><td>S7396</td><td>para detener el flujo del tubo SPE</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 malla</td></tr><tr><td>Amoladora de tejidos Dounce</td><td>Sigma</td><td>D8938</td> ajuste <td>apretado</td></tr><tr><td><fuerte> análisis de HPLC: </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vial de HPLC de alta recuperación</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Detector de fluorescencia para HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Columna</td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>Grado LCMS H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo de grado LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de amonio</td> hipergrado <td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss. P.a.</td></tr></tbody></table>

determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y<em&gt; cmah</em&gt; ratones knock-out.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

El CMAH (citidina monofosfato-N-acetilneuramínico hidroxilasa) es responsable de la oxidación de citidina monofosfato-N-acetilneuramínico en mamíferos. Sin embargo, los seres humanos no pueden oxidar el ácido monofosfato de citidina-N-acetilneuramínico a ácido monofosfato de citidina-N-glicolilneuramínico debido a una deleción del exón primario del gen CMAH . Para entender los efectos y las implicaciones de la falta de actividad de CMAH con más detalle, un modelo de eliminación de Cmah en ratones es de gran interés en la investigación básica y aplicada. El método de análisis para determinar el fenotipo de este modelo de ratón se describe aquí en detalle y se basa en la detección de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en el hígado y leche de ratones knock-out de tipo salvaje y Cmah . Los ácidos siálicos endógenos se liberan y se derivatizan con o-fenilendiamina para generar derivados fluorogénicos, que pueden analizarse posteriormente por HPLC. El protocolo presentado puede serTambién se aplicó para el análisis de leche y muestras de tejidos de otros orígenes, y puede ser útil para investigar los efectos nutricionales y para la salud del ácido N-glicolilneuramínico.

Una representación esquemática del método de análisis descrito se muestra en la Figura 1 e incluye el aislamiento de ácidos siálicos de leche y muestras de hígado de ratones mutantes knock-out de tipo salvaje y Cmah y la derivatización de fluorescencia y análisis HPLC de estos componentes. La Figura 2 y la Figura 3 muestran cromatogramas HPLC representativos de ácidos siálicos derivatizados...

Se describe un método basado en HPLC para la determinación de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en hígado y leche de ratón.

Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y<em&gt; CMAH</em&gt; Ratones knock-out.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

El objetivo general de esta metodología es la detección de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicilneuramínico en el hígado y la leche de ratones de tipo silvestre y ratones knock-out de CMAH mediante análisis por HPLC. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la glicosciencia, específicamente el efecto que los genotipos de modelos de ratones CMAH tienen sobre los contenidos reales de ácidos siálicos en estos animales. La principal ventaja que tiene esta técnica en comparación con las pruebas genéticas es que se pueden determinar los niveles relativos de ácidos siálicos también en ratones heterocigotos.La evaluación de este método estará a cargo de Cui Cao y Wang Wenjiao, dos estudiantes de posgrado de nuestro laboratorio. Comience este procedimiento con la recolección de leche de ratón y tejido hepático de ratones con nulificación del gen CMAH, tal como se describe en el protocolo escrito. Para aislar los ácidos siálicos de la leche, transfiera 50 microlitros de leche a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y agregue 1,2 mililitros de solución acuosa de ácido acético preparada.Para aislar ácidos siálicos del tejido hepático, descongele suavemente de 20 a 5

determination-sialic-acids-liver-milk-samples-wild-type-cmah-knock

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Investigación

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Biología

Muestras de tejido congeladas no fijadas embebidas en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) se puede utilizar para estudiar la distribución natural y glicosilación de moco secretado. En este enfoque de procesado de tejido es mínima y la presentación natural de glicolípidos, mucinas y glycan epítopos-se conserva. Las secciones de tejido pueden ser analizadas por inmunohistoquímica usando detección de fluorescencia o cromogénico.

El uso de tejidos no fijadas, congeladas para estudiar la distribución de mucina Natural

En este video, demostramos la detección de ácidos siálicos, ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilneuramínico, utilizando cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, después de la derivatización con un reactivo de marcado fluorescente adecuado para ayudar en la detección de fluorescencia.

Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa: un método robusto para la cuantificación de ácidos siálicos marcados y derivatizados con fluorescencia aislados de hígado de ratón

La recolección de leche a partir de modelos animales facilita varias vías de investigación: comprender la inmunidad pasiva, identificar patógenos responsables de la transmisión vertical y, mediante el uso de ratones transgénicos, incluso la producción comercial de proteínas que se encuentran en la leche materna humana. Aquí ilustramos un método simple para la recolección de leche en ratones y ciervos muntjac de Reeves.

Métodos de recolección de leche Ratones y Reeves Muntjac Deer

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Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

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Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

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Una técnica eficiente para una sola persona para el muestreo de leche de ratones de laboratorio

Aprende a detectar ácidos siálicos en hígado y leche de ratones CMAH usando cromatografía HPLC. Este método permite cuantificar N-acetilneuramínico y N-glicolilneuramínico en genotipos homocigotos y heterocigotos.

Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y

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