Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

El objetivo general de este experimento es estudiar y validar la interacción entre un complejo proteico heteromérico y el ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio genómico funcional en un entorno de laboratorio convencional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional, como la genómica planificada. La principal ventaja de esta técnica es que detecta interacciones entre proteínas y ADN que involucran más de una proteína o factor de transcripción.

Comience este procedimiento en la tarde de lo que se designará como día uno. Inocule un cultivo de 5 mililitros en medio sintético definido o medio SD sin uracilo, a partir de una placa de Petri recién rayada. Incube durante la noche en un agitador a 30 grados Celsius.

El día siguiente por la tarde, inocular 10 mililitros de medio YPDA con 500 microlitros de la cultura nocturna e incubar durante la noche en un agitador a 30 grados Celsius. Temprano en la mañana del día siguiente, inocular 100 mililitros de medio YPDA con 2 mililitros de la cultura nocturna. Crecer esta cultura fresca a 30 grados Celsius hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance entre 0,4 y 0,8.

Centrifugar a 1000 veces G y 21 grados Celsius durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante. Añadir 10 mililitros de agua estéril y reconstituir el precipitado mediante vortex.

Centrifugar a 1000 veces G y 21 grados Celsius durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante, agregar 2 mililitros de acetato de litio TE y reconstituir el precipitado mediante vortex. Centrifugar a 1000 veces G y 21 grados Celsius durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante. Añada 4 mililitros de acetato de litio TE más 400 microlitros de ADN de esperma de salmón y resuspenda el precipitado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Las células ya están listas para la transformación, como se muestra en el siguiente segmento.

La co-transformación de las células se realiza en una placa de mezcla de 96 pocillos con fondo redondeado. Primero, distribuya 20 microlitros de células competentes por pocillo en la placa de 96 pocillos. Luego, añada a los pocillos 150 nanogramos de cada uno de los dos plásmidos y el control de normalización.

Este esquema muestra la configuración general de la placa para la co-transformación de las células de levadura con la proteína de interés. La configuración de la placa puede modificarse según las necesidades del experimento y el número de regiones o fragmentos de ADN que se prueben. Añada 100 microlitros de acetato de litio TE con polietilenglicol por pozo y mezcle tres veces mediante pipeteo.

Cubra la placa con un sello permeable y coloque a incubar a 30 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. Aplicar choque térmico a 42 grados Celsius durante exactamente 20 minutos. Después del choque térmico, centrifugar a 1000 veces G y 21 grados Celsius durante 5 minutos.

Utilice una pipeta multicanal para eliminar el sobrenadante. Añada 110 microlitros de TE y mezcle. Vuelva a centrifugar durante 5 minutos.

Retire 100 microlitros del sobrenadante de cada pocillo. Sumerja un punzón en etanol al 100 %, quémelo, espere un minuto a que se enfríen las agujas del punzón y luego use el punzón estéril para resuspender el sedimento. Transfiera las células a placas de agar con medio SD deficiente en triptófano y leucina.

Incube las placas a 30 grados Celsius durante dos días. Por la tarde del día cinco, retire las placas de agar del incubador. Agregue 50 microlitros de TE a cada pocillo de la placa de mezcla estéril de 96 pocillos con fondo redondeado. Humedezca previamente un punzón estéril en TE, extraiga las colonias de la placa de depleción de SD con triptófano y leucina, y resuspenda las colonias en la placa con TE.

Transfiera las colonias a nuevas placas SD sin triptófano y leucina, para obtener una cobertura superficial óptima. Incube las placas a 30 grados Celsius durante 2 días. En la tarde del día 7, retire las placas SD sin triptófano y leucina del incubador.

Llene cada pocillo de una placa estéril de mezcla de 96 pocillos con fondo redondo con 50 microlitros de medio de descarte de SD con triptófano y leucina. Llene cada pocillo de un bloque estéril de 96 pocillos profundos con 180 microlitros de medio de descarte de SD con triptófano y leucina. Esterilice el punzón, humedezca previamente el punzón y el medio, y transfiera colonias desde la placa hacia los pocillos que contienen 50 microlitros de medio cada uno.

Transfiera 20 microlitros de levadura al medio de eliminación de triptófano y leucina SD de 180 microlitros. Selle el bloque con un sello permeable al aire e incube a 30 grados Celsius con agitación durante 36 horas. Por la mañana del día nueve, transfiera 100 microlitros de cultivo a 500 microlitros de medio YPDA en un bloque esterilizado de 96 pozos profundos.

Cubra con un sello permeable y incube a 30 grados Celsius con agitación a 200 rpm durante tres a cinco horas. Después de tres a cinco horas, re-suspenda el cultivo y transfiera 125 microlitros de cada pocillo a una placa para espectrofotómetro. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros para asegurar que se encuentre entre 0.3 y 0.6.

Centrifugar las células restantes en la placa de pozos profundos a 3000 veces G y 21 grados Celsius durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. Añadir 200 microlitros de tampón Z a cada pocillo y mezclar mediante vortex.

Centrifugar a 3000 G y 21 grados Celsius durante cinco minutos. Eliminar el sobrenadante invirtiendo el tubo. Añadir 21 microlitros de tampón Z a cada pocillo y vortexear.

Cubra la placa con una lámina selladora resistente a ciclos de congelación y descongelación. En una campana extractora, realice 4 ciclos de congelación/descongelación utilizando nitrógeno líquido y un baño de agua a 42 grados Celsius. Añada 200 microlitros de solución recién preparada de tampón Z, beta-mercaptoetanol y ONPG a cada pocillo.

Incubar a 30 grados Celsius durante 17 a 24 horas o hasta que se desarrolle el color. Por la mañana del día 10, verifique que se haya desarrollado el color. Añadir 110 microlitros de carbonato de sodio uno molar a cada pocillo para detener la reacción.

Registre el tiempo y agite la placa en vórtex. Centrifugue a 3000 veces G y 21 grados Celsius durante diez minutos. Utilice una pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada pocillo a una placa para espectrofotómetro.

Mida la densidad óptica a 420 nanómetros. Calcule la actividad de beta galactosidasa en una hoja de cálculo según se describe en el protocolo del texto. En este estudio, la región promotora de 2600 pares de bases ubicada aguas arriba del inicio del sitio de inicio de la transcripción se segmentó en seis regiones o fragmentos.

Esta foto es un ejemplo de una placa bien desarrollada y positiva tras el quinto día del protocolo. En este resultado representativo, los fragmentos de ADN uno y cuatro muestran interacción positiva con el complejo de las proteínas A y B. Tras la medición de la actividad de beta-galactosidasa, el fragmento uno muestra una inducción de cuatro veces la actividad del gen reportero.

Es importante recordar que este procedimiento se recomienda únicamente para obtener información sobre regiones de ADN tras la confirmación de la interacción proteína-proteína propuesta, y no está diseñado para proporcionar información sobre los sitios diana. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo ChIP y MSAR, con el fin de responder preguntas adicionales. Por ejemplo, identificar los sitios diana in vivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar y validar el papel de los complejos proteicos multiméricos que se unen a un objetivo de ADN común.