Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.

El objetivo general de este experimento es estudiar y validar la interacción heteromérica proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio genómico funcional en un entorno de laboratorio regular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional, como la genómica planificada. La principal ventaja de esta técnica es que detecta interacciones proteína-ADN que involucran a más de una proteína o factor de transcripción.

Comience este procedimiento en la tarde de lo que se designará como el primer día. Inicie un cultivo de 5 mililitros en medio sintético definido o SD sin uracilo de una placa de Petri recién rayada. Incubar durante la noche en un agitador a 30 grados centígrados.

A la tarde siguiente, inocule 10 mililitros de medio YPDA con 500 microlitros del cultivo durante la noche e incube durante la noche en un agitador a 30 grados centígrados. Temprano en la mañana del día siguiente, inocule 100 mililitros de medio YPDA con 2 mililitros del cultivo durante la noche. Cultive este cultivo fresco a 30 grados centígrados hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance de 0,4 a 0,8.

Centrifugar a 1000 veces G y 21 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante. Añadir 10 mililitros de agua estéril y reconstituir el pellet por vórtice.

Centrifugar a 1000 veces G y 21 grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante, agregue 2 mililitros de acetato de litio TE y reconstituya el pellet por vórtice. Centrifugar a 1000 veces G y 21 grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante. Agregue 4 mililitros de acetato de litio TE más 400 microlitros de ADN de esperma de salmón y vuelva a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Las células ya están listas para la transformación, como se demuestra en el siguiente segmento.

La cotransformación de las células se realiza en una placa mezcladora de fondo en U de 96 pocillos. Primero, distribuya 20 microlitros de células competentes por pocillo en la placa de 96 pocillos. A continuación, se añaden a los pocillos, 150 nanogramos cada uno de los dos plásmidos y el control de normalización.

Este esquema muestra la placa general configurada para la co-transformación de las células de levadura con la proteína de interés. La configuración de la placa se puede modificar de acuerdo con la necesidad del experimento y el número de regiones o fragmentos de ADN analizados. Agregue 100 microlitros de polietilenglicol de acetato de litio TE por pocillo y mezcle tres veces por pipeteo.

Cubra la placa con un sello transpirable e incube a 30 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Choque térmico a 42 grados centígrados durante exactamente 20 minutos. Después del choque térmico, centrifugar a 1000 veces G y 21 grados centígrados durante 5 minutos.

Utilice una pipeta multicanal para eliminar el sobrenadante. Agrega 110 microlitros de TE y mezcla. Vuelva a centrifugar durante 5 minutos.

Retire 100 microlitros del sobrenadante de cada pocillo. Sumerja un punzón en etanol al 100%, enciéndalo, espere un minuto a que se enfríen los pines del perforador y luego use el perforador estéril para volver a suspender el pellet. Transfiera las celdas a las placas de sinfín de caída de triptófano y lucina SD.

Incubar las placas a 30 grados centígrados durante dos días. En la tarde del quinto día, recupere las placas de barrena de la incubadora. Llene cada pocillo de la placa mezcladora estéril de 96 pocillos con fondo en U con 50 microlitros de TE. Prehumedezca un perforador estéril en TE, perfore las colonias de la placa de caída de triptófano y lucina SD y vuelva a suspenderlas en la placa llena de TE.

Transfiera las colonias a las nuevas placas de barrena de caída de triptófano y lucina SD, para una cobertura óptima de la superficie. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 2 días. En la tarde del día 7, recupere las placas de barrena de la incubadora.

Llene cada pocillo de una placa mezcladora estéril de 96 pocillos con 50 microlitros de triptófano SD y medio de extracción de lucina. Llene cada pocillo de un bloque estéril de 96 pocillos profundos con 180 microlitros de triptófano SD y medio de caída de lucina. Esterilice el perforador, humedezca previamente el punzonador y el medio, y transfiera las colonias de la placa a los pocillos que contienen 50 microlitros de medio cada uno.

Transfiera 20 microlitros de levadura a los 180 microlitros de triptófano SD y medio de caída de lucina. Selle el bloque con un sello transpirable e incube a 30 grados centígrados agitando durante 36 horas. En la mañana del noveno día, transfiera 100 microlitros de cultivo a 500 microlitros de medio YPDA en un bloque esterilizado de 96 pocillos profundos.

Cubrir con un sello transpirable e incubar a 30 grados centígrados con agitación a 200 rpm durante tres a cinco horas. Después de tres a cinco horas, vuelva a suspender el cultivo y transfiera 125 microlitros de cada pocillo a una placa de espectrofotómetro. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros para asegurarse de que esté entre 0,3 y 0,6.

Centrifugar las celdas restantes en el bloque de pozo profundo a 3000 veces G y 21 grados Celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante invirtiendo. Agregue 200 microlitros de tampón Z a cada pocillo y vórtice.

Centrifugar a 3000 g y 21 grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante invirtiendo. Agregue 21 microlitros de tampón Z a cada pozo y vórtice.

Cubra la placa con papel de sellado que sea resistente a los ciclos de congelación y descongelación. En una campana extractora, realice 4 ciclos de congelación/descongelación con nitrógeno líquido y un baño de agua a 42 grados centígrados. Agregue 200 microlitros de solución de beta mercaptoetanol ONPG de tampón Z recién preparada a cada pocillo.

Incubar a 30 grados centígrados durante 17 a 24 horas o hasta que se desarrolle el color. En la mañana del día 10, comprueba que el color se ha desarrollado. Agregue 110 microlitros de carbonato de sodio molar a cada pocillo para detener la reacción.

Registre el tiempo y el vórtice de la placa. Centrifugar a 3000 veces G y 21 grados centígrados durante diez minutos. Utilice una pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada pocillo a una placa de espectrofotómetro.

Mide la densidad óptica a 420 nanómetros. Calcule la actividad de la beta galactosidasa en una hoja de cálculo como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la región promotora de 2600 pares de bases aguas arriba desde el inicio del sitio de inicio de la transcripción se segmentó en seis regiones o fragmentos.

Esta foto es un ejemplo de un plato bien crecido y positivo después del quinto día del protocolo. En este resultado representativo, los fragmentos de ADN uno y cuatro muestran una interacción positiva con el complejo de proteínas A y B. Tras la medición de la actividad de la beta golactisidasa, el fragmento uno muestra una inducción cuádruple de la actividad del gen reportero.

Es importante recordar que este procedimiento se recomienda para obtener información sobre las regiones del ADN solo después de la confirmación de la interacción proteína-proteína propuesta y no está diseñado para proporcionar información de los sitios objetivo. Siguiendo estos procedimientos, se pueden preformar otros métodos, como el ensayo de chips y el Msar, para responder a preguntas adicionales. Por ejemplo, la identificación de los sitios objetivo in vivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar y validar el papel de los complejos de proteínas multiméricas que se unen a un objetivo de ADN común.