Name: Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a evaluar anticuerpos IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos mediante microarrays de sialoglucanos de alto rendimiento. Esta técnica permite el perfilado de anticuerpos para investigar su papel en cáncer e inflamación crónica.

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Este trabajo fue apoyado en parte por un Premio de Investigación de Desarrollo de Carrera del Fondo de Investigación de Cáncer de Israel, una subvención de la Iniciativa Nacional de Nanotecnología de Israel y el Helmsley Charitable Trust para un Área de Tecnología Focal en Nanomedicines para Theranostics Personalizada (VP-K) Institutos de Salud R01GM076360 (a XC).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una fabricación exitosa de microarray de glycan requiere una planificación cuidadosa e incluye varios pasos importantes en el protocolo. Estos incluyen: (1) la planificación de los diseños de bloques y placas que definen todos los parámetros subsiguientes ( por ejemplo, distancias, espaciado, cantidad de muestras e impresión); (2) limpiar los pasadores y asegurar la integridad del pasador, lo cual es crítico para controlar la homogeneidad del punto; (3) mantener una alta humedad durante la impresión, fundamenta...

Los sias son azúcares ácidos que cubren las cadenas de glicanos sobre las glicoproteínas de la superficie celular y los glicolípidos en los vertebrados. La expresión de Sia se modifica en las células cancerosas 1 y se correlaciona con la progresión y / o metástasis 2 , 3 . Dos de las principales formas de Sia en los mamíferos son Neu5Ac y su forma hidroxilada, Neu5Gc 2 . Los seres humanos no pueden sintetizar Neu5Gc debido a una inactivación específica del gen que codifica la enzima CMAH. Este Sia no humano incorpora metabólicamente en las células humanas como &quot;yo&quot;, originado de alimentos ricos en Neu5Gc dietéticos ( por ejemplo, carne roja) 4 , 5 . Neu5Gc está presente en niveles bajos en las superficies celulares de epitelios humanos y endotelios, pero se acumula especialmente en los carcinomas. Neu5Gc es reconocido como extraño por el sistema inmune humanos humoral 2 , 6 .La complejidad antigénica de Neu5Gc-glicanos puede surgir a múltiples niveles, incluyendo Neu5Gc modificación, vinculación, glycans subyacente y andamios, y su densidad, todo reflejado por la complejidad de anti-Neu5Gc respuesta de anticuerpos en los seres humanos [ 6] . Algunos de estos anticuerpos sirven como biomarcadores de carcinoma y inmunoterapéuticos potenciales [ 7] . El advenimiento de la síntesis quimioenzimática de diferentes sialoglicanos 8 abrió el camino para el más análisis en profundidad de dichos anticuerpos, facilitado por el uso de la tecnología de microarrays glicano 9, 10. Por lo tanto, con la facilidad de preparación y manipulación de grandes bibliotecas de carbohidratos naturales y sintéticos, los microarrays de glicano se han convertido en una poderosa tecnología de alto rendimiento para investigar las interacciones de los carbohidratos con una miríada de biomoléculas 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 . En un formato de matriz, se utilizan cantidades mínimas de materiales, y esta presentación multivalente de glicanos biológicamente relevantes permite la investigación de miles de interacciones de unión en un solo experimento. Es importante destacar que esta tecnología también puede aplicarse al descubrimiento de biomarcadores y al seguimiento de respuestas inmunes en varias muestras [ 7 , 12] . La fabricación exitosa de microarray de glycan requiere la consideración de tres aspectos importantes: el tipo de robot de impresora, la química de conjugación de glicano y la óptica de detección. En cuanto a la consideración del instrumento de impresión, existen dos técnicas: impresoras de contacto y sin contacto. En la impresión de contacto, se sumergen 1-48 clavijas de acero en una placa de fuente de pocillos múltiples que contiene solución de glicano y se manchan en portaobjetos de vidrio funcionalizados poniendo en contacto directamente la superficie de deslizamiento de vidrio. La cantidad de solución deQue se fija a la corredera es una función de la duración prolongada de la superficie de deslizamiento. Por lo general, las muestras se pre-manchan primero en un bloque de vidrio (para llegar a puntos homogéneos) antes de que se impriman en la superficie de la diapositiva. En impresoras sin contacto ( por ejemplo, la impresora piezoeléctrica), los glicanos se imprimen a partir de un capilar de vidrio usando señales eléctricas controladas. La señal eléctrica puede calibrarse finamente para conseguir una impresión más precisa en relación con la impresión por contacto. El tamaño y la morfología de las manchas son también relativamente más homogéneas. Una ventaja adicional es el reciclado de la muestra de vuelta a la placa fuente después de la impresión. Sin embargo, la principal desventaja de las impresoras piezoeléctricas es la limitación de la punta de impresión (4 u 8), dando como resultado una duración de impresión muy larga, lo que requiere una especial atención a la estabilidad de la diapositiva, temperatura, humedad y evaporación de la muestra. La impresora de inyección de tinta sin contacto requiere volúmenes de muestra más grandes 14 . <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; En contraste con las limitadas opciones disponibles para los métodos de impresión, la química de conjugación de glicanos es una consideración más compleja, con muchas opciones para elegir. La química de inmovilización seleccionada debe tener en cuenta tanto los grupos activos sobre los glicanos como la reactividad de la superficie deslizante. Los glicanos que se inmovilizarán sobre una superficie de microarrays específica, sintetizada sintéticamente o aislada naturalmente, requieren un grupo reactivo idéntico. Además, los glicanos necesitan ser puros y homogéneos. Por otro lado, la superficie de inmovilización y la química deben proporcionar reproducibilidad y densidad de unión fiable. Se han desarrollado múltiples métodos de inmovilización con uniones covalentes o no covalentes (absorción física) 10 , 11 , 12 , 13 . Para información altamente detallada sobre la tecnología de microarray de glicano impreso para los no iniciadosD investigador, refiérase a estas excelentes revisiones 13 , 15 . Es importante destacar que la reciente información mínima requerida para una iniciativa de Glycomics Experiment (MIRAGE) describe pautas para la preparación de muestras 16 y para reportar los datos de los análisis de microarray de glycan 17 para mejorar los estándares en este campo en crecimiento. Aquí, describimos un protocolo detallado para la fabricación de sialoglycan microarrays utilizando un contacto específico nano-impresora en un formato de 16 pozos. Cada uno de los glicanos tiene una amina primaria que median su enlace covalente con diapositivas de vidrio activadas con epoxi. También describimos el desarrollo y el análisis de una diapositiva usando varias muestras de suero humano, anticuerpos y lectinas de plantas de unión a Sia. Los ensayos de microarrays de Sialoglycan implican varios pasos importantes que incluyen la fabricación, procesamiento, desarrollo y análisis de la matriz. La fabricación de arrays requiere la planificación del arLa preparación de los glicanos y la placa fuente, la programación de la nano-impresora y la impresión de las diapositivas. Posteriormente, las diapositivas se procesan, desarrollan y analizan ( Figura 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sialoglicanos que contienen amina primaria</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, EE. UU. (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Póngase en contacto con info@glycohubusa.com para solicitudes de compuestos</td><td>Glicanos impresos</td></tr><tr><td>Fosfato monosódico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Componente tampón de impresión</td></tr><tr><td>Fosfato disódico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Componente tampón de impresión</td></tr><tr><td>Fosfato solución salina tamponada</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Tampón de impresión/tampón de incubación/lavado</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td>Sigma T1503</td><td>Reactivo de bloqueo de portaobjetos</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Componente de tampón de impresión</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Reactivo de bloqueo de portaobjetos</td></tr><tr><td>Ovoalbúmina (Grado V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Proteína bloqueadora de deslizamiento</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Detergente de lavado de portaobjetos</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker en matriz</td></tr><tr><td>ChromPure IgG humana, molécula entera</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Componente de impresión</td></tr><tr><td>Biotinilado- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Planta Lectina &ndash; unión Sia-alpha2&ndash; </td></tr><tr><td>Laboratorios de vectores</td><td>Biotinilados-MALII</td> de 6 enlaces <td>B-1265</td><td>Lectina vegetal &ndash; unión Sia-alpha2 &ndash; </td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td> de 3 enlaces <td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Detección primaria</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Unión a biotina</td></tr><tr><td>Cy3-anti IgG humana</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Detección secundaria contra IgG humana</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secundaria detección contra pollos IgY</td></tr><tr><td>Muestras de sueros humanos</td><td>Banco de Sangre</td><td></td> Israelí <td>Detección primaria</td></tr><tr><td>Nitrógeno comprimido (Grado 5)</td><td></td><td></td><td>Herramienta general para desempolvar/secar</td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos de epoxi</td><td>Correderas Corning</td><td>40044</td><td>Portaobjetos</td></tr><tr><td>Recubiertos de epoxi</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Diapositivas. En este tipo de portaobjetos, la superficie es más hidrofóbica (en comparación con los portaobjetos de extracción de núcleo), por lo tanto, el tampón de impresión de glicanos necesitaría complementarse con 0,005% Tween-20 para obtener 100 &micro; Manchas de tamaño m.</td></tr><tr><td>Placa de microtitulación de 384 pocillos</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Plancha de impresión</td></tr><tr><td>VWR marcador de laboratorio</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Etiquetado de portaobjetos</td></tr><tr><td>Tubo de tinción</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Herramienta de revelado de portaobjetos</td></tr><tr><td>Baño de tinción</td><td>VWR</td><td>25608-904 Herramienta de</td><td>revelado de</td></tr><tr><td>portaobjetos Portavasos portaobjetos</td><td>VWR</td><td>631-9321 Herramienta</td><td></td></tr> <tr><td>de revelado de portaobjetosEscáner GenePix</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>4000B</td><td>Escáner de diapositivas</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Pines de impresora</td></tr><tr><td>Array ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Pines de impresión</td><td></td></tr><tr><td>Módulo ProPlate</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Módulo de revelado de diapositivas</td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Necesario para el arrayer y el humidificador</td></tr><tr><td>Multi Pippete Electrónico, 8 Canales, rango de volumen 2-125 &mu; L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pippete para la distribución de muestras en una placa de 384 pocillos</td></tr></tbody></table>

perfilación de igg anti-neu5gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

Las células están cubiertas con un manto de cadenas de carbohidratos (glicanos) que se altera habitualmente en el cáncer y que incluye variaciones en la expresión del ácido siálico (Sia). Se trata de azúcares ácidos que tienen una cadena principal de 9 carbonos y que tapan los glicanos vertebrados en las superficies celulares. Dos de las principales formas de Sia en los mamíferos son el ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) y su forma hidroxilada, el ácido N- glicolilneuramínico (Neu5Gc). Los seres humanos no pueden producir Neu5Gc endógeno debido a la inactivación del gen que codifica la citidina 5&#39;monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroxilasa (CMAH). Neu5Gc extranjero es adquirido por las células humanas a través del consumo de la dieta de la carne roja y lácteos y posteriormente aparece en diversos glicanos en la superficie celular, acumulando principalmente en carcinomas. En consecuencia, los seres humanos tienen anticuerpos circulantes anti-Neu5Gc que desempeñan diversos papeles en el cáncer y otras enfermedades crónicas mediadas por la inflamación y que se están convirtiendo en potencial diagnóstico y terapéutico.Rgets Aquí, se describe un alto rendimiento sialoglycan microarray ensayo para evaluar tales anticuerpos anti-Neu5Gc en el suero humano. Los glicanos que contienen Neu5Gc y sus pares emparejados de controles (glicanos que contienen Neu5Ac), cada uno con una amina primaria de núcleo, están unidos covalentemente a diapositivas de vidrio revestidas con epoxi. Ejemplificamos la impresión de 56 diapositivas en un formato de 16 pozos utilizando una nano-impresora específica capaz de generar hasta 896 matrices por impresión. Cada diapositiva puede usarse para examinar 16 muestras de suero humano diferentes para la evaluación de la especificidad, intensidad y diversidad de anticuerpos anti-Neu5Gc. El protocolo describe la complejidad de esta herramienta robusta y proporciona una guía básica para aquellos que buscan investigar la respuesta al antígeno de carbohidratos dietéticos Neu5Gc en diversas muestras clínicas en un formato de matriz.

Impresión, Desarrollo y Análisis de Array: La impresión de un microarray de sialoglycan con múltiples muestras de glicanos y curvas de IgG de IgG humana en 16 bloques diferentes requiere una calibración completa para asegurar que todas las muestras se impriman lo más uniformemente posible en los 16 bloques por diapositiva y todas las diapositivas en la misma tirada. Por lo tanto, se requieren experimentos de calibración múltiples...

Se puede utilizar un ensayo de microarrays de sialoglucano para evaluar anticuerpos anti-Neu5Gc en sueros humanos, lo que lo convierte en un posible ensayo diagnóstico de alto rendimiento para el cáncer y otras enfermedades humanas mediadas por inflamación crónica.

Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

El objetivo general del ensayo de microarrays de sialoglicano es evaluar la IgG Anti-Neu5Gc en sueros humanos de alto rendimiento frente a una colección diversa de sialoglicanos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la glucoinmunología, como la forma en que los anticuerpos Anti-Neu5Gc están involucrados con diversas enfermedades humanas, como el cáncer, las enfermedades cardíacas y los xenotrasplantes. La principal ventaja de esta técnica es que permite el perfilado de alto rendimiento de anticuerpos Anti-Neu5Gc frente a una miríada de antígenos sialoglicanos.La demostración del procedimiento estará a cargo de Sharon Yehuda, una estudiante de maestría de mi laboratorio. La planificación cuidadosa y detallada de la fabricación y el diseño de la matriz es importante para garantizar el éxito. Este proceso se detalla en el protocolo de texto y en la información complementaria.Diluya cada glicano a 100 micromolares en un volumen total de 100 microlitros de tampón de impresión de glicanos en tubos de microcentrífuga. A continuación, prepare la amina primaria que contiene un tinte fluorescente a un miligramo por milímetro con tampón marcador. Luego, diluya a

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Este video muestra la tecnología de matriz de glicanos impresa para analizar los anticuerpos antiglicanos circulantes en suero de ratón. Los anticuerpos en el suero interactúan con glicanos específicos en el chip, lo que se confirma mediante inmunotinción seguida de escaneo de fluorescencia.

Detección de anticuerpos antiglicanos circulantes con una matriz de glicanos impresa

Utilizando una estrategia de microarrays de glicanos impresos, se miniaturizó un ensayo convencional de placa de 96 pocillos para analizar la avidez de hemaglutinina del virus de la influenza A y la especificidad de los receptores que contienen ácido siálico.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Describimos aquí un método para generar microarrays de antígenos personalizables que se pueden utilizar para la detección simultánea de autoanticuerpos séricos IgG e IgM de humanos y ratones. Estas matrices permiten la detección cuantitativa y de alto rendimiento de anticuerpos contra cualquier antígeno o epítopo de interés.

Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

Este trabajo muestra el potencial de la tecnología de glicanos impreso array (PGA) para el análisis de la circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales.

Variedad de glicanos impresos: Una técnica sensible para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales

Presentamos un protocolo para el uso de un microarray proteico construido mediante la impresión de antígenos de la gripe en diapositivas recubiertas de nitrocelulosa para sondear simultáneamente el suero de múltiples anótipos de anticuerpos contra más de 250 antígenos de diferentes cepas de virus, por lo tanto permitiendo la medición de la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus.

Uso de un microarreglo antigonagen antigripal para medir la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

El patrón de glicosilación de un anticuerpo determina su rendimiento clínico, por lo que persisten los esfuerzos industriales y académicos para controlar la glicosilación. Dado que las campañas típicas de glicoingeniería requieren mucho tiempo y mano de obra, la generación de un protocolo rápido para caracterizar el impacto de los genes de glicosilación utilizando silenciamiento transitorio resultaría útil.

Glicoingeniería rápida de anticuerpos en células de ovario de hámster chino

El perfil de polímeros de microarrays (MAPP) es una técnica de alto rendimiento para el análisis de la composición de glicanos en muestras biológicas.

Perfil de polímeros de microarrays (MAPP) para análisis de glicanos de alto rendimiento

Aprende a evaluar anticuerpos IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos mediante microarrays de sialoglucanos de alto rendimiento. Esta técnica permite el perfilado de anticuerpos para investigar su papel en cáncer e inflamación crónica.

Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano

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