Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano

El objetivo general del ensayo de microarrays de sialoglicano es evaluar la IgG Anti-Neu5Gc en sueros humanos de alto rendimiento frente a una colección diversa de sialoglicanos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la glucoinmunología, como la forma en que los anticuerpos Anti-Neu5Gc están involucrados con diversas enfermedades humanas, como el cáncer, las enfermedades cardíacas y los xenotrasplantes. La principal ventaja de esta técnica es que permite el perfilado de alto rendimiento de anticuerpos Anti-Neu5Gc frente a una miríada de antígenos sialoglicanos.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Sharon Yehuda, una estudiante de maestría de mi laboratorio. La planificación cuidadosa y detallada de la fabricación y el diseño de la matriz es importante para garantizar el éxito. Este proceso se detalla en el protocolo de texto y en la información complementaria.

Diluya cada glicano a 100 micromolares en un volumen total de 100 microlitros de tampón de impresión de glicanos en tubos de microcentrífuga. A continuación, prepare la amina primaria que contiene un tinte fluorescente a un miligramo por milímetro con tampón marcador. Luego, diluya a un microgramo por mililitro en un volumen total de un mililitro.

Prepare diluciones de la curva estándar de IgG humana como se describe en el protocolo de texto. Coloque la placa de 384 pocillos sobre hielo. Usando una pipeta electrónica múltiple, alícuota siete microlitros de cada glicano, marcador e IgG de curva de Stard de acuerdo con el diseño de la placa que se encuentra en el protocolo de texto.

Cubra la placa con parafilm y gire durante dos minutos a 250 veces g y 12 grados centígrados. La impresión debe realizarse en un área libre de polvo con una humedad del 60 al 70%Aquí, todos los pasos se realizan en una sala limpia con guantes y ropa adecuados para la protección. Encienda la máquina de nano impresora y el humidificador.

Después de programar la máquina de impresión como se describe en el protocolo de texto, coloque la placa de 384 pocillos con muestras alícuotas en su ubicación en la plataforma del arreglo y retire la cubierta del parafilm. En este punto, comience a imprimir. Numere las diapositivas con un rotulador resistente al alcohol y guárdelas en una caja sellada al vacío en la oscuridad.

Para procesar las matrices, primero retire una diapositiva de la caja sellada al vacío y colóquela en una campana química durante cinco minutos, con la matriz hacia arriba, para evaporar el exceso de líquido. A continuación, hidrata el portaobjetos colocándolo en un tubo de tinción lleno de agua desionizada. Cubra el tubo con papel de aluminio e incube durante cinco minutos agitando lenta y suavemente a temperatura ambiente.

Para bloquear los grupos epoxi reactivos en el portaobjetos, sumerja el portaobjetos en el tubo de tinción de 50 mililitros lleno de solución bloqueadora de etanolamina precalentada. Cubra el tubo con papel de aluminio e incube durante 30 minutos agitando lenta y suavemente a temperatura ambiente. Deseche la solución bloqueadora de etanolamina en el recipiente de basura de riesgo biológico apropiado.

Luego, coloque el portaobjetos en un tubo de tinción nuevo y limpio lleno de agua desionizada a 50 grados centígrados. Cubra el tubo con papel de aluminio e incube durante 10 minutos agitando lenta y suavemente a temperatura ambiente. Deseche el agua y transfiera los portaobjetos a un soporte para tinte de vidrio.

Coloque el aparato en un soporte de placa oscilante y centrifugue el portaobjetos para secarlo. A continuación, coloque la corredera en un divisor de 16 pocillos. Después de humedecer previamente los pocillos, use una pipeta múltiple para alícuota 200 microlitros de PBST en los pocillos deslizantes.

Luego, colóquelos en una cámara húmeda tapada y agite durante cinco minutos. Retire el PBST moviendo y golpeando suavemente una toalla de papel limpia. Luego, alícuota 200 microlitros de tampón bloqueador de PBS-ovoalbúmina en cada pocillo.

Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda e incube durante una hora a temperatura ambiente agitando suavemente. A continuación, prepare la detección principal, diluida en el búfer de bloqueo PBS-OVA como se describe en el protocolo de texto. Saque el tampón de bloqueo PBS-OVA del portaobjetos y agregue 200 microlitros de anticuerpo primario por pocillo.

Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante dos horas. A continuación, retire la detección primaria del portaobjetos y lávela tres veces con PBST. Incubar el portaobjetos en PBST durante cinco minutos en una cámara húmeda antes de lavar por última vez con PBST.

Luego, lávese una vez con PBS. A continuación, prepare el anticuerpo secundario en PBS como se describe en el protocolo de texto. Retire el PBS del portaobjetos y agregue 200 microlitros de anticuerpo secundario.

Retire el anticuerpo secundario del portaobjetos y lávese cuatro veces con PBST como antes. Retire con cuidado el marco, luego coloque los portaobjetos en un tubo de tinción de portaobjetos de 50 mililitros lleno de PBS y agite durante cinco minutos. A continuación, llene dos baños de tinción de portaobjetos con agua desionizada.

Coloque el portaobjetos en el portaobjetos y sumérjalo en el primer baño. Sumerge rápidamente el portaobjetos diez veces. Luego, transfiera el portaobjetos al segundo baño y sumérjalo diez veces más.

Después de sumergir, incube el portaobjetos durante diez minutos a temperatura ambiente agitando. Después de la incubación, deseche el agua y transfiera el portaobjetos a un soporte de vidrio para manchas. Coloque el soporte para tinturas de vidrio en un soporte de placa oscilante y centrifugue el portaobjetos para secar.

Abra la puerta del escáner y coloque la diapositiva en su interior, con la matriz hacia abajo. En este punto, comience el escaneo. Guarde las diapositivas escaneadas como un archivo TIFF.

Para preparar una diapositiva para el análisis, seleccione "Cargar lista de matrices" y cargue el archivo GAL adecuado que mapea las matrices de cada bloque de la diapositiva. Se desarrollaron portaobjetos con 16 partes diferentes de detección primaria, una en cada bloque. La planta Lectin SNA se une al ácido siálico unido a a2-6.

Mientras que la planta Lectin MALII se une al ácido siálico unido a a2-3. La IgY policlonal Anti-Neu5Gc se une a los sialoglicanos que contienen Neu5Gc, pero no se une a los sialoglicanos que contienen Neu5Ac. Para perfilar la IgG Anti-Neu5Gc, se analizaron 12 sueros de donantes humanos sanos en el microarray de sialoglicano impreso y se desarrollaron utilizando IgG antihumana marcada con fluorescencia en nanogramos por microlitro.

Todos los sueros humanos analizados contenían varios niveles de IgG Anti-Neu5Gc, sin que casi se reconocieran los pares de sialoglicanos que contenían Neu5Ac. Además, los patrones de reconocimiento de IgG Anti-Neu5Gc son muy diversos entre estos 12 sueros diferentes, tanto en el nivel de intensidad como en la diversidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo perfilar los anticuerpos Anti-Neu5Gc en varias muestras humanas de una manera de alto rendimiento, utilizando un sistema de microarrays de glicanos.