Name: Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a generar un modelo de EPOC en ratones mediante exposición repetida al ozono. Este método recapitula los procesos patológicos de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica y permite el cribado de nuevos fármacos en seis a ocho semanas.

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Los autores desean agradecer al Sr. Boyin Qin (Shanghai pública Health Clinical Center) para la asistencia técnica para la evaluación µCT en el presente Protocolo.

Nota: OE el modelo ha sido generado y utilizado en la investigación previamente divulgados 30 , 31 , 32. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Jiaotong de Shanghai.
 1. ratones centro <ol><li>casa libre de patógeno, de 7 a 9 semanas de edad hembra ratones BALB/c en jaulas individuales ventiladas en un animal bajo control temperatura (20 ° C) y humedad (40-60%). Proporcionar un ciclo oscuro 12 h en el centro y 12 h de luz. Proporcionar alimento y agua ad libitum.</li>
</ol> 2. Ozono o exposición al aire <ol><li>generar ozono con un generador eléctrico en una caja de acrílico (e.g. plexiglás) sellado. Soplar el aire fuera de la caja con un ventilador pequeño a través de un tubo de ventilación de aire que se conecta en el interior y fuera de la caja. Monitorear la concentración de ozono en la caja usando una sonda de ozono. Espere hasta que la concentración de ozono en el cuadro de alcance 2,5 partes por millón (ppm). 
	Nota: La sonda de ozono puede cambiar automáticamente el generador de ozono o apagar y puede mantener el nivel de ozono en la caja de 2,5 ppm.</li>
	<li>Colocar los ratones en la caja cuando el nivel del ozono llegue a 2,5 ppm. Mantener los ratones en el cuadro de 3 h cada vez para exponer al ozono. 
	Nota: El cuadro puede mantener un nivel de 2,5 ppm de ozono durante 3 h desconectando automáticamente el generador de ozono o desactivar y soplar el CO 2 que es producido por los ratones fuera de la caja.</li>
	<li>Dar dos exposiciones de ozono (cada exposición duración 3 h) por semana (una vez cada 3 días) por 7 semanas, exponer los ratones de control al aire al mismo tiempo y en el mismo periodo.</li>
</ol> 3. La tomografía computada micro <ol><li>al final de la semana 7, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no responder a un pellizco del dedo del pie. Monitor y mantenga el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.</li>
	<li>Colocar los ratones anestesiados en la cámara de una tomografía micro computada (µCT).</li>
	<li>Calibrar el µCT usando el protocolo estándar y el fabricante &#39; instrucciones. Fijar el tubo de rayos x a 50 kV y la corriente en 450 μA. 
	Nota: Tanto los rayos x y el detector giran alrededor de los ratones.</li>
	<li>Realizar el análisis µCT mediante la adquisición de 515 proyecciones con un tamaño de píxeles efectivos de 0,092 mm, un tiempo de exposición de 300 ms para una rebanada y una rebanada de 0,093 mm.</li>
	<li>Reconstruir el pulmón con las imágenes adquiridas mediante un software. Ajustar brillo de la imagen en escala de grises fijando el mínimo y máximo de la escala de grises en unidades Hounsfield-750 y-550, respectivamente. 
	Nota: El software automáticamente calcula los volúmenes de la parenquimia de pulmón y el área de baja atenuación (LAA) 34 , 35.</li>
	<li>Calcular el porcentaje de LAA (LAA %) dividiendo el volumen LAA por el volumen pulmonar total.</li></ol>
 4. prueba de la cinta de correr <ol><li>dan los ratones una adaptación de prueba a una velocidad de 10 m/min durante 10 min en una corriente cinta de la máquina. Nota: la electricidad siempre está apagado cuando el procedimiento se lleva a cabo.</li> <li>administrar un prueba de fatiga a los ratones.
	<ol><li>Calentar los ratones a una velocidad de 10 m/min por 5 min</li>
		<li>Aumentar la velocidad a 15 m/min durante 10 minutos</li>
		<li>Aumentar la intensidad del ejercicio: aumenta la velocidad de 5 m/min, a partir de 20 m/min, cada 30 min hasta ratones no puede continuar funcionando 36.</li>
	</ol></li> <li>Registrar el total de distancia corriente y tiempo de funcionamiento como distancia de fatiga y cansancio tiempo, respectivamente.</li></ol>
 5. medidas de función pulmonar <ol><li>anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no no responder a un pellizco del dedo del pie y espere hasta que los ratones han mantenido espontáneo respiración. Monitor y mantienen el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.</li>
	<li>Tracheostomize los ratones cuidadosamente y colocarlos en un pletismógrafo de cuerpo conectado a un ventilador controlado por ordenador. 
	Nota: La ventilación es controlada mediante una válvula situada proximalmente al tubo endotraqueal. La configuración proporciona diferentes maniobras semiautomáticas, incluyendo la maniobra de la cuasi-estática presión volumen y la maniobra de flujo rápido del volumen de la.</li>
	<li>Imponer un promedio de frecuencia de 150 respiraciones/min hasta el ratón anestesiado mediante ventilación controlada por presión hasta un patrón de respiración regular la respiración y expiración completa en cada ciclo de respiración se obtiene.</li>
	<li>Realizar la maniobra de presión-volumen cuasi-estático con el dispositivo mediante la presión negativa generada en el pletismógrafo.</li>
	<li>Realizar la maniobra de volumen de flujo dentro de los lazos de la cuasi-estática de presión-volumen a grabar la FVC y el FEV. Inflar el pulmón + 30 cm H 2 O e inmediatamente después conectarlo a una presión altamente negativa para hacer valer la caducidad hasta el volumen residual es el VEF en el primer 25, 50 y 75 ms de la exhalación (FEV 25-30 cm H 2 O. expediente FEV 50 y 75 de la FEV, respectivamente). Rechazar las maniobras subóptimas. Para cada prueba con cada ratón, realizar un mínimo de tres maniobras aceptables para obtener una media fiable para todos los parámetros numéricos.</li>
</ol> 6. Colección de BALF <ol><li>tras anestesia terminal con pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales al ver que el ratón no responde a un pellizco del dedo del pie y perder el aliento), lavado del ratones con 2 mL de PBS a través de un tubo endotraqueal de 1 mm de diámetro y luego recuperar el BALF 10.</li>
	<li>Piscina las alícuotas obtenido el lavado y centrifugar a 4 ° C y 250 x g durante 10 minutos</li>
	<li>Recoger el sobrenadante para su uso inmediato y almacenar el resto a-80 ° C o líquido nitrógeno.</li>
	<li>Cuenta el número total de células usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en PBS y luego giro (1.400 x g, 6 min) 250 μl de células resuspendidas en diapositivas utilizando una centrífuga de spinner diapositiva.</li>
	<li>Tinción de Wright se aplican a las células en el portaobjetos según el fabricante &#39; Protocolo s.</li>
	<li>200 células por ratón; identificar las células como los macrófagos o neutrófilos, según morfología estándar, bajo 400 aumentos; y sus números de la cuenta.</li>
</ol> 7. Muestreo de sangre cardiaca <ol><li>recoger la sangre mediante punción cardiaca, carga en tubos de 1,5 mL y mantenerlo en hielo durante 30 minutos</li>
	<li>Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 2.000 x g y 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante (suero) a un tubo nuevo y conservarlo a-80 ° C o líquido nitrógeno.</li>
	<li>Preparar el suero de IL-1β, IL-10 y pruebas de detección de TNF-α utilizando los respectivos kits ELISA.</li>
</ol> 8. Análisis morfométrico de pulmón <ol><li>diseccionar los pulmones y el traquear de los ratones.
	<ol><li>Posición cada eutanasia ratón sobre un tablero quirúrgico inmediatamente después del sacrificio.</li>
		<li>a diseccionar el platisma y los músculos traqueales anteriores para visualizar y acceder a los anillos traqueales.</li>
		<li>Abierta a la torácica de la cavidad. Diseccionar los pulmones y la tráquea, pero no separar el corazón de los pulmones.</li>
	</ol>
	</li> <li>Conectar el catéter endotraqueal a una jeringa con paraformaldehído al 4% a través de un tubo de polietileno PE90. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Use guantes y gafas de seguridad y utilizar la solución dentro de una campana de humos.</li>
	<li>Inflar el pulmón completamente con paraformaldehído al 4% (10 gotas, ~ 200 μL) a través del catéter endotraqueal. Quitar el corazón después de la terminación de la inflación.</li>
	<li>Mantener el pulmón en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de paraformaldehído al 4% para al menos 4 h.</li>
	<li>Incrustar el pulmón en parafina. Obtener secciones de 5 μm por el bloque de parafina de seccionamiento con un micrótomo rotatorio. Durante el seccionamiento, exponer la máxima superficie de tejido pulmonar dentro del área del árbol bronquial.</li>
	<li>Para el análisis morfométrico, realizar hematoxilina y eosina (H &#38; E) manchas en las secciones de.</li>
	<li>Las secciones de la imagen con un microscopio de campo brillante vertical (objetivo, 20 X, tiempo de exposición, ms 1,667).</li>
	<li>Tienen dos investigadores cegados en el protocolo de tratamiento independientemente contar las secciones histológicas. Utilizar la intercepción lineal media (L m) como un parámetro para medir la distancia de la pared septal alveolar entre. Determinar el L m siguiendo estos pasos: <ol><li>Abra las imágenes de las secciones en Photoshop y dibujar una cuadrícula de la retícula en la imagen con líneas largas de cinco 550 μm.</li>
		<li>Contar el número de alvéolos a través de la línea de la red.</li>
		<li>Calcular el L m dividiendo la longitud de la línea de la cuadrícula el número de alvéolos. Para la cuantificación, imagen de cinco secciones por ratón. Adquirir diez imágenes de cada sección (una imagen por campo) y evaluar al azar. Durante la selección del terreno, evitar los campos de las vías respiratorias y los vasos moviendo un campo adelante o en otra dirección. 
		Nota: Los datos se presentan como la media ± SEM Se realizó una prueba de t no pareada para comparación entre ratones expuestos al aire y los ratones expuestos al ozono. Tres animales de cada grupo se utilizaron para calcular la diferencia significativa. Un valor de p &#60; 0.05 se consideró significativo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. y W.W. son empleados actuales y los titulares de opciones sobre acciones del grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Otros autores declaran que no tienen intereses que compiten.

En este estudio, presentamos un método confiable para la generación de un nuevo modelo de EPOC. En comparación con otros modelos (es decir, LPS o modelos de EPI), este modelo de OE recapitula el proceso patológico de pacientes con EPOC. Porque el humo del cigarrillo es el principal material peligroso que causa EPOC en pacientes humanos con40, el modelo CS sigue siendo el más popular EPOC modelo41,42. Sin embargo, el modelo CS requ...

Se ha estimado que la EPOC, incluyendo bronquitis crónica y enfisema podría ser la tercera causa de muerte en el mundo en el 20201,2. Se estima la potencial incidencia de EPOC en una población de más de 40 años 12.7% en los hombres y 8,3% en las mujeres dentro de los próximos 40 años3. No hay medicamentos están disponibles para revertir el deterioro progresivo en la EPOC pacientes4. Modelos animales confiables de la EPOC no sólo demandan la imitación del proceso patológico de la enfermedad pero también requieren un período de generación corto. Modelos actuales de la EPOC, incluyendo los LPS o un modelo de EPI-inducida, pueden inducir síntomas de enfisema5,6. Una sola administración o un reto de la semana de LPS o PPE resultados ratones o ratas en marcada neutrofilia en el lavado broncoalveolar (BALF), aumentos de mediadores proinflamatorios (p. ej., TNF-α y IL-1β) en suero, o BALF produce pulmón espacios de aire agrandado de destrucción parenquimatosas y límites aire5,6,7,8,9,10. Sin embargo, LPS o EPI no son causas de EPOC humana y así no imitan el proceso patológico11. Un modelo CS-inducida produce una limitación del flujo de aire persistente, destrucción de parénquima pulmonar y redujo la capacidad de ejercicio funcional. Sin embargo, un protocolo tradicional de CS requiere al menos 3 meses para generar un EPOC modelo12,13,14,15. Por lo tanto, es importante generar un nuevo modelo de animal más eficiente que cumpla los dos requisitos.
Recientemente, además del consumo de cigarrillo, contaminación del aire y la exposición ocupacional se han convertido en causas más comunes de EPOC16,17,18. El ozono, como uno de los principales contaminantes (aunque no es el componente principal de la contaminación atmosférica), directamente puede reaccionar con el tracto respiratorio y dañar el tejido pulmonar de los niños y jóvenes adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozono, así como otros estimulantes, incluyendo LPS, PPE y CS, participan en un serio de vías bioquímicas de estrés oxidativo pulmonar y daños en el ADN y están vinculadas a la iniciación y la promoción de EPOC26,27. Otro factor es que los síntomas de algunos pacientes con EPOC se deterioran después de estar expuesto al ozono, lo que indica que el ozono puede interrumpir pulmón función18,28,29. Por lo tanto, nos genera un nuevo modelo de EPOC al exponer repetidamente ratones a altas concentraciones de ozono durante 7 semanas; Esto dio lugar a defectos de flujo de aire y daños parenquimatosos pulmonares similares a los de anteriores investigaciones30,31,32. Extendió el protocolo de OE a ratones hembra en este estudio y reproducir con éxito el enfisema en ratones machos en nuestros anteriores estudios30,31,32. Porque ha disminuido la mortalidad de la EPOC en los hombres aumentó en las mujeres en muchos países33, un modelo de EPOC en las mujeres es necesario para estudiar los mecanismos y desarrollar métodos terapéuticos para pacientes EPOC. La aplicabilidad del modelo OE para todos los géneros presta ayuda adicional a su uso como un modelo de EPOC.

<table><tbody><tr>En este estudio se utilizaron <td>ratones BALB/c</td><td>Slac Laboratory Animal,Shanghai, China</td><td>N/A</td> ratones <td>BALB/c hembra de 7 a 9 semanas de edad.</td></tr><tr><td>Jaulas ventiladas individuales</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Número de modelo: MU64S7</td><td>Las jaulas se utilizaron para alojar ratones en el animalario.</td></tr><tr><td>Sellado de la caja de metacrilato</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>La caja se utilizó" para contener el generador de ozono. Los ratones fueron expuestos al ozono dentro de la caja.</td></tr><tr><td>Generador eléctrico</td><td>Sander Ozonizador, Uetze-Eltze, Alemania</td><td>Modelo 500&nbsp;</td><td>El dispositivo se utilizaba para generar ozono.</td></tr><tr><td>Sonda de ozono</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Gran Manchester, Reino Unido</td><td>Ozono 300</td><td>El dispositivo se utilizó para monitorear y controlar la generación de ozono.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.</td><td>P3761</td><td>Los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Micro-Tomografía Computarizada</td><td>GE Healthcare, Londres, ON, Canadá</td><td>RS0800639-0075</td><td>Este dispositivo se utilizó para adquirir imágenes del pulmón.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA software GE</td><td>Healthcare, Londres, ON, Canadá</td><td>Micro-view 2.01&nbsp;</td><td>Este dispositivo se utilizó para reconstruir el pulmón y analizar el volumen de la OAI del pulmón.</td></tr><tr><td>Máquina de cinta de correr&nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>Esta máquina fue utilizada para la prueba de fatiga.</td></tr><tr><td>Pletismógrafo corporal</td><td>eSpira&trade; Sistema de Maniobras Forzadas, EMMS, Edimburgo, Reino Unido</td><td>Sistema de Maniobras Forzadas</td><td>Este dispositivo se utilizó para evaluar la función pulmonar de la espirometría.</td></tr><tr><td>Ventilador</td><td>eSpira&trade; Sistema de Maniobras Forzadas, EMMS, Edimburgo, Reino Unido</td><td>Sistema de Maniobras Forzadas</td><td>Este dispositivo se utilizó para evaluar la función pulmonar de la espirometría.</td></tr><tr><td>Centrífuga giratoria deslizante</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, EE. UU</td><td>. C1183&nbsp;</td><td>Se utilizaba para hacer girar las células BALF en portaobjetos.</td></tr><tr><td>Tinción de Wright</td><td>Hanhong, Shanghái, China</td><td>RE04000054</td><td>&nbsp; Se utilizó para teñir macrófagos y neutrófilos en el BALF suspendido.</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, EE.UU</td><td>. 4000</td><td>Se utilizaba para contar células.</td></tr><tr><td>IL-1 y beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, EE. UU</td>. <td>AB100704</td><td>Se utilizaron para probar los factores respectivos en suero.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>Se utilizaron para probar los factores respectivos en el suero.</td></tr><tr><td>TNF-y alfa;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, EE. UU</td><td>. ab100747</td><td>Se utilizaron para probar los factores respectivos en suero.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, EE.UU</td>. <td>P6148</td><td>El pulmón fue inflado con un 4% de paraformaldehído.</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Hualing, Shanghái, China</td><td>56#</td><td>Se utilizaba para incrustar el pulmón.</td></tr><tr><td>Microtomo rotatorio</td><td>Leica, Wetzlar,&nbsp; Hesse, Alemania</td><td>RM2255</td><td>Se utilizaba para seccionar el pulmón.</td></tr><tr><td>Hgaematoxilina y eosina (H& E) solución de tinción</td><td>Solarbio, Pekín, China</td><td>G1120</td><td>H& Para el análisis morfométrico se realizó tinción E.</td></tr><tr><td>Microscopio vertical de campo claro</td><td>Olympus, Center Valley, PA, EE. UU</td>. <td>CX41</td><td>Se utilizó para obtener imágenes de la H& E portaobjetos de tinción.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San José, CA, EE. UU</td>. <td>Adobe Photoshop 12</td><td>Se utilizó para contar el número de alvéolos en el H& E Imágenes manchadas.</td></tr><tr><td>Prisma GraphPad 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>Prisma GraphPad 5</td><td>Se utilizó para el análisis de datos y la producción de figuras.</td></tr></tbody></table>

generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por flujo de aire persistente limitación y pulmón parenquimatosa la destrucción. Tiene una incidencia muy elevada en las poblaciones que envejecen. Las actuales terapias convencionales para EPOC foco principalmente en síntomas medicamentos; por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas terapias. Modelos animales calificados de EPOC podrían contribuir a caracterizar los mecanismos subyacentes y pueden ser utilizados para detección de drogas nuevas. Modelos actuales de la EPOC, como el lipopolisacárido (LPS) o la elastasa pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema inducido, generar EPOC-como lesiones en los pulmones y vías respiratorias pero no de lo contrario se asemejan a la patogenia de la EPOC humana. Un humo de cigarrillo (CS)-modelo inducido sigue siendo uno de los más populares ya que no sólo simula EPOC-como lesiones en el sistema respiratorio, pero también se basa en uno de los principales materiales peligrosos que causa EPOC en los seres humanos. Sin embargo, los aspectos desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva del modelo CS-inducida dramáticamente limitan su aplicación en la detección de drogas de nuevo. En este estudio, hemos generado con éxito un nuevo modelo de EPOC mediante la exposición de ratones con altos niveles de ozono. Este modelo demostró lo siguiente: 1) disminuido volumen expiratorio forzado 25, 50 y 75/forzado capacidad vital (FEV25/FVC, FEV50/FVC y VEF75/FVC), indicando el deterioro de la función pulmonar; 2) alvéolos del pulmón ampliada, con destrucción parenquimatosa pulmonar; 3) reduce el tiempo de fatiga y la distancia; y 4) aumenta la inflamación. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el modelo de exposición (OE) de ozono es un modelo confiable que es similar a los seres humanos debido a la sobreexposición de ozono es uno de los factores etiológicos de la EPOC. Además, sólo tomó 6-8 semanas, basados en nuestro trabajo anterior, para crear un modelo de OE, mientras que se requiere de 3 a 12 meses para inducir el modelo de humo de cigarrillo, lo que indica que el modelo de OE puede ser una buena opción para la investigación de la EPOC.

Ejemplos de imágenes 3D µCT de cada grupo se muestran en la figura 1un. Los ratones expuestos al ozono tenían un volumen pulmonar total significativamente mayor (figura 1a y b) y LAA % (figura 1c) de los ratones de control expuestos al aire. La capacidad pulmonar y LAA % seguían elevadas después de seis semanas de la exposición de ozono<sup class="xr...

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

El objetivo general de este experimento es inducir la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o EPOC mediante la exposición al ozono, OE en ratones. Este nuevo modelo de OE puede contribuir a la caracterización del mecanismo subyacente de la EPOC y puede utilizarse para la selección de nuevos fármacos. Las principales ventajas de este modelo de OE son que recapitula los procesos patológicos de los pacientes con EPOC.Se puede generar en solo seis a ocho semanas. Realizando el procedimiento junto conmigo estará Weijaian Sang, investigador asociado en nuestro grupo. Para generar ozono, utilice un generador eléctrico y un soplador de aire pequeño para expulsar el aire del interior de una caja de plexiglás sellada a través de un tubo de ventilación conectado en el interior y exterior de la caja, utilizando una sonda de ozono para monitorear la concentración de ozono dentro de la caja.Cuando la concentración de ozono alcance 2,5 partes por millón, coloque los ratones en la caja durante 3 horas. Al final de la semana 7, obtenga imágenes de los animales tratados con ozono mediante tomografía computarizada microscópica según los protocolos estándar. Para evaluar los cambios inducidos por el ozono y las capacidades funcionales, como la fatiga pulmonar, primero caliente a los ratones a una velocidad de 10 metros por minuto en una cinta rodante.Después de 5 minutos, aumente la velocidad a 15 metros por minuto durante un período de 10 minutos. Continúe aumentando la velocidad en cinco metros por minuto cada 30 minutos hasta que los ratones ya no puedan correr. Registre la distancia total recorrida y el tiempo de carrera para cada animal como distancia de fatiga y tiempo de fatiga, respectivamente.Para medir la función pulmonar de los animales expuestos al ozono, coloque un ratón anestesiado en un pletismógrafo corporal conectado a un ventilador controlado por computadora. Utilice ventilación controlada por presión para imponer una frecuencia respiratoria promedio de 150 respiraciones por minuto al animal anestesiado hasta obtener un patrón respiratorio regular y una espiración completa en cada ciclo respiratorio. Luego registre el volumen espiratorio forzado en los primeros 25, 50 y 75 milisegundos de la espiración, descartando cualquier maniobra subóptima.Tras la anestesia terminal, utilice un tubo endotraqueal de un milímetro de diámetro para lavar a los animales dos veces con un mililitro de PBS por lavado. Combine los alícuotas recuperados de los lavados de cada animal para centrifugación y recoja los sobrenadantes en nitrógeno líquido. Re-suspenda los sedimentos en PPS fresco para el recuento y prepare dos soportes por ratón con una lámina de microscopio, una tarjeta de filtro y un embudo.Agregue aproximadamente de 100 a 125 microlitros de las células re-suspendidas a cada embudo. Coloque los portadores en una citocentrifugadora y centrifugue las células sobre los portaobjetos. Luego, aplique la solución de tinción adecuada a las células según las instrucciones del fabricante y cuente 200 células por ratón bajo una magnificación de 400 veces.Para la extracción de sangre cardíaca, recolecte aproximadamente 500 microlitros de sangre de los animales expuestos al ozono mediante punción cardíaca. Añada la sangre a tubos de 1,5 mililitros sobre hielo. Después de 30 minutos sobre hielo, centrifugue las muestras de sangre y transfiera los sobrenadantes séricos a nuevos tubos para su almacenamiento en nitrógeno líquido.Las muestras pueden descongelarse posteriormente para evaluar los niveles de expresión de citocinas en suero mediante ELISA según protocolos estándar. Para el análisis morfométrico pulmonar, coloque el primer ratón en posición supina tras la toma de muestra cardíaca. A continuación, abra la cavidad torácica y seccione el platisma y los músculos traqueales anteriores para acceder a los anillos traqueales.Recolecte los pulmones y la tráquea sin separar el corazón de los pulmones. A continuación, use un tubo de polietileno PE90 para conectar un catéter endotraqueal a una jeringa que contiene formaldehído al 4% y llene completamente los pulmones con aproximadamente 200 microlitros de paraformaldehído. Luego, coloque los pulmones en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de formaldehído fresco al cuatro por ciento durante al menos cuatro horas.Según se evaluó mediante microtomografía computarizada, los ratones expuestos al ozono presentan un volumen pulmonar total y un porcentaje de área de baja atenuación significativamente mayores que los animales control expuestos al aire ambiente. El fenotipo de enfisema también se evidencia por el agrandamiento de los alvéolos pulmonares y los interceptos lineales medios aumentados. La evaluación de la función pulmonar mediante pletismografía demuestra que todos los parámetros que disminuyen en los ratones expuestos al ozono son consistentes con los defectos funcionales pulmonares típicos observados en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica.Además, la exposición al ozono disminuye significativamente el tiempo de fatiga y la distancia de fatiga en pruebas de tolerancia al ejercicio. Los animales tratados con ozono también muestran un aumento significativo en células inflamatorias, incluyendo macrófagos y neutrófilos, así como una disminución significativa en IL-10 y un aumento en IL-1 beta y TNF alfa, lo que demuestra que el modelo de exposición al ozono reproduce síntomas similares a la enfermedad pulmonar obstructiva crónica humana. La aplicación de este procedimiento en otras cepas de ratones, como los ratones C57 BR6, puede utilizarse para generar este modelo de OE. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades pulmonares exploren los mecanismos subyacentes de la EPOC.No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, gafas de seguridad y manipular la solución dentro de una campana extractora, al trabajar con este reactivo.

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El presente protocolo proporciona una descripción paso a paso detallado de los procedimientos necesarios para ejecutar las mediciones de la mecánica del sistema respiratorio, así como la evaluación de las vías respiratorias de respuesta a la metacolina inhalada en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

El objetivo de este protocolo es proporcionar métodos automatizados para cuantificar las patologías pulmonares crónicas en un modelo murino de EPOC. El protocolo incluye la exposición de ratones al humo del cigarrillo (CS), la medición de la función pulmonar, el inflado de los pulmones y el uso de métodos de morfometría para medir el enfisema y la remodelación de las vías respiratorias pequeñas en ratones.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.

Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones

Aquí se describe un método para evaluar la expresión pulmonar de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios utilizando ratones expuestos al ozono o aire filtrado en las diferentes etapas del ciclo estral.

MicroARN pulmón perfilado a través de la el ciclo estral en ratones expuestos al ozono

Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.

En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Se han establecido varios modelos animales de fibrosis pulmonar utilizando bleomicina para aclarar la patogenia de la fibrosis pulmonar y encontrar nuevas dianas farmacológicas. Sin embargo, la mayoría de los modelos de fibrosis pulmonar dirigidos al tejido pulmonar tienen una administración desigual del fármaco. En este trabajo se propone un modelo de fibrosis pulmonar uniforme inducida por la nebulización nasal de bleomicina.

Un modelo murino de fibrosis pulmonar inducida por nebulización nasal de bleomicina

Este protocolo describe un método para establecer un modelo de ratón de silicosis a través de la exposición repetida a suspensiones de sílice a través de un goteo nasal. Este modelo puede imitar de manera eficiente, conveniente y flexible el proceso patológico de la silicosis humana con alta repetibilidad y economía.

Un modelo de ratón de silicosis establecido por inhalación repetida de polvo de sílice cristalina

Este protocolo describe un método para inducir fibrosis pulmonar en ratones a través de la administración orofaríngea repetida de bleomicina, produciendo características patológicas muy parecidas a las de la fibrosis pulmonar idiopática.

Modelo murino refinado de fibrosis pulmonar idiopática

Aquí presentamos un protocolo para modelar la fibrosis pulmonar en ratones utilizando bleomicina aerosolizada administrada a través de la tráquea. Este método optimizado permite una administración uniforme, cuantitativa y precisa sin incisión quirúrgica, mejorando la reproducibilidad y fiabilidad de la fibrosis inducida por bleomicina.

Un método refinado de administración intratraqueal de bleomicina basado en aerosoles para modelos reproducibles y mínimamente invasivos de fibrosis pulmonar en ratones

Aprende a generar un modelo de EPOC en ratones mediante exposición repetida al ozono. Este método recapitula los procesos patológicos de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica y permite el cribado de nuevos fármacos en seis a ocho semanas.

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

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