Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

El objetivo general de este experimento es inducir la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o C-O-P-D a través de la exposición al ozono, O-E en ratones. Este nuevo modelo de OE puede ocurrir en la caracterización del mecanismo subyacente de la EPOC y puede utilizarse para el cribado de nuevos fármacos. Las principales ventajas de este modelo de OE son que recapitula los procesos patológicos de los pacientes con EPOC.

Se puede generar en solo seis a ocho semanas. Weijaian Sang, un investigador de nuestro grupo, demostrará el procedimiento conmigo. Para generar ozono, use un generador eléctrico y un pequeño soplador de aire para soplar el aire de la caja de metacrilato sellada a través de un tubo de ventilación de aire conectado en el interior y el exterior de la caja usando una sonda de ozono para monitorear la concentración de ozono en la caja.

Cuando la concentración de ozono alcance las 2,5 partes por millón, coloque los ratones en la caja durante 3 horas. Al final de la semana 7, imagen de los animales tratados con ozono mediante microtomografía computarizada de acuerdo con los protocolos estándar. Para probar los cambios inducidos por el ozono y las capacidades funcionales, como la fatiga pulmonar, primero se calentó a los ratones a una velocidad de 10 metros por minuto en una cinta de correr.

Después de 5 minutos, aumente la velocidad a 15 metros por minuto durante un período de 10 minutos. Continúe aumentando la velocidad en cinco metros por minuto por cada 30 minutos hasta que los ratones ya no puedan correr. Registrar la distancia total de carrera y el tiempo de carrera de cada animal como distancia de fatiga y tiempo de fatiga, respectivamente.

Para medir la función pulmonar de los animales expuestos al ozono, coloque un ratón anestesiado en un pletismógrafo corporal conectado a un ventilador controlado por computadora. Utilice la ventilación controlada por presión para imponer una frecuencia respiratoria promedio de 150 respiraciones por minuto al animal anestesiado hasta que se obtenga un patrón de respiración regular y una espiración completa en cada ciclo de respiración. A continuación, registre el volumen espiratorio forzado en los primeros 25, 50 y 75 milisegundos de exhalación, rechazando cualquier maniobra subóptima.

Después de la anestesia terminal, use un tubo endotraqueal de un milímetro de diámetro para lavar a los animales dos veces con un mililitro de PBS por lavado. Agrupar los álsperos de lavado recuperados de cada animal para centrifugarlos y recoger los sobrenadantes en nitrógeno líquido. Vuelva a suspender los gránulos en PPS nuevo para contar y equipe dos soportes por ratón con un portaobjetos de microscopio, una tarjeta de filtro y un embudo.

Agregue aproximadamente de 100 a 125 microlitros de las células resuspendidas a cada embudo. Cargue los soportes en una centrífuga citométrica y gire las celdas en los portaobjetos. A continuación, aplique la solución de tinción adecuada a las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuente 200 células por ratón con un aumento de 400 veces.

Para la toma de muestras de sangre cardíacas, recoja aproximadamente 500 microlitros de sangre de los animales expuestos al ozono a través de una punción cardíaca. Y agregue la sangre a tubos de 1,5 mililitros con hielo. Después de 30 minutos en hielo, centrifugar las muestras de sangre y transferir los sobrenadantes del suero a nuevos tubos para almacenarlos en nitrógeno líquido.

Las muestras pueden ser posteriormente descongeladas para la evaluación de los niveles de expresión de citocinas séricas mediante ELISA de acuerdo con los protocolos estándar. Para el análisis morfométrico pulmonar, coloque el primer ratón en posición supina después de la toma de muestras cardíacas. A continuación, abra la cavidad torácica y diseccione el platisma y los músculos traqueales anteriores para acceder a los anillos traqueales.

Extraiga los pulmones y la tráquea sin separar el corazón de los pulmones. A continuación, utilice un tubo de polietileno PE90 para conectar un catéter endotraqueal a una jeringa que contenga un 4% de formaldehído e inflar completamente los pulmones con aproximadamente 200 microlitros de paraformaldehído. A continuación, coloque los pulmones en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de formaldehído fresco con una potencia del cuatro por ciento durante al menos cuatro horas.

Según lo evaluado por tomografía microcomputarizada, los ratones expuestos al ozono exhiben un volumen pulmonar total significativamente mayor y un porcentaje de área de atenuación baja que los animales de control expuestos al aire ambiente. El fenotipo del enfisema también se evidencia por el agrandamiento de los alvéolos pulmonares y el aumento de las intercepciones lineales medias. La evaluación de la función pulmonar mediante pletismógrafo demuestra que todos los parámetros que disminuyen en los ratones expuestos al ozono son consistentes con los defectos funcionales pulmonares típicos observados en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

Además, la exposición al ozono disminuye significativamente el tiempo de fatiga y la distancia de fatiga en las pruebas de tolerancia al ejercicio. Los animales tratados con ozono también muestran un aumento significativo de las células inflamatorias, incluidos macrófagos y neutrófilos, así como una disminución significativa de la IL-10 y un aumento de la IL-1 beta y el TNF alfa, lo que demuestra que el modelo de exposición al ozono recapitula los síntomas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica humana. Siguiendo este procedimiento en otras cepas de ratones como el C57, se pueden utilizar ratones BR6 para generar este modelo OE Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad pulmonar exploren los mecanismos subyacentes de la EPOC.

No olvide que trabajar con el paraformaldehído puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, gafas de seguridad y el uso de la solución dentro de la campana extractora mientras se trabaja con este reactivo.