Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención

El objetivo general de este método es proporcionar un procedimiento sencillo y eficaz de tinción negativa en MET para muestras virales dentro de un entorno de contención biológica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en virología sobre la morfología y las estructuras de los virus que se están investigando. La principal ventaja de esta técnica es que permite un manejo fácil y eficaz de las rejillas de microscopía electrónica dentro de entornos de contención biológica. Esta técnica es útil como parte del diagnóstico por MET de un virus desconocido porque puede aplicarse fácilmente a muestras virales en cualquier entorno. Aunque hemos utilizado principalmente este método para ayudar en estudios de virus mediante MET, tiene aplicaciones mucho más amplias y puede emplearse en la investigación por ME de la mayoría de los nanopartículas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere cierta práctica para asegurar que las rejillas de MET no resulten dañadas al cargarse y descargarse de las cápsulas.

Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando teníamos problemas para manipular pequeñas rejillas de microscopía electrónica en condiciones de contención biológica.

Para comenzar este procedimiento, prepare o compre rejillas de cobre TEM recubiertas con Formvar y carbono. Inserte las rejillas recubiertas en cápsulas. A continuación, transfiera las cápsulas cargadas junto con otros materiales y reactivos al biocontención. Para iniciar, fije la cápsula a una pipeta. Aspire 40 microlitros de suspensión viral dentro de la cápsula. Coloque la pipeta de lado, con las rejillas orientadas horizontalmente durante 10 minutos. Luego, tome la pipeta y deseche la solución viral en un recipiente de desecho. Aspire 40 microlitros de fijador al 2 % de glutaraldehído dentro de las cápsulas. Coloque la pipeta de lado durante 20 minutos. Después de esto, expulse el fijador y aspire 40 microlitros de agua desionizada dentro de la cápsula, para eliminar el fijador. Repita este lavado tres veces.

A continuación, aspire 40 microlitros de acetato de uranilo al 1% o ácido fosfotungstico de potasio al 1% dentro de la cápsula. Deje reposar la cápsula durante 30 segundos. Luego, retire la cápsula de la pipeta.

Toque un trozo de papel de filtro en el borde de las cuadrículas para secarlo. Transfiera el papel de filtro a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, sumerja el papel de filtro en una solución al 1% de tetraóxido de osmio.

Coloque la cápsula con la tapa abierta dentro del tubo. Selle el tubo durante una hora para permitir la permeación completa del vapor de tetraóxido de osmio. Después de esto, descontamine el tubo y transfiéralo fuera del contenedor biológico hacia la instalación de microscopía electrónica de nivel BSL-2.

Retire la cápsula del tubo de centrífuga y colóquela en una pipeta. Aspire 40 microlitros de agua desionizada hacia la cápsula y luego expulse el agua en un recipiente de desecho. Repita este lavado con agua tres veces.

A continuación, retire la cápsula de la pipeta. Con papel de filtro, seque las rejillas por absorción. Deje secar las rejillas al aire y luego guárdelas en una caja para rejillas hasta que estén listas para realizar la imagenología por MET.

Para comenzar, mezcle la suspensión viral con un volumen igual de glutaraldehído al 4%, para obtener una concentración final de glutaraldehído al 2%. Inactive el virus con el fijador durante al menos 24 horas. Descontamine el tubo y transfiéralo a la instalación de microscopía electrónica de nivel de seguridad biológica 2 (BLS-2). A continuación, sujete una rejilla cargada con captura a una pipeta. Aspire la mezcla hacia la cápsula. Coloque la pipeta de lado con las rejillas orientadas horizontalmente durante 10 minutos.

A continuación, tome la pipeta y expulse la mezcla de virus en un recipiente de desecho. Aspire 40 microlitros de agua desionizada hacia la cápsula y luego deseche el agua en un recipiente de desecho. Repita este lavado tres veces.

Después de esto, aspire 40 microlitros de UA al 1% o PTA al 1% dentro de la cápsula durante 30 segundos. Retire la cápsula de la pipeta. Utilizando papel de filtro, seque las rejillas por absorción.

Luego, deje que las rejillas se sequen al aire.

En este estudio, muestras del virus de Ébola de Zaire son sometidas a tinción negativa, utilizando tanto el método manual de gota como el método de cápsula. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (MET) generadas mediante estos métodos muestran claramente detalles definidos, con estructuras de nucleocápside en el centro del virión y glicoproteínas visibles en la superficie. Por lo tanto, el método de cápsula es capaz de producir imágenes de MET de calidad similar a las obtenidas mediante el método manual de gota. A continuación, se comparan diferentes métodos de inactivación de la muestra utilizando el virus de Chikungunya. La inactivación de la muestra se logra bien rápidamente, mediante el uso de glutaraldehído al 2% durante 20 minutos seguido de exposición a ósmio tetroxido al 1% durante una hora, o bien durante la noche, utilizando glutaraldehído al 2% durante 24 horas. Como puede observarse, el proceso de inactivación más prolongado sin ósmio tetroxido permite visualizar mayor detalle ultraestructural.

A continuación, utilizando el método de la cápsula, se compararon dos tinciones empleando partículas similares a virus fijadas con aldehído. Tanto el acetato de uranilo como el ácido fosfotungstico muestran resultados de alta calidad, con bordes bien definidos y glicoproteínas visibles.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora y media, dependiendo del número de muestras. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar el fijador y los reactivos de tinción adecuados para sus objetivos experimentales. Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el conteo de partículas, para responder preguntas adicionales mediante el cálculo de las concentraciones de virus.

Esta técnica mejora la forma en que los virólogos pueden explorar la morfología de los virus y obtener información estructural con mayor facilidad, especialmente en virus de nivel BSL-3 y 4. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular fácilmente las rejillas para microscopía electrónica para la tinción negativa dentro de un entorno de biocontención. No olvide que trabajar con aldehído, tetraóxido de osmio y acetato de uranilo puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso adecuado de equipo de protección personal y una campana extractora de gases químicos al realizar este procedimiento.