Name: Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a realizar tinción negativa de muestras víricas en biocontención utilizando cápsulas innovadoras para manejar rejillas de microscopía electrónica. Este método mejora el estudio de la morfología viral en laboratorios BSL-2, -3 y -4.

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Quisiéramos agradecer al Dr. John Carra y Rowena Schokman por proporcionar Nano-VLP puros de Ebola, al Dr. Rajini Mudhasani por proveer el virus Chikungunya, y al Dr. Charles (Jason) Shoemaker por proveer Leucemia Murina VLPs que expresan glicoproteínas de Ebolavirus. También queremos agradecer a MAJ Carl Soffler por facilitar el Programa de Prácticas de Verano (SIP) y el Programa de Aprendizaje de Ciencia e Ingeniería (SEAP) y la Dra. Catherine Wilhelmsen para el entrenamiento de seguridad en el laboratorio.

1. Preparación del experimento en un entorno BSL-2 antes de trabajar con las muestras de virus <ol><li> Preparar o comprar Formvar y rejillas de cobre con recubrimiento de carbón TEM, generalmente 200-400 mallas. </li><li> Inserte las rejillas TEM revestidas en cápsulas. <ol><li> Utilice una lente ampliada para hacer este proceso fácil de realizar. Se pueden insertar una o dos rejillas en cada cápsula. Las cápsulas precargadas se pueden comprar para eliminar este paso si se desea. </li></ol></li><li> Transferir las cápsulas con rejillas recubiertas con TEM insertadas, junto con otros suministros y reactivos, a biocontención donde el virus se tiñera negativamente. </li></ol> 2. El método de la cápsula para la tinción negativa en biocontención usando glutaraldehído acuoso y 1% de inactivación de vapor de tetróxido de osmio <ol><li> Dentro del biocontenimiento BSC, aspirar 40 μL de suspensión de virus en la cápsula unida a una pipeta. NOTA: La pipeta permanece unida a laE cápsula hasta que se complete el proceso. La preparación de virus es de acuerdo con nuestra publicación anterior 14 . </li><li> Coloque la pipeta en su lado durante 10 minutos con las rejillas orientadas horizontalmente. Esto es para promover una distribución uniforme de partículas de virus sobre las rejillas revestidas. </li><li> Inactivar el virus dentro de la cápsula dentro del BSC de biocontención. <ol><li> Recoger la pipeta y presionar el émbolo para dispensar la solución del virus en un contenedor de residuos. </li><li> Aspirar 40 μL de fijador de glutaraldehído al 2% en las cápsulas. Precaución: El glutaraldehído es un producto químico peligroso y requiere protección adecuada. El glutaraldehído se puede utilizar durante breves períodos en un BSC normal, pero el reactivo abierto extendido requiere trabajar en un conducto de BSC o chimenea de humo. </li><li> Coloque la pipeta en su lado durante 20 min. Esto es para asegurar que las muestras estén bien fijadas. </li><li> Expulsar el fijador y aspirar 40 μL de agua dI en las cápsulas a wRetirar el fijador. Repita este paso de lavado durante un total de 3 ciclos de enjuague. </li></ol></li><li> Aspirar 40 μL de acetato de uranilo (UA) al 1% o ácido fosfotúngstico potásico al 1% (PTA) en las cápsulas y dejar reposar durante 30 s. NOTA: El tiempo de tinción puede variar de 10 s a 1 min basado en la muestra de virus. Precaución: UA es un emisor alfa, y una toxina acumulativa. Manéjalo con la protección adecuada. </li><li> Retire la cápsula de la pipeta y seque las rejillas tocando un pedazo de papel de filtro al borde de las rejillas mientras las rejillas permanecen dentro de la cápsula. </li><li> Tetróxido de Osmio Procedimiento de inactivación del vapor. <ol><li> Coloque la cápsula, con la tapa abierta, en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga papel de filtro empapado en una solución de tetróxido de osmio al 1%. Precaución: El tetróxido de osmio es extremadamente tóxico con baja presión de vapor. Debe utilizarse en una campana extractora de humos BSC o chimenea. Manéjalo con la protección adecuada. Advertencia de envíoInformación en el área de trabajo. </li><li> Sellar el tubo de centrífuga de 50 ml durante 1 h para permitir la permeación completa del vapor de tetróxido de osmio. A continuación, descontaminar y transferir el tubo del biocontenimiento a la instalación de BSL-2 EM. </li></ol></li><li> Retire las rejillas EM de la cápsula. <ol><li> En la instalación BSL-2 EM, retire la cápsula del tubo de centrífuga y colóquela en una pipeta. </li><li> Aspirar 40 μL de agua de dI en la cápsula y dispensar el agua en un contenedor de residuos tres veces. </li><li> Retire la cápsula de la pipeta y secar las rejillas con papel de filtro para tocar el borde de las rejillas. </li><li> Después del secado al aire, almacene las rejillas para la posterior formación de imágenes TEM. </li></ol></li></ol> 3. El método de la cápsula para la inactivación en el biocontenimiento con 2% de glutaraldehído, seguido de tinción negativa en un laboratorio BSL-2 <ol><li> Procedimiento de inactivación del virus. <ol><lI&gt; En el interior del BSC de biocontención, mezclar bien la suspensión de virus con el mismo volumen de glutaraldehído al 4% para lograr una concentración final de 2% de glutaraldehído. Precaución: El glutaraldehído es un producto químico peligroso y requiere protección adecuada. El glutaraldehído se puede utilizar durante breves períodos en un BSC normal, pero el reactivo abierto extendido requiere trabajar en un conducto de BSC o chimenea de humo. </li><li> Inactivar los virus con fijador durante un mínimo de 24 h antes de envasar, descontaminar y transferirlo a la instalación de BSL-2 EM. </li></ol></li><li> En la instalación BSL-2 EM, aspirar el virus y la mezcla fijadora en la cápsula, que contiene dos rejillas TEM, unidas a una pipeta. </li><li> Coloque la pipeta horizontalmente durante 10 minutos con las rejillas orientadas horizontalmente. NOTA: Esto es para promover una distribución uniforme de partículas de virus en las rejillas TEM. </li><li> Recoja la pipeta y presione el émbolo para expulsar el virus a un contenedor de desechos. Aspirar 40 μL de dIAgua en las cápsulas y expulsarla en el contenedor de residuos durante 3 ciclos de enjuague. </li><li> Aspirar 40 μ l de 1% UA o 1% PTA en las cápsulas durante 30 s. NOTA: El tiempo de tinción varió de 10 s a 1 min basado en la muestra de virus. Precaución: UA es un emisor alfa, y una toxina acumulativa. Manéjalo con la protección adecuada. </li><li> Retire la cápsula de la pipeta y secar las rejillas tocando el borde de las rejillas a un pedazo de papel de filtro. Secar al aire las rejillas y almacenarlas para la posterior formación de imágenes TEM. </li></ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
<li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li>
<li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li>
<li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li>
<li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microsc+Rev%22%5BJournal%5D)">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li>
<li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li>
<li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/S1431927615004407">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721(2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/capsulebased-processing-and-handling-of-electron-microscopy-specimens-and-grids/43059411AA8B965E6EA870B9ED9DFAC5">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-and-microanalysis/article/reducing-reagent-consumption-and-improving-efficiency-of-specimen-fixation-and-embedding-grid-staining-and-archiving-using-mprep-capsule-processing/BD909A4213DA1D65217A9CDDE93AB2C0">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).</li>
<li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis%3A+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li>
<li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ViroCyt%28R%29+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li>
<li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermostable%2C+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228(2015).</li>
<li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+viruses%3A+objects+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419(2011).</li>
<li>Barland,, Rojkind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li>
</ol>

Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones que figuran en el artículo son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos o el Departamento de Defensa.

La tinción negativa es una valiosa técnica TEM para evaluar y calibrar virus, complejos proteicos y nanopartículas. La preparación de gotitas de estos especímenes mediante el movimiento manual de las rejillas desde el reactivo a las manchas negativas ha sido el protocolo clásico durante más de medio siglo. Es un proceso simple, pero requiere conocimientos adquiridos a través de la capacitación para su finalización con éxito. La excelente tinción negativa todavía se considera un conjunto de habilidades de última generaci...

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una herramienta eficaz para visualizar la morfología y la ultraestructura de especímenes biológicos que son demasiado pequeños para ser vistos con un microscopio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs disparar electrones a través de una muestra muy delgada que produce una imagen de mayor resolución como electrones tienen una longitud de onda mucho más corto que la luz. Las regiones de la muestra que doblan o bloquean electrones aparecen oscuras, mientras que las regiones que son electrón lucent aparecen en blanco. La falta de materia densa de electrones hace que los virus sean difíciles de ver bajo un TEM porque no pueden dispersar electrones. La tinción negativa es el método más común utilizado para crear contraste y ver los virus con un TEM. El primer procedimiento de tinción negativa fue propuesto por Brenner y Horne en 1959, basado en un experimento donde Hall (1955) y Huxley (1957) observaronLa aparición de estructuras biológicas en contraste inverso cuando se sumerge en una sustancia densa en electrones 5 . El proceso de tinción negativa ha permanecido prácticamente sin cambios durante el último medio siglo. La tinción negativa consiste en aplicar brevemente una solución de sal de metales pesados ​​a una muestra en una rejilla TEM en un intento de rodear al virus con material denso sin infiltrarse en el virus 6 . Esto crea un borde oscuro y revela la forma de la partícula 5 . Este estudio utiliza dos reactivos para tinción negativa, acetato de uranilo (UA) y ácido fosfotúngstico de potasio (PTA). Ambas manchas se utilizan comúnmente para manchar negativamente pequeñas muestras biológicas, tales como virus, complejos de proteínas, y nanopartículas [ 7 , 8 , 9] . La técnica de tinción negativa convencional es la tecnología de tinción negativa manual de gotitasNique 7 . Este método requiere el manejo preciso de pequeñas y frágiles rejillas TEM con pinzas para aplicar pequeñas cantidades de muestras de virus, manchas y enjuagues. El protocolo de preparación típico implica la aplicación de una gotita de suspensión de muestra sobre la superficie de una rejilla TEM revestida con película ( Figura 1A ). Después de la unión de la muestra a la superficie de la película, la rejilla se enjuaga para eliminar los virus no adherentes y se tiñe con UA ​​o PTA durante unos segundos a un minuto, dependiendo del tipo de muestra. El exceso de líquido es malo lejos de la rejilla tocando un pedazo de papel de filtro al borde de la rejilla. El método de gota manual requiere que cada rejilla se haga individualmente. Si no se manejan con cuidado, las rejillas TEM revestidas se perforan fácilmente, se doblan o se contaminan. El procesamiento de muestras múltiples puede conducir a dificultades en el seguimiento de las rejillas y asegurar una tinción consistente para cada muestra. Este procedimiento de tinción manual es mucho másSi se realizan en laboratorios de nivel de bioseguridad (BSL) -3 y -4 biocontenedores, debido al equipo de protección personal (EPP) requerido para estos ambientes. El PPE es engorroso y el ambiente de biocontención es mucho más turbulento en comparación con un laboratorio regular. El personal que trabaja en los laboratorios de biocontención BSL-3 debe llevar 2 pares de guantes y trabajar en un gabinete de bioseguridad (BSC). Esta doble capa de guantes reduce la sensibilidad táctil y restringe el movimiento del motor fino. El flujo de aire de la BSC que protege al usuario y ayuda a prevenir la contaminación de la muestra puede hacer que las muestras y las manchas se sequen demasiado rápido afectando así a la calidad de las manchas. El fuerte flujo de aire turbulento en el BSC también puede eliminar rápidamente una rejilla que no está bien asegurada. En los laboratorios de biocontención BSL-4, existen requisitos de seguridad adicionales. Se requiere que el personal use un traje de presión positiva, lo que restringe aún más el movimiento físico y la capacidad de ver y manipular claramenteLas rejillas. El técnico que trabaja en BSL-4 también lleva por lo menos 2 pares de guantes, siendo el par externo un guante grueso que reduce en gran medida la destreza y la sensación táctil. Finalmente, los fórceps utilizados para manejar las rejillas TEM son agudos, lo que supone un riesgo para el técnico debido a su capacidad para perforar los guantes. Con las cápsulas que contienen rejillas, no es necesario pinzas, lo que proporciona una alternativa segura, sin fórceps para manipular las rejillas en biocontención. Finalmente, las cápsulas también proporcionan una manera eficaz de almacenar rejillas durante el procesamiento, la descontaminación del vapor de osmio y durante el almacenamiento; Manteniendo así las rejillas organizadas y protegidas contra daños. En este informe, se introduce un nuevo método para la tinción negativa TEM grids en los laboratorios de biocontención que utiliza mPrep / g cápsulas, un dispositivo a base de cápsulas para el manejo de la red y la tinción 10 , 11 , 12 . La cápsula acompañaModula dos rejillas TEM, minimiza el manejo directo y reduce el potencial de daño en la red. La cápsula se fija directamente a una pipeta de una o varias canales de la misma manera que una punta de pipeta, permitiendo la aplicación de varios líquidos a las rejillas contenidas dentro. Esto permite la preparación simultánea de muestras múltiples con cuadrículas duplicadas ( Figura 1B ). Para la tinción negativa con cápsulas, la muestra de virus se aspira en la cápsula y se mantiene durante 10 minutos para dejar que los virus se adsorben sobre las superficies de la rejilla. Las redes con virus adsorbido se lavan posteriormente con agua desionizada (dI) y se tiñen con UA ​​o PTA durante unos segundos a 1 min. Este proceso utiliza los mismos pasos y reactivos del protocolo que el método manual de gotas; La diferencia es que todo el trabajo se produce dentro de la cápsula sin manipulación física de las rejillas. ( Figuras 1C , 1D ). El propósito de este estudio fue evaluar las cápsulas comoUn nuevo método para la tinción negativa de muestras de virus en ambientes de biocontención. Este estudio también examinó la calidad de las imágenes TEM producidas a partir de dos procedimientos diferentes de inactivación viral: 1) inactivación rápida, con 1% de vapor de tetróxido de osmio, y 2) inactivación de 24 horas con 2% de glutaraldehído. Ambos se llevaron a cabo utilizando las cápsulas. Finalmente, evaluamos dos manchas negativas comúnmente usadas, UA y PTA, para uso en la cápsula. 13

<table><tbody><tr><td>Rejillas TEM recubiertas de carbono</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>Malla 200 Cu Pk/100</td></tr><tr><td>mPrep/g cápsulas</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>caja</td></tr><tr><td>mPrep/f acopladores</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>estándar 16/Pk</td></tr><tr><td>glutaraldehdyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>Solución al 50%, grado EM</td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>solución</td></tr> <tr>acuosa al 4%<td>Acetato de uranilo</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>polvo</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico de potasio</td><td>EMS</td><td>19500</td><td>polvo</td></tr><tr><td>papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>tamaño 50</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se utiliza para observar la ultraestructura de virus y otros patógenos microbianos con resolución nanométrica. La mayoría de los materiales biológicos no contienen elementos densos capaces de dispersar electrones para crear una imagen; Por lo tanto, se requiere una tinción negativa, que coloca sales densas de metales pesados ​​alrededor de la muestra. Con el fin de visualizar los virus en suspensión bajo el TEM que deben aplicarse a las pequeñas rejillas cubiertas con una superficie transparente sólo nanómetros de espesor. Debido a su pequeño tamaño y fragilidad, estas rejillas son difíciles de manejar y se mueven fácilmente por las corrientes de aire. La superficie delgada se daña fácilmente, dejando la muestra difícil o imposible de imagen. Los virus infecciosos deben ser manejados en un gabinete de bioseguridad (BSC) y algunos requieren un ambiente de laboratorio de biocontención. Tinción de virus en los niveles de bioseguridad (BSL) -3 y -4 es especialmente difícil debido a que estos entornos son más turbulentos y los técnicos se requieren tO use equipo de protección personal (PPE), lo que disminuye la destreza. En este estudio, se evaluó un nuevo dispositivo para ayudar a la tinción negativa de virus en biocontención. El dispositivo es una cápsula que funciona como una punta de pipeta especializada. Una vez que las rejillas se cargan en la cápsula, el usuario simplemente aspira los reactivos en la cápsula para entregar el virus y las manchas a la rejilla encapsulada, eliminando así el manejo del usuario de las rejillas. Aunque esta técnica fue diseñada específicamente para su uso en el biocontenimiento BSL-3 o -4, puede facilitar la preparación de la muestra en cualquier ambiente de laboratorio permitiendo una fácil tinción negativa del virus. Este mismo método también se puede aplicar para preparar especímenes TEM negativos teñidos de nanopartículas, macromoléculas y especímenes similares.

El método de la cápsula produce una tinción negativa de buena calidad para la obtención de imágenes TEM: En primer lugar, se evaluó la calidad de las imágenes generadas mediante el uso del método de gotita manual y los métodos de cápsula para la tinción negativa Zaire ebolavirus. Los ebolavirus son miembros de la familia Filoviridae , junto con el virus Marburg. El ébolavirus es típicamente de 80 a 100 nm de diámetro y p...

Este protocolo proporciona instrucciones para muestras de virus de tinción negativas que pueden usarse fácilmente en laboratorios BSL-2, -3 o -4. Incluye el uso de una cápsula de procesamiento innovadora que protege la rejilla de microscopía electrónica de transmisión y proporciona al usuario un manejo más fácil en los ambientes más turbulentos dentro de la biocontención.

Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

El objetivo general de este método es proporcionar un procedimiento sencillo y eficaz de tinción negativa en MET para muestras virales dentro de un entorno de contención biológica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en virología sobre la morfología y las estructuras de los virus que se están investigando. La principal ventaja de esta técnica es que permite un manejo fácil y eficaz de las rejillas de microscopía electrónica dentro de entornos de contención biológica. Esta técnica es útil como parte del diagnóstico por MET de un virus desconocido porque puede aplicarse fácilmente a muestras virales en cualquier entorno. Aunque hemos utilizado principalmente este método para ayudar en estudios de virus mediante MET, tiene aplicaciones mucho más amplias y puede emplearse en la investigación por ME de la mayoría de los nanopartículas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere cierta práctica para asegurar que las rejillas de MET no resulten dañadas al cargarse y descargarse de las cápsulas.Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando teníamos problemas para manipular pequeñas rejillas de microscopía electrónica en condiciones de contención biológica. Para comenzar este procedimiento, prepare o compre rejillas de cobre TEM recubiertas con Formvar y carbono. Inserte las rejillas recubiertas en cápsulas. A continuación, transfiera las cápsulas cargadas junto con otros materiales y reactivos al biocontención. Para iniciar, fije la cápsula a una pipeta. Aspire 40 microlitros de suspensión viral dentro de la cápsula. Coloque la pipeta de lado, con las rejillas orientadas horizontalmente durante 10 minutos. Luego, tome la pipeta y deseche la solución viral en un recipiente de desecho. Aspire 40 microlitros de fijador al 2 % de glutaraldehído dentro de las cápsulas. Coloque la pipeta de lado durante 20 minutos. Después de esto, expulse el fijador y aspire 40 microlitros de agua desionizada dentro de la cápsula, para eliminar el fijador. Repita este lavado tres veces.A continuación, aspire 40 microlitros de acetato de uranilo al 1% o ácido fosfotungstico de potasio al 1% dentro de la cápsula. Deje reposar la cápsula durante 30 segundos. Luego, retire la cápsula de la pipeta.Toque un trozo de papel de filtro en el borde de las cuadrículas para secarlo. Transfiera el papel de filtro a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, sumerja el papel de filtro en una solución al 1% de tetraóxido de osmio.Coloque la cápsula con la tapa abierta dentro del tubo. Selle el tubo durante una hora para permitir la permeación completa del vapor de tetraóxido de osmio. Después de esto, descontamine el tubo y transfiéralo fuera del contenedor biológico hacia la instalación de microscopía electrónica de nivel BSL-2.Retire la cápsula del tubo de centrífuga y colóquela en una pipeta. Aspire 40 microlitros de agua desionizada hacia la cápsula y luego expulse el agua en un recipiente de desecho. Repita este lavado con agua tres veces.A continuación, retire la cápsula de la pipeta. Con papel de filtro, seque las rejillas por absorción. Deje secar las rejillas al aire y luego guárdelas en una caja para rejillas hasta que estén listas para realizar la imagenología por MET.Para comenzar, mezcle la suspensión viral con un volumen igual de glutaraldehído al 4%, para obtener una concentración final de glutaraldehído al 2%. Inactive el virus con el fijador durante al menos 24 horas. Descontamine el tubo y transfiéralo a la instalación de microscopía electrónica de nivel de seguridad biológica 2 (BLS-2). A continuación, sujete una rejilla cargada con captura a una pipeta. Aspire la mezcla hacia la cápsula. Coloque la pipeta de lado con las rejillas orientadas horizontalmente durante 10 minutos.A continuación, tome la pipeta y expulse la mezcla de virus en un recipiente de desecho. Aspire 40 microlitros de agua desionizada hacia la cápsula y luego deseche el agua en un recipiente de desecho. Repita este lavado tres veces.Después de esto, aspire 40 microlitros de UA al 1% o PTA al 1% dentro de la cápsula durante 30 segundos. Retire la cápsula de la pipeta. Utilizando papel de filtro, seque las rejillas por absorción.Luego, deje que las rejillas se sequen al aire. En este estudio, muestras del virus de Ébola de Zaire son sometidas a tinción negativa, utilizando tanto el método manual de gota como el método de cápsula. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (MET) generadas mediante estos métodos muestran claramente detalles definidos, con estructuras de nucleocápside en el centro del virión y glicoproteínas visibles en la superficie. Por lo tanto, el método de cápsula es capaz de producir imágenes de MET de calidad similar a las obtenidas mediante el método manual de gota. A continuación, se comparan diferentes métodos de inactivación de la muestra utilizando el virus de Chikungunya. La inactivación de la muestra se logra bien rápidamente, mediante el uso de glutaraldehído al 2% durante 20 minutos seguido de exposición a ósmio tetroxido al 1% durante una hora, o bien durante la noche, utilizando glutaraldehído al 2% durante 24 horas. Como puede observarse, el proceso de inactivación más prolongado sin ósmio tetroxido permite visualizar mayor detalle ultraestructural. A continuación, utilizando el método de la cápsula, se compararon dos tinciones empleando partículas similares a virus fijadas con aldehído. Tanto el acetato de uranilo como el ácido fosfotungstico muestran resultados de alta calidad, con bordes bien definidos y glicoproteínas visibles.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora y media, dependiendo del número de muestras. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar el fijador y los reactivos de tinción adecuados para sus objetivos experimentales. Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el conteo de partículas, para responder preguntas adicionales mediante el cálculo de las concentraciones de virus.Esta técnica mejora la forma en que los virólogos pueden explorar la morfología de los virus y obtener información estructural con mayor facilidad, especialmente en virus de nivel BSL-3 y 4. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular fácilmente las rejillas para microscopía electrónica para la tinción negativa dentro de un entorno de biocontención. No olvide que trabajar con aldehído, tetraóxido de osmio y acetato de uranilo puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso adecuado de equipo de protección personal y una campana extractora de gases químicos al realizar este procedimiento.

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Métodos de detección de rutina utilizando amplificación del genoma viral están limitados por su incapacidad para discriminar infecciosas de partículas no infecciosas. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para métodos alternativos facilitar la discriminación de las partículas infecciosas norovirus con aptámeros vinculante, dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión.

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