Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención
July 19th, 2017
Este protocolo proporciona instrucciones para muestras de virus de tinción negativas que pueden usarse fácilmente en laboratorios BSL-2, -3 o -4. Incluye el uso de una cápsula de procesamiento innovadora que protege la rejilla de microscopía electrónica de transmisión y proporciona al usuario un manejo más fácil en los ambientes más turbulentos dentro de la biocontención.
El objetivo general de este método es proporcionar un procedimiento de tinción TEM negativo simple y efectivo para muestras virales dentro de la biocontención. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en virología sobre la morfología y las estructuras de los virus que se están investigando. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un manejo fácil y eficaz de las rejillas de microscopía electrónica dentro de entornos de biocontención.
Esta técnica se utiliza como parte del diagnóstico TEM de un virus desconocido porque se puede aplicar fácilmente a muestras virales en todos los entornos. Aunque hemos utilizado este método principalmente para ayudar en los estudios de TEM de virus, tiene una aplicación mucho más amplia y se puede utilizar en la investigación EM de la mayoría de las nanopartículas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita algo de práctica para asegurarse de que las rejillas TEM no se dañen cuando se cargan y descargan de las cápsulas.
La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando tuvimos problemas para manejar pequeñas rejillas EM en la biocontención. Para comenzar este procedimiento, prepare o compre rejillas de cobre TEM virales y recubiertas de carbono. Inserte las rejillas TEM recubiertas en cápsulas.
A continuación, transfiera las cápsulas cargadas junto con otros suministros y reactivos a la biocontención. Para empezar, conecte la cápsula a una pipeta. Aspire 40 microlitros de expansión del virus en la cápsula.
Coloque la pipeta de lado, con las rejillas orientadas horizontalmente durante 10 minutos. A continuación, tome la pipeta y dispense la solución del virus en un contenedor de desechos. Aspire 40 microlitros de fijador de glutaraldehído al 2% en las cápsulas.
Coloque la pipeta de lado durante 20 minutos. Después de esto, expulse el fijador y aspire 40 microlitros de agua desionizada en la cápsula, para lavar el fijador. Repite este lavado tres veces.
A continuación, aspire 40 microlitros de acetato de uranilo al 1% o ácido fosfotúngstico de potasio al 1% en la cápsula. Deje reposar la cápsula durante 30 segundos. A continuación, retire la cápsula de la pipeta.
Toca un pedazo de papel de filtro con el borde de las rejillas para secarlas. Transfiera el papel de filtro a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, remoje el papel de filtro en una solución de tetróxido de osmio al 1%.
Coloque la cápsula con la tapa abierta en el tubo. Selle el tubo durante una hora para permitir la penetración completa del vapor de tetróxido de osmio. Después de esto, descontamine el tubo y transfiéralo fuera de la biocontención a la instalación BSL-2 EM.
Retire la cápsula del tubo de centrífuga y, a continuación, colóquela en una pipeta. Aspire 40 microlitros de agua desionizada en la cápsula y luego dispense el agua en un contenedor de desechos. Repita este lavado con agua tres veces.
A continuación, retire la cápsula de la pipeta. Con papel de filtro, seque las rejillas. Deje que las rejillas se sequen al aire y luego guárdelas en una caja de rejilla, hasta que estén listas para realizar la toma de imágenes TEM.
Para comenzar, mezcle la suspensión del virus con un volumen igual de 4% de glutaraldehído, para lograr una concentración final de 2% de glutaraldehído. Con el fijador, inactive el virus durante al menos 24 horas. Descontamine el tubo y transfiéralo a la instalación BLS-2 EM.
Después de esto, conecte una captura cargada con rejilla a una pipeta. Aspire la mezcla en la cápsula. Coloque la pipeta de lado con las rejillas orientadas horizontalmente durante 10 minutos.
A continuación, coja la pipeta y expulse la mezcla de virus a un contenedor de residuos. Aspire 40 microlitros de agua desionizada en la cápsula y luego deseche el agua en un contenedor de desechos. Repite este lavado tres veces.
Después de esto, aspire 40 microlitros de 1 % de QA o 1 % de PTA en la cápsula durante 30 segundos. Retire la cápsula de la pipeta. Con papel de filtro, seque las rejillas.
Luego, deje que las rejillas se sequen al aire. En este estudio, las muestras del virus del Ébola de Zaire se someten a una tinción negativa, utilizando tanto el método de gotas manuales como el método de cápsulas. Las imágenes TEM generadas a partir de estos métodos, muestran detalles claramente definidos, con estructuras de nucleocápside en el centro del varión y glicoproteínas visibles en la superficie.
Así, el método de la cápsula es capaz de producir imágenes TEM de calidad similar a las producidas por el método manual de gotas. A continuación, se comparan diferentes métodos de inactivación de muestras utilizando el virus Chikungunya. La inactivación de la muestra se logra rápidamente, mediante el uso de glutaraldehído al 2% durante 20 minutos con la exposición posterior al tetróxido de osmio al 1% durante una hora, o durante la noche, mediante el uso de glutaraldehído al 2% durante 24 horas.
Como se puede ver, el proceso de inactivación más largo sin tetróxido de osmio permite ver más detalles ultraestructurales. Luego, utilizando el método de la cápsula, se compararon dos tinciones usando partículas similares a virus fijadas con aldehído. Tanto el acetato de uranilo como el ácido fosfotúngstico muestran resultados de alta calidad, con bordes claramente definidos y glicoproteínas visibles.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora y media, dependiendo del número de muestras. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar los reactivos fijadores y de tinción adecuados para sus objetivos experimentales. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el recuento de partículas, para responder a preguntas adicionales mediante el cálculo de las concentraciones de virus.
Esta técnica mejora la forma en que los virólogos pueden explorar la morfología del virus y la información de la estructura con mayor facilidad, especialmente en virus de nivel BLS-3 y 4. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar fácilmente las rejillas TEM para la tinción negativa dentro de la biocontención. No olvide que trabajar con aldehído, tetróxido de osmio y acetato de uranilo puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar precauciones como el equipo de protección personal adecuado y una campana de gases químicos al realizar este procedimiento.
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Visión general
Este protocolo proporciona un procedimiento de tinción negativa simple y eficaz para muestras virales dentro de la biocontención. Incluye una innovadora cápsula de procesamiento que mejora el manejo de las rejillas de microscopía electrónica en laboratorios BSL-2, -3 o -4.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Microscopía electrónica
- Técnicas de biocontención
Antecedentes
- La tinción negativa es crucial para estudiar la morfología del virus.
- La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una herramienta clave en la virología.
- El manejo de muestras en biocontención presenta desafíos únicos.
- Este método tiene como objetivo simplificar esos desafíos.
Propósito del estudio
- Proporcionar un método de tinción negativa TEM confiable para muestras virales.
- Facilitar la investigación de estructuras virales.
- Mejorar el manejo de muestras en entornos de alta contención.
Métodos utilizados
- Tinción negativa de muestras virales.
- Uso de una cápsula de procesamiento para el manejo de rejillas.
- Aplicación en laboratorios BSL-2, -3 o -4.
- Capacitación para nuevos usuarios para minimizar daños en las rejillas.
Principales resultados
- Manejo efectivo de rejillas TEM en biocontención.
- Aplicación exitosa a varias muestras virales.
- Potencial para un uso más amplio en investigaciones de nanopartículas.
- Mejora en la experiencia del usuario con la cápsula de procesamiento.
Conclusiones
- Este método mejora el estudio de virus en entornos seguros.
- Proporciona una solución práctica para investigadores en virología.
- Puede ser necesaria una capacitación adicional para un uso óptimo.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Handling electron microscopy grids in high-containment laboratories presents significant operational challenges due to environmental turbulence and restricted dexterity from personal protective equipment. This capsule-based method improves sample preparation reliability and throughput for virology discovery workflows in BSL-3 and BSL-4 settings. By minimizing manual grid manipulation, the technique supports consistent ultrastructural characterization of viral targets, enabling more confident go/no-go decisions in early-stage antiviral target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables morphological interrogation of viral targets to confirm structural integrity and support hypothesis-driven target selection.
- Operational Value: Reduces grid handling errors in biocontainment, improving data quality for downstream target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-contrast TEM specimens suitable for quantitative morphology assessment in screening cascades.
- Operational Value: Streamlines sample preparation for nanoparticle and macromolecule analysis, increasing assay readiness and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by providing reliable ultrastructural data from discovery through preclinical evaluation of viral candidates.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration between virology, microscopy, and toxicology teams through standardized, transferable sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling reliable negative staining of viral samples after inactivation and prior to imaging, supporting hypothesis testing and lead confirmation stages.
- Discovery Biology: Supports viral target validation by providing clear ultrastructural readouts that help clarify morphology and inform mechanistic understanding.
- Screening: Enhances assay standardization by producing consistent, artifact-minimized TEM grids for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Generates quantitative morphometric outputs (e.g., particle size, shape, surface features) that enable objective comparison of viral variants or treatment effects.
- Translational Research: Ensures sample preparation continuity from BSL-3/4 discovery to BSL-2 imaging, maintaining data integrity across containment levels.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform capability applicable to diverse specimens including viruses, nanoparticles, and macromolecules, maximizing infrastructure utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing variability in ultrastructural data acquisition.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability of TEM workflows in high-containment environments through encapsulated grid handling.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing false negatives from grid damage or staining inconsistency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of viral targets based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to unexpected morphology.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic grid loading and unloading to prevent capsule or grid damage.
- Dependent on access to TEM-compatible capsules, pipettes, and biocontainment-approved reagents (glutaraldehyde, stains, osmium tetroxide).
- Necessitates standardized timing and orientation protocols across users to ensure uniform staining and washing.
- Requires adaptation of wash and staining times based on specimen density and contaminant load.
- Limited by the need for post-staining decontamination and transfer protocols to move samples from BSL-3/4 to BSL-2 imaging facilities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Experiment Preparation in a BSL-2 Environment Prior to Working with the Virus Samples (Biocontainment Procedures were Filmed in BSL-4 Training Lab)
1:45
The Capsule Method for Negative Staining in Biocontainment Using Aqueous Glutaraldehyde and 1% Osmium Tetroxide Vapor Inactivation
4:24
The Capsule Method for Inactivation in Biocontainment 2% Glutaraldehyde Followed by Negative Staining in BSL-2 Laboratory
5:50
Results: Analyzing the Capsule Method of Negative Staining Viral Samples
7:14
Conclusion
