Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

El objetivo general de este protocolo es aislar las células intersticiales de la válvula de rata o VICs para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la válvula aórtica calcificada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la calcificación de la válvula, como por qué se calcifican las VIC y qué podemos hacer para evitar que estas células se calcifiquen. Las principales ventajas de esta técnica son la accesibilidad y el potencial de transformación en líneas celulares para estudios posteriores.

Realizar todas las disecciones en una campana ventilada previamente desinfectada con etanol al 70% para garantizar la esterilidad de las muestras y los reactivos. Esterilice las herramientas de disección esterilizándolas en autoclave, luego sumergiendo las puntas de las herramientas en un vaso de precipitados que contenga etanol al 70% antes de su uso. Remoje las herramientas de disección en vasos de precipitados con tampón de lavado antes de entrar en contacto con el animal o los tejidos.

Después de sacrificar las ratas como se describe en el protocolo de texto, coloque al animal en decúbito supino sobre una tabla de disección de vidrio y desinfecte la piel rociándola con etanol al 70%. Para diseccionar el corazón, haga una incisión de cuatro centímetros en la línea media de la rata con la ayuda de unas tijeras de disección para exponer la cavidad abdominal y retire con cuidado la caja torácica y los pulmones para exponer el corazón. Retira el corazón con unas tijeras afiladas.

Guarde el corazón diseccionado en un tampón de lavado helado hasta que se completen todas las disecciones macroscópicas de las ratas. Para microdiseccionar cada corazón, transfiera el corazón diseccionado a una placa de Petri cubierta con tampón de lavado. Recorte el músculo cardíaco con un par de tijeras rectas de resorte para quedar a la izquierda con una pequeña área que rodee la aorta ascendente y la raíz aórtica.

Con las mismas tijeras rectas de resorte, corte con cuidado la aorta ascendente hacia el ventrículo izquierdo y exponga las valvas de la válvula aórtica. A continuación, transfiera la aorta abierta a una placa de Petri estéril fresca llena de la solución salina equilibrada de Hank. Disecciona las valvas de la válvula aórtica marcadas por su forma de U única en la base de la aorta con un par de tijeras Vannas.

Guarde todos los prospectos en un mililitro de tampón de lavado helado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros hasta que se completen todas las disecciones. Una vez que se hayan recolectado todos los prospectos, centrifugue a 100 g durante un minuto a cuatro grados centígrados para eliminar el tampón de lavado. Para eliminar las células endoteliales valvulares o VECs, digerir las valvas en 100 microlitros de 425 unidades por mililitro de colagenasa II durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Interrumpa la digestión pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 microlitros. Centrifugar a 100 g durante 30 segundos para pellet los folletos. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, lavar las valvas con 500 microlitros de tampón de lavado y volver a pellet las células por centrifugación a 100 g durante 30 segundos.

Para cosechar los VIC de los folíolos, digiera con 100 microlitros de la colagenasa II durante 1,5 a dos horas a 37 grados centígrados. A continuación, libere los VIC pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 microlitros. Diluir la colagenasa II en 19 mililitros de medio de cultivo y centrifugar a 670 g durante cinco minutos para granular los VIC y los restos de valvas de la válvula.

Después de desechar el sobrenadante, transfiera los folíolos y los VIC a placas o matraces de cultivo. Cultivar los VICs durante cinco a siete días en medio de cultivo hasta alcanzar la confluencia a 37 grados Celsius en presencia de 5% de CO2, cambiando el medio después de 72 horas. Para preparar VICs primarios de rata para experimentos de calcificación in vitro, siembre las células a una densidad de 150.000 células por pocillo en placas de seis pocillos.

Mantener las células en medio de cultivo hasta que tengan más del 90% de confluencia. Trate los VIC con calcificación en comparación con el medio de control e incube a 37 grados centígrados en presencia de 5% de CO2 durante 72 horas adicionales. Para estudiar los VIC primarios de rata calcificados para análisis posteriores, retire el medio de calcificación o de control.

Lave las monocapas con tampón de lavado para eliminar los iones de calcio y fosfato no unidos antes de realizar la caracterización del VIC de rata como se detalla en el protocolo de texto. Para estudios de calcificación de VIC en ratas, tiñir las monocapas celulares con una solución de Alizarin Red S al 5%, meciendo suavemente en un agitador durante 20 minutos. Posteriormente, lavar tres veces con agua destilada durante cinco minutos cada vez.

Para cuantificar la deposición de calcio, utilice un kit de ensayo bioquímico de calcio. Extraer iones de calcio con ácido clorhídrico 0,6 molar durante 24 horas a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Coseche el sobrenadante y mida la concentración de calcio utilizando un kit de ensayo de calcio siguiendo las pautas del fabricante.

Finalmente, calcule la concentración de calcio como una fracción de la proteína celular total como se describe en el protocolo de texto. El fenotipo VIC de las células aisladas se confirmó mediante inmunofluorescencia, sondaje de los marcadores VIC, vimentina y actina alfa del músculo liso. Además, se confirmó la expresión del regulador de crecimiento VIC, factor de crecimiento tisular beta-1 y 2, mediante análisis de PCR.

También se realizó un análisis de Western blot para verificar que las CIC de rata fueran negativas para el marcador de células endoteliales CD 31, utilizando VECs mitrales caninos como control positivo. Las CIC de rata estuvieron expuestas a niveles elevados de calcio y fosfato, que imitan las condiciones patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia. Tratamiento de VICs con calcificación inducida por calcio y fosfato, determinada por tinción con rojo de alizarina para la deposición de calcio y determinación colorimétrica de los niveles de calcio después de la lixiviación con ácido clorhídrico.

El tratamiento de las VIC con calcio y fosfato indujo un aumento significativo en la expresión de ARNm de los marcadores osteogénicos MSX2, ALPL y PHOSPHO1. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas, excluyendo la digestión de 18 valvas valvulares. Al intentar este procedimiento, es importante garantizar la esterilidad durante la disección y la digestión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las VIC primarias de rata y usarlas para investigar los mecanismos detrás de la calcificación de VIC. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo y el análisis microscópico para estudiar la fisiología y el comportamiento del VIC. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la investigación cardiovascular exploren los mecanismos de las clasificaciones de las válvulas aórticas en humanos utilizando el modelo de rata.