Name: Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células intersticiales de válvula de rata para estudiar la calcificación valvular aórtica. Este protocolo permite investigar los mecanismos moleculares de la enfermedad cardiovascular.

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Anticuerpo CD31 usado fue un regalo generoso de Dr. Karen Tan, Universidad de Edimburgo. Este estudio contó con financiación de la biotecnología y el Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC) en forma de una subvención de programa estratégico del Instituto (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM y CF), un Instituto carrera camino comunión F023928/BB/1 (VEM) y beca de financiación a través de un caso de BBSRC beca BB/K011618/1 (LC).

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Comité de usuarios del Instituto Roslin el Animal y los animales se mantuvieron con arreglo a las directrices del Home Office (Reino Unido) para el cuidado y uso de animales. Para el protocolo que se describe a continuación, se utilizaron ratas Sprague Dawley de 5 - semanas de edad, hombres.
1. reactivo recetas
<ol><li>Preparar el medio de cultivo utilizando de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) y mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Agregar 10% esterilizado inactivadas por calor suero bovino fetal (FBS) y gentamicina 1%.</li>
	<li>Preparar el medio de calcificación con medio de cultivo y 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.<ol>
<li>Preparar 1 M cloruro de calcio (CaCl2) peso de 555 mg de CaCl2 y disolver en 5 mL de agua destilada para hacer 5 mL de 1 M de CaCl2. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para esterilizar la solución.</li>
		<li>Preparar 1 M fosfato de sodio por peso de fosfato de sodio dibásico anhidro 710 mg (Na2HPO4) y 600 mg de fosfato de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4), cada uno por separado en 5 mL de agua de disolución agua. Combinar 3.870 μl de Na2HPO4 y 1.130 μl de NaH2PO4y el filtro a través de un filtros 0.22 μm para esterilizar la solución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado que contiene gentamicina solución sal balanceada (HBSS) y 1% de Hank.</li>
</ol>2. preparación de la campana de la disección
<ol><li>Llevar a cabo todas las disecciones de una campana ventilada, previamente desinfectado con etanol al 70% para asegurar la esterilidad de las muestras y reactivos.</li>
	<li>Esterilice en autoclave que ellos seguidos de sumergir las puntas de las herramientas en un vaso de precipitados que contiene 70% etanol antes de utilizar los instrumentos de disección.</li>
	<li>Preparar vasos de precipitados que contiene el tampón de lavado y remojo las herramientas de disección en tampón de lavado antes de entrar en contacto con el animal o los tejidos. Mantener el tampón de lavado en el hielo en todo momento.</li>
</ol>3. extracción de VICs rata primaria
Nota: Para el protocolo que se describe a continuación, se utilizaron ratas Sprague Dawley de 5 - semanas de edad, hombres.
<ol><li>Sacrificar las ratas (~ 100 g) por dislocación cervical, según las directrices del Reino Unido Ministerio del interior.</li>
	<li>Para diseccionar el corazón de cada rata, coloque el animal decúbito supino en una mesa de disección de vidrio y desinfectar la piel rociando con etanol al 70%.</li>
	<li>Haga una incisión de 4 cm en la línea media de la rata con la ayuda de tijeras de disección, para exponer la cavidad abdominal y retire con cuidado la caja torácica y los pulmones, para exponer el corazón.</li>
	<li>Quitar el corazón con un par de afiladas tijeras curvadas del resorte y almacenar el corazón disecado en tampón de lavado frío de hielo hasta que se completen todas las disecciones brutas de las ratas.</li>
	<li>Para micro-diseccionar cada corazón, transferencia de este último en un plato de Petri cubiertas en tampón de lavado. Recortar el músculo cardiaco con un par de tijeras rectas de primavera (hoja de 6 mm) que quedará con una pequeña área alrededor de la aorta ascendente y la raíz aórtica.</li>
	<li>Usando el mismo resorte tijera recta (hoja de 6 mm), con cuidado corte la aorta ascendente hacia el ventrículo izquierdo y exponer valvas de la válvula aórtica.</li>
	<li>Transferencia la aorta abierta en una placa Petri nueva y estéril llena de HBSS. Diseccionar a los prospectos de la válvula aórtica, marcados por su única forma de 'U' en la base de la aorta, con un par de micro-Tijera capsulotomia Vannas-tipo (hoja de 3 mm).</li>
	<li>Guarde los folletos en 1 mL de tampón de lavado frío de hielo, en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL hasta completas todas las disecciones.</li>
	<li>Una vez todos folletos han sido cosechados, los centrifugar a 100 x g durante 1 min a 4 ° C para eliminar el tampón de lavado.</li>
	<li>Realice los pasos siguientes en una campana de cultura de célula para asegurar la esterilización. Para quitar las VECs, digerir los folletos en 100 μl 425 U/mL colagenasa II por 5 min a 37 ° C. Interrumpir la digestión mediante pipeteo suavemente arriba y abajo utilizando una pipeta de 200 μl.</li>
	<li>Centrifugar a 100 x g por 30 s y los folletos de la pelotilla, descartar el sobrenadante cuidadosamente. Lavar dos veces con 500 μl de tampón de lavado y re-sedimenten las células por centrifugación a 100 x g durante 30 s.</li>
	<li>Para cosechar al VICs de los folletos, digerir con 100 μl de 425 colagenasa U/mL II para 2 h y luego suelte al VICs transfiriendo suavemente arriba y abajo utilizando una pipeta de 200 μl.</li>
	<li>Diluir la colagenasa II en 19 mL de medio de cultivo y centrifugue a 670 x g durante 5 minutos para que sedimenten los VICs y restantes desechos de prospecto de la válvula. Deseche el sobrenadante y transferir folletos y VICs a placas/frascos de cultivo por consiguiente (tabla 1).</li>
	<li>Cultura el VICs durante 5-7 días en medio de cultivo, hasta llega a confluencia a 37 ° C, en presencia de 5% (gas carbónico) CO2, cambiando el medio después de 72 h. Para su posterior utilización en experimentos en vitro , paso hasta 5 veces una vez que confluency alcanza el 100%.</li>
</ol>4. inducción de la calcificación de rata VICs
Nota: Para todos los experimentos, contar las células con un hemocitómetro.
<ol><li>Realizar toda célula primaria siembra y pases en versión esterilizada para evitar la contaminación. Para preparar primaria rata VICs en vitro experimentos de calcificación, sembrar las células a una densidad de 150.000 células/pozo en placas de 6 pocillos. Mantener en medio de cultivo hasta confluencia ≥ 90% (por lo general de 72 h).</li>
	<li>Tratar al VICs con calcificación versus medio control e incubar a 37 ° C, en presencia de 5% CO2, para un adicional 72 h.</li>
	<li>Para estudiar la rata primaria calcificada VICs para posterior análisis aguas abajo, el medio de control calcificación Lave y monocapas con tampón de lavado para eliminar los iones de Ca y Pi no limite.</li>
</ol>5. rata VIC caracterización
<ol><li>Para que la inmunotinción monitorizar marcadores fenotípicos como el vimentin y el α-SMA, la semilla la rata VICs en una densidad de 150.000 células/pozo en placas de 6 pocillos que contienen cubreobjetos (las células se crecen en la superficie de la cubierta) y dejar crecer hasta el 50% de confluencia.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo y se fijan las monocapas de células con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 min antes de lavarlos 3 veces con tampón fosfato salino (PBS), durante 5 minutos cada vez. PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.</li>
	<li>Incubar la monocapa de células con buffer de permeabilización y el bloqueo (PBS 1 x, 5% de suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundario, 0.3% Tritón X-100) por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las monocapas de células con anticuerpos de ratón anti-vimentina y conejo anti-α-SMA diluidos en tampón de dilución del anticuerpo (seroalbúmina bovina al 1% + 0.3% Tritón X-100 en PBS) durante la noche a 4 ° C, agitando suavemente en un eje de balancín. Nota: Controles negativos consisten en no ratón IgG y conejo IgG, usando las mismas diluciones que las muestras de prueba.</li>
	<li>Al día siguiente, lave los anticuerpos primarios 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez.</li>
	<li>Incubar las monocapas de células con anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo por 1 h a temperatura ambiente, agitando suavemente en un eje de balancín.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBS y tweeze suavemente hacia fuera el cubreobjetos (que contienen rata VICs) con un par de pinzas y coloque sobre un cubreobjetos que contiene 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Dejo las diapositivas que curar durante por lo menos 24 h a 4 ° C antes de visualizarse con un microscopio de fluorescencia.</li>
	<li>Para el análisis de Western blot, la semilla la rata VICs en una densidad de 150.000 células/pozo en placas de 6 pocillos y dejan crecer en medio de cultivo hasta 100% confluente.</li>
	<li>Use 8 μg de proteína para ejecutar un Western blot para medir la expresión de CD31 y descartar cualquier contaminación de VEC. Nota: Un protocolo estándar de Western blot fue seguido como se describe previamente9.</li>
	<li>Estudios de genética, extracto de ácido ribonucleico (ARN) usando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Obtener cDNA mediante transcripción reversa para medir la expresión de genes de la blanco usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real (RT-PCR; también conocido como qPCR) con detección de fluoróforo verde, uso de Gapdh como el gene de la referencia, anteriormente Describe10.<ol>
<li>Utilizar el siguiente programa para análisis de PCR: 1 ciclo de 94 º C por 3 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 63 ° C por 30 s, 72 ° C por 35 s y finalmente 1 ciclo de 72 ° C durante 5 minutos.</li>
		<li>Utilizar el siguiente programa para el análisis de qPCR: 1 ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 minuto y un ciclo adicional de 95 ° C por 1 min, 55 ° C para 30 s y 95 ° C para 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute una electroforesis en gel para analizar los productos PCR utilizando un gel de agarosa al 2% en buffer borato/Tris/EDTA (TBE).</li>
</ol>6. rata VIC calcificación estudios
<ol><li>Para rojo de alizarina S y estudios bioquímicos de la calcificación, siga sembrando y la calcificación descrita en la sección 4.</li>
	<li>Mancha de las monocapas de células con solución al 5% rojo de alizarina S, mecerse suavemente en una coctelera, por 20 min. Posteriormente Lave 3 veces con agua destilada, durante 5 minutos cada vez. Adquirir imágenes de cada pozo.</li>
	<li>Para cuantificar la deposición de Ca, utilice un kit de análisis bioquímico de Ca. Lixiviación de iones de Ca2 + con 0,6 M de ácido clorhídrico (HCl) por 24 h a 4 ° C, con agitación suave.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante y medir la concentración de Ca usando un análisis de la Ca del kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Calcular la concentración de calcio como una fracción de proteína celular total. Desnaturalizar las proteínas celulares de las monocapas de células con hidróxido de sodio de 0,1 M (NaOH) + sulfato dodecyl de sodio 0.1% (SDS). Determinar la concentración de proteína total usando un detergente compatible (DC) proteína análisis siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo detallado describe un método práctico para la adquisición de la principal rata VICs, permitiendo el aislamiento de estas células de las válvulas del corazón de rata a través de la digestión enzimática. Nuestro método más apoya y extiende el uso de un modelo de ratas previamente divulgados en vitro para el estudio de la calcificación de la válvula aórtica13. El aislamiento de VICs de la válvula aórtica presenta el potencial de contaminación de VECs vecinos. Sin embargo, nuestros datos de inmunofluorescencia confirman que el paso de digestión inicial es suficiente para eliminar las VECs, haciendo las células aisladas negativas para el marcador de células endoteliales, CD31. Por otra parte, α-SMA tinción confirma el fenotipo activado de VICs, que se requiere para la calcificación12.
Aislamientos de VIC se han divulgado previamente en modelos de animales grandes6,7,8. Sin embargo, estas especies están limitadas por las herramientas genéticas y moleculares limitadas disponibles para estudio aguas abajo, así como su accesibilidad restringida en laboratorios de todo el mundo. Por el contrario, estas herramientas están bien establecidas en roedores disponibles y por lo tanto, la capacidad de aislar derivados de rata permite de VICs una mayor capacidad de diseño experimental. El uso de VICs de ratas jóvenes también significa que las células son relativamente más proliferativas que las ratas mayores, por lo tanto requiriendo menos animales para producir más células. Aunque los ratones son fácilmente accesibles, pero debido a ratones corazones más pequeños en particular, el aislamiento del primario de ratón VICs sería más desperdiciadores de tiempo y considerablemente más animales sería requeridos para aislar el mismo rendimiento de las células como el modelo de la rata.
Una ventaja importante de este enfoque descrito es que VICs puede aislados temporal de tipo salvaje y las ratas transgénicas, así como modelos de ratón de la enfermedad cardiovascular, lesiones de válvula. Utilizando el modelo de rata requeriría un mayor número de animales para experimentos a gran escala, por lo tanto para reducir el uso de animales, la rata principal VICs puede transformarse para producir una línea de celular una vez que se ha caracterizado bien.
Mientras que la severas implicaciones clínicas del CAVD son ampliamente reconocidas, los mecanismos causales subyacentes han determinado. Además, medicación efectiva no existen tratamientos que pueden prevenir y curar potencialmente calcificación de la válvula aórtica en el presente. La cultura de VICs bajo condiciones de calcificación, por tanto, ofrece un modelo altamente relevante en vitro de CAVD. Nos muestran que los niveles elevados de Ca y Pi inducen la calcificación en vitro de VICs aislado de rata con un aumento concomitante en la expresión de marcadores osteogénicos gen Msx2, Alply Phospho1. Está ampliamente establecido que estos marcadores se asocian con el proceso patológico de calcificación vascular14,15,16. Por lo tanto, nuestros datos muestran que la cultura de la rata VICs en medio de calcificación es un modelo apropiado con el cual estudiar la calcificación de la válvula aórtica in vitro. De hecho, estudios recientes de nuestro laboratorio han utilizado este modelo para demostrar que Ca promueve la calcificación de la válvula aórtica a través del enriquecimiento de anexina VI de vesículas de matriz derivados de VIC17.
A pesar de los beneficios de usar rata VICs y su caracterización eficiente, todavía existen algunas limitaciones. En primer lugar, el tamaño de la población de VIC en válvulas de rata es muy pequeño, y por lo tanto, muchos animales son necesarios para generar un número de células suficiente para estudios extensos en vitro . Sin embargo, es posible superar esta limitación por realización de estudios preliminares en líneas de células intersticiales válvula inmortalizado, como recientemente nos informa18y posteriormente emplear cultivos primarios para verificar y ampliar estos resultados.
En Resumen, el método descrito explica el aislamiento exitoso, la cultura y la calcificación de primaria rata VICs, que puede evaluarse posteriormente usando una variedad de análisis de Ensayos bioquímicos, así como proteína y análisis de RNA. Este modelo ofrece un sistema confiable y conveniente investigar CAVD en vitroy proporciona una herramienta valiosa para investigar los mecanismos moleculares responsables de esta destructiva enfermedad.

La válvula aórtica sana está compuesta por tres valvas, que la distribución de esfuerzos mecánicos durante la apertura y cierre de la válvula se distribuye igualmente. El prospecto de la válvula tiene una estructura definida de tres capas distintas: la ventricularis, que la casa de la válvula de células intersticiales (VICs) como el tipo celular predominante, fibrosa y spongiosa. Estas tres capas se intercalan entre las dos camas de válvula células endoteliales (VECs)1.
VICs juegan un papel crítico en la progresión de la calcificación aórtica válvula de calcificación (CAVD), la valvulopatía más común en el mundo occidental. CAVD es descrito como una condición progresiva que activamente está reglamentada por el tejido valvular y su microambiente circundante. Cambios celulares inicialmente causan engrosamiento fibrótico y finalmente una extensa calcificación de las valvas de la válvula aórtica. Esto entonces conduce a estenosis aórtica significativa y en última instancia, left ventricular salida obstrucción2, dejando la sustitución valvular quirúrgica como el tratamiento único.
La fisiopatología de la CAVD es compleja, pero comparte mecanismos similares de mineralización ósea fisiológica3. Mientras que un número de estudios ha demostrado la capacidad de VICs a trans-Diferenciación osteogénica y calcificación4,5, los mecanismos que sustentan este proceso aún no han aclarado completamente, destacando la requisito fundamental para un modelo factible y pertinente en vitro de CAVD.
Trabajo anterior por un número de laboratorios con éxito ha aislado a VICs modelos porcinos y bovinos y cultivar estas células bajo condiciones6,7,8de calcificación. Debido al gran tamaño de la válvula aórtica en estos modelos, el aislamiento de las células a través de digestión enzimática ha sido altamente eficaz en la generación de poblaciones puras de células. Sin embargo, estos modelos pueden ser restrictivos debido a la disponibilidad limitada de herramientas moleculares para especies grandes. En cambio, modelos de roedores siendo ventajosos debido a los costos relativamente más bajos, posibilidades de manipulación genética y la amplia gama de herramientas moleculares que están disponibles. Sin embargo, el aislamiento de VICs de modelos animales pequeños no es ampliamente empleado, que es una consecuencia probable de las dificultades encontradas cuando se trabaja con muestras pequeñas de tejido.
Este protocolo detallado divulga un método integral para el aislamiento directo de rata VICs. Por disección cuidadosa de la válvula, seguida de una serie de digestiones enzimáticas, VICs pueden ser aislados y empleados en una amplia variedad de técnicas experimentales, entre ellas la célula cultura, calcificación y expresión genética. Este modelo de gran relevancia en vitro de CAVD, sin duda, hará una contribución esencial al aumento de nuestro conocimiento de este proceso patológico.

<table><tbody><tr><td>Tijeras de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave antes de su uso.</td></tr><tr><td>Resorte recto (hoja de 8 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15905</td><td>Autoclave antes de su uso.</td></tr><tr><td>Tijeras SuperFine Vannas (hoja de 5 mm, 8 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>Autoclave antes de su uso.</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 (11 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave antes de su uso.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Filtrar antes de añadirlo al medio de cultivo.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Diluido al 70% v/v en agua destilada.</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1150PB17</td><td>Diluir a 0,6 M con agua destilada.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1823</td><td>Diluir a 0,1 M con agua destilada.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anticuerpo anti-ratón</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>dilución 1/250 en tampón de dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anticuerpo anti-conejo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>dilución 1/250 en tampón de dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Kit Superscript II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Imprimadores aleatorios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P/N58875</td><td></td></tr><tr><td>Taq Kit de polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18038026</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Borato/EDTA (TBE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9863</td><td>Diluir a 1x con agua destilada, antes de usar.</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500</td><td>2% en 1x Tris/Borato/EDTA (TBE).</td></tr><tr><td>Tampón de lisis (RIPA)</td><td>Matraz Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>Matraz Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>T175</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159920</td><td></td></tr><tr><td>placas qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0990</td><td></td></tr><tr><td>Rat Msx2 imprimación</td><td>Qiagen</td><td>QT01084090</td><td></td></tr><tr><td>Rat Alpl primer</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00190680</tr><tr><td>Rata Enpp1</td><td>cebador Qiagen</td><td>QT00181426</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Sigma</td><td>CLS430639</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dibásico</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Diluido al 0,1% con NaOH 0,1M.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluido al 4% con PBS.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Alizarina roja S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td>Hacer hasta un 2% con agua destilada y ajustar a pH 4.2.</td></tr><tr><td>TGF&beta;-1 par de cebadores: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA</td><td>Sigma</td><td></td><td>Concentración utilizada: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TGF&beta;-2 par de cebadores: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG</td><td>Sigma</td><td></td><td>Concentración utilizada: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&beta;-Actina&menos; Anticuerpo peroxidasa producido en Sigma</td><td></td><td>A3854</td> de ratón <td>dilución 1/50000 en BSA al 5% en solución salina tamponada con tris + 0,1% Tween (TBS/T).</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-vimentina para ratones</td><td>Sigma</td><td>v6389</td><td>dilución 1/900 en tampón > dilución <fuerteanticuerpos</fuerte> (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1% albúmina sérica bovina (BSA), 0,3% Triton X-100).</td></tr><tr><td>IgG</td><td>Sigma</td><td>I5381</td> de ratón <td>Diluida a la misma concentración de stock que el anticuerpo anti-vimentina de ratón antes de la dilución en tampón de dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Conejo IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX35035</td><td>Diluido a la misma concentración de stock que el anticuerpo de actina anti-&alfa;-músculo liso de conejo antes de la dilución en tampón de dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Anticuerpo de actina anti-&alfa;-músculo liso de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>dilución 1/200 en tampón de dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Conejo anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>dilución 1/50 en BSA al 5% inTBS/T.</td></tr><tr><td>Dilución del anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>en 5% BSA en TBS/T.</td></tr><tr><td>Colagenasa II</td><td>Worthington 41512862</td><td></td><td>Ajuste a 425 U/mL con agua destilada y luego filtre.</td></tr><tr><td>SYBR green mastermix</td><td>Primerdesign</td><td>PrecisionPLUS-MX-SY</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de calcio</td><td>Randox</td><td>CA590</td><td></td></tr><tr><td>DC kit</td><td>de ensayo de proteínas Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2109</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL GE</td><td>Healthcare</td><td></td> 28906837 <td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600007</tr><tr><td>escalera de PCR</td><td>Bioline</td><td>BIO-33057</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de carga para electroforesis en gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S Filtros de</td><td></td></tr><tr><td>jeringa (0.22 &mu; m)</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>MIC3100</td><td></td></tr><tr><td>Hematocitómetro</td><td>Marienfeld Superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Camera configurada para imágenes de Alizarin red:</td>Camera Nikon D800 Lente Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED Pinzas de disección 10 cm, extremos curvos World Precision Instruments 15915 Autoclave antes de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>usar.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD) se caracteriza por el progresivo engrosamiento de valvas de la válvula aórtica. Es una condición frecuente en los pacientes ancianos y fase final de enfermedad renal (terminal ERT), que comúnmente sufren de hiperfosfatemia y la hipercalcemia. En la actualidad, hay no hay terapias de medicación que pueden detener su progresión. Todavía no están claros los mecanismos que subyacen a este proceso patológico. El prospecto de la válvula aórtica está compuesto por una fina capa de células endoteliales de la válvula (VECs) en las superficies externas de las cúspides aórticas, con válvula las células intersticiales (VICs) intercaladas entre las VECs. El uso de un modelo de rata permite el estudio en vitro de calcificación ectópica basado en el en vivo fisiopatológicos suero fosfato (Pi) y los niveles de calcio (Ca) de los pacientes que sufren de la hiperfosfatemia y la hipercalcemia. El protocolo descrito detalles el aislamiento de una población de VIC de puro rata como se muestra en la expresión de marcadores de VIC: músculo liso alfa actina (α-SMA) vimentin y tejido factor de crecimiento beta (TGFβ) 1 y 2 y la ausencia de cluster de diferenciación (CD) 31, un VEC marcador. Ampliando estos VICs, estudios bioquímicos, genéticos y proyección de imagen pueden realizarse para estudiar y desentrañar los mediadores claves que sustentan CAVD.

El objetivo de este protocolo fue describir el aislamiento de primaria rata VICs y cultura para los experimentos en vitro la calcificación. Empleando el método descrito anteriormente, rata VICs puede aislado con éxito y ampliado para el estudio de los mecanismos responsables de CAVD.
VICs primaria rata localización conjuntamente con los marcadores establecidos VIC:
El fenotipo de células aisladas de VIC fue confirmado a través de inmunofluorescencia mediante el análisis de los marcadores de VIC: vimentina y α-SMA (rojo y verde, respectivamente, figura 1A) y está de acuerdo con anteriores informes de11,12. Los controles negativos representativos con IgG de conejo y ratón no se muestran en la figura 1B. Además, la expresión del regulador del crecimiento de VIC TGFβ-1 y TGFβ-2 fue confirmada mediante análisis PCR (figura 1). Para confirmar que la rata aislada primarios VICs estaban libres de contaminación endotelial, se realizó análisis de Western blot para comprobar esa rata VICs eran negativos para el marcador de células endoteliales, CD31, usando VECs mitrales caninas como control positivo ( Figura 1).
CA y Pi inducen calcificación de VIC de rata:
Las concentraciones sistémicas elevadas de la Ca o Pi normalmente conducen la calcificación de VICs en vitro. Para apreciar el potencial de calcificación de la rata aislada VICs, las células fueron expuestas a niveles elevados de Ca y Pi, que imitan las condiciones patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia en pacientes ESRD. Tratamiento de VICs con 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi inducida por calcificación, según lo determinado por la coloración rojo S de alizarina para deposición de Ca (figura 2A) y colorimétrico determinación de niveles de Ca después de ácido clorhídrico, lixiviación (81 veces; p < 0.05 usando del estudiante t-pruebas; Figura 2B).
Cambios de expresión de gen asociados a calcificación de VIC:
La calcificación de las células vasculares en vitro se asocia con un perfil molecular distinto. En el presente estudio, el tratamiento de VICs con 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi indujo un aumento significativo en la expresión del mRNA de los marcadores osteogénicos: Msh homeobox 2, Msx2 (2,04 veces cambio; p < 0.01; Figura 3A), fosfatasa alcalina, Alpl (cambiar veces 1.49; p < 0.001; Figura 3B) y phosphoethanolamine/fosfocolina fosfatasa, Phospho1 (4.7 veces el cambio; p < 0.01 usando ANOVA unidireccional; Figura 3). Sin embargo, la expresión de marcadores osteogénicos, Runx2y calcificación inhibidor de la ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, permaneció sin cambios (figura 3D–E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig1.jpg"> Figura 1. Expresión de marcadores de VIC. (A) inmunofluorescencia mostrando doble coloración y colocalización de la actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA; verde) y vimentina en las células intersticiales de la válvula (VICs). (B) imagen representativa de los controles negativos con IgG de conejo y ratón. Los núcleos se tiñen en azul con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Barra de escala = 50 μm. (C) la presencia de transformación de factor de crecimiento beta 1TGFβ-1y TGFβ-2 en VICs (carriles 1 - 3) Como se muestra por el análisis PCR. Carril 4 es el control de agua. Gen de referencia utilizado fue Gapdh. (D) análisis de Western blot mostrando la expresión abundante de CD31 en células endoteliales de la válvula mitral canina (VECs) en comparación con la no expresión de VICs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig2.jpg"> Figura 2. In vitro la calcificación de rata VICs. Deposición de CA en VICs tratados con 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi determinada por: (A) fotografía mostrando la coloración de alizarina roja S de monocapas de células enteras en el pozo y (B) colorimétrico determinación de niveles de Ca después de lixiviación ácido clorhídrico. De Student t-test fue realizado para analizar la significancia entre los grupos de dos datos. Los resultados se presentan como promedio ± SEM *p < 0.5 comparado con control; (n = 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig3.jpg"> Figura 3. Cambios de expresión génica asociados a calcificación VIC. Doble cambio en la expresión de mRNA de marcadores osteogénicos (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2, y (E) Enpp1 en VICs tratados con 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi para expresión de mRNA de 48 h. se muestra como un cambio del doble comparado con el gen de referencia endógena Gadph. ANOVA unidireccional mediante modelo lineal general, incorporando las comparaciones de pares se realizó para analizar la significación entre varios grupos. Los resultados se presentan como promedio ± SEM **p < 0.01; p < 0,001 comparado con el control; (n = 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Número de valvas</td>
			<td>Placa/frasco de cultura</td>
		</tr>
<tr>
<td>9 a 15</td>
			<td>1 bien en placa de 12 pozos</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 a 30</td>
			<td>1 bien en placa de 6 pozos</td>
		</tr>
<tr>
<td>30 +</td>
			<td>T25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Lineamientos generales para el número de folletos necesarios para la siembra inicial.

Este protocolo describe el aislamiento, la cultura y la calcificación de las células intersticiales de rata-derivado de la válvula, un modelo altamente fisiológica en vitro de enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD). Explotación de este modelo de rata facilita investigación CAVD en la exploración de la célula y los mecanismos moleculares que subyacen a este complejo proceso patológico.

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

El objetivo general de este protocolo es aislar células intersticiales de la válvula de rata o VICs para estudiar los mecanismos de la enfermedad valvular aórtica calcificante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la calcificación valvular, como por qué las VICs se calcifican y qué podemos hacer para prevenir que estas células se calcifiquen. Las principales ventajas de esta técnica son la accesibilidad y el potencial de transformarse en líneas celulares para estudios posteriores.Realice todas las disecciones en una campana extractora previamente desinfectada con etanol al 70 % para garantizar la esterilidad de las muestras y los reactivos. Esterilice las herramientas de disección mediante autoclave, seguido de la inmersión de las puntas de las herramientas en un vaso de precipitados que contenga etanol al 70 % antes de su uso. Sumerja las herramientas de disección en vasos de precipitados con tampón de lavado antes de que entren en contacto con el animal o los tejidos.Después de sacrificar las ratas según se describe en el protocolo escrito, coloque el animal en posición supina sobre una tabla de disección de vidrio y desinfecte la piel rociando con etanol al 70 %. Para extraer el corazón, realice una incisión de cuatro centímetros en la línea media de la rata con ayuda de tijeras de disección para exponer la cavidad abdominal, y retire cuidadosamente la caja torácica y los pulmones para exponer el corazón. Extraiga el corazón con un par de tijeras afiladas.Guarde el corazón disecado en tampón de lavado frío con hielo hasta que se completen todas las disecciones macroscópicas de las ratas. Para microdisecar cada corazón, transfiera el corazón disecado a una placa de Petri cubierta con tampón de lavado. Recorte el músculo cardíaco con un par de tijeras rectas de resorte para dejar una pequeña área que rodee la aorta ascendente y la raíz aórtica.Con las mismas tijeras rectas de resorte, corte cuidadosamente la aorta ascendente hacia el ventrículo izquierdo y exponga las valvas del corazón. A continuación, transfiera la aorta abierta a una nueva placa de Petri estéril llena con solución salina balanceada de Hank. Diseque las valvas aórticas marcadas por su forma única en U en la base de la aorta con un par de tijeras de Vannas.Guarde todos los velos en un mililitro de tampón de lavado frío con hielo en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros hasta que todas las disecciones estén completas. Una vez que se hayan recolectado todos los velos, centrifúgelos a 100g durante un minuto a cuatro grados Celsius para eliminar el tampón de lavado. Para eliminar las células endoteliales valvulares o VEC, digiera los velos en 100 microlitros de 425 unidades por mililitro de Colagenasa II durante cinco minutos a 37 grados Celsius.Interrumpa la digestión pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 microlitros. Centrifugue a 100g durante 30 segundos para sedimentar las láminas foliares. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, lave las láminas foliares con 500 microlitros de tampón de lavado y vuelva a sedimentar las células mediante centrifugación a 100g durante 30 segundos.Para recolectar los VIC a partir de los velos, realice una digestión con 100 microlitros de colagenasa II durante 1,5 a dos horas a 37 grados Celsius. Luego, libere los VIC pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 microlitros. Diluya la colagenasa II en 19 mililitros de medio de cultivo y centrifugue a 670 g durante cinco minutos para obtener un sedimento con los VIC y los restos del velo valvular.Después de desechar el sobrenadante, transfiera las valvas y las CIV a placas o frascos de cultivo. Cultive las CIV durante cinco a siete días en medio de cultivo hasta alcanzar la confluencia a 37 grados Celsius en presencia de 5%CO2, cambiando el medio después de 72 horas. Para preparar CIV primarias de rata para experimentos de calcificación in vitro, siembre las células a una densidad de 150.000 células por pocillo en placas de seis pocillos.Mantenga las células en medio de cultivo hasta alcanzar una confluencia mayor al 90 %. Trate los VIC con medio de calcificación frente al medio de control e incube a 37 grados Celsius en presencia de 5 %CO2 durante 72 horas adicionales. Para estudiar los VIC primarios calcificados para análisis posteriores, retire el medio de calcificación o el medio de control.Lave los monocapas con tampón de lavado para eliminar los iones de calcio y fosfato no unidos antes de realizar la caracterización de VIC de rata según se describe en el protocolo del texto. Para los estudios de calcificación de VIC de rata, tiña los monocapas celulares con solución al 5 % de rojo de alizarina S, agitando suavemente en un agitador durante 20 minutos. Posteriormente, lave tres veces con agua destilada durante cinco minutos cada vez.Para cuantificar la deposición de calcio, utilice un kit de ensayo bioquímico de calcio. Extraiga los iones de calcio utilizando ácido clorhídrico 0,6 molar durante 24 horas a cuatro grados Celsius con agitación suave. Recupere el sobrenadante y mida la concentración de calcio utilizando un kit de ensayo de calcio siguiendo las instrucciones del fabricante.Finalmente, calcule la concentración de calcio como fracción de la proteína celular total según se describe en el protocolo del texto. El fenotipo de las células aisladas se confirmó mediante inmunofluorescencia, detectando los marcadores de las células intersticiales valvulares, vimentina y actina alfa del músculo liso. Además, se confirmó la expresión del regulador del crecimiento de las células intersticiales valvulares, el factor de crecimiento tisular beta-1 y beta-2, mediante análisis de PCR.Se realizó también un análisis por inmunotransferencia para verificar que las CIV de rata fueran negativas para el marcador de células endoteliales CD 31, utilizando CVE mitrales de canino como control positivo. Las CIV de rata se expusieron a niveles elevados de calcio y fosfato, que simulan condiciones patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia. El tratamiento de las CIV con calcio y fosfato indujo calcificación, según se determinó mediante tinción con rojo de alizarina para detectar depósitos de calcio y mediante la determinación colorimétrica de los niveles de calcio tras la lixiviación con ácido clorhídrico.El tratamiento de las VIC con calcio y fosfato indujo un aumento significativo en la expresión de ARNm de los marcadores osteogénicos MSX2, ALPL y PHOSPHO1. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una a dos horas, excluyendo la digestión de 18 cúspides valvulares. Al intentar este procedimiento, es importante garantizar la esterilidad durante la disección y la digestión.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislarse las CIV primarias de rata y cómo utilizarlas para investigar los mecanismos detrás de la calcificación de las CIV. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como citometría de flujo y análisis microscópico con el fin de estudiar la fisiología y el comportamiento de las CIV. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la investigación cardiovascular exploren los mecanismos de clasificación de las válvulas aórticas en humanos utilizando el modelo de rata.

isolation-characterization-primary-rat-valve-interstitial-cells-new

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Aislamiento de células endoteliales valvular

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Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica (Video) | JoVE Journal

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

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