Name: Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprende la técnica PHASOR de cirugía craneal piezoeléctrica en ratones para reducir el tiempo quirúrgico y mejorar la imagen in vivo de la actividad neuronal. Este método optimiza la preparación de ventanas craneales con mayor precisión y seguridad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tamara Zeric para ayudar a obtener la imagen multifotón en este papel. Apoyado por el cerebro y comportamiento, enfermedad de Parkinson y fundaciones JPB, R01 MH108186 y R01 DA07418. F31 beca 1F31MH109293-01A1 S c.

Todos los procedimientos que implican animales fueron realizados según los estándares establecidos por la Columbia University Medical centro institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Eutanasia se realizó mediante dislocación cervical bajo anestesia con ketamina 100 mg/kg y xilacina 10 mg/kg inyectado por vía intraperitoneal. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron de manera estéril (cirujano llevaba tapa cabeza, mascarilla, guantes estériles y bata desechables limpias) y herramientas quirúrgicas fueron esterilizados entre cada uso.
1. medidas prequirúrgicas
<ol><li>Autoclave de los instrumentos quirúrgicos para garantizar la esterilidad.</li>
	<li>Anestesiar ratones C57bl6 con isoflurano (4% para la inducción y 1.5-2% para la cirugía). Pellizque el dedo del pie trasero cada 10 minutos para asegurar la adecuada profundidad de la anestesia. Aumentar la anestesia si se observa retracción de vocalización o extremidades.</li>
	<li>Aplicar lubricante ocular veterinaria en los ojos para prevenir la resequedad.</li>
	<li>Quitar el pelo sobre el cuero cabelludo con una aplicación de 3 min de gel para quitar el cabello o afeitarse con una afeitadora eléctrica.</li>
	<li>Coloque el ratón en el fotograma estereotáxicas en una almohada o manta de recirculación de agua calibrado a 38° C.</li>
	<li>Administre buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea para proporcionar analgesia prequirúrgica.</li>
	<li>Desinfectar el cuero cabelludo con tres aplicaciones alternadas de clorhexidina o betadine y etanol al 70% utilizando un aplicador con punta de algodón.</li>
	<li>Inyectan 100 mL de bupivacaína diluido 50% en solución salina debajo del cuero cabelludo para proporcionar anestesia local.</li>
</ol>2. piezoeléctrico ventana craneal cirugía
<ol><li>Usando instrumental quirúrgico estéril esterilizado, retire un círculo de 1 cm del cuero cabelludo sobre el cráneo cortando con tijeras quirúrgicas en un patrón circular. Levante el cuero cabelludo de la exponer el tejido periostio sobre el hueso del cráneo.</li>
	<li>Utilice la punta de la pinza para raspar el hueso expuesto de cualquier tejido remanente del periostio. Esto es importante para asegurar que el cemento dental no caerá más tarde.</li>
	<li>Ajustar la unidad de cirugía piezoeléctrica para vibrar en la posición más baja. Tenga en cuenta que temperaturas más elevadas pueden romper los vasos sanguíneos debido a las vibraciones intensas.</li>
	<li>Fijar la punta circular estéril a la pieza de mano. Nota: La punta circular de 4 mm es ideal para cirugías. El tamaño de punta grande contribuye a la velocidad de la cirugía como la ventana entera puede diluirse al mismo tiempo.</li>
	<li>Llene una jeringa de 10 mL con hielo frío artificial del líquido cerebroespinal (ACSF) y manténgalo en la mano que no sujeta la pieza de mano piezoeléctrica.</li>
	<li>Regar el cráneo por goteo la ACSF de la jeringa en el cráneo a un ritmo de 1 mL/min o bien, utilizar una bomba peristáltica que se coloca sobre el cráneo para liberar el uso de la otra mano. Nota: Riego con ACSF fría es importante para evitar el sobrecalentamiento debido a la fricción de las vibraciones de alta frecuencia.</li>
	<li>Aplique suavemente la punta vibrante quirúrgica en el cráneo con un ligero movimiento circular (3 círculos por 1 s) y delgada del hueso a la profundidad deseada para llevar a cabo una preparación de cráneo delgada (5 a 10 min). Nota: Aquí, windows 4 mm hicieron que se estrecharon a 20 μm. Sin embargo, el tamaño de la ventana varía con el tamaño de la punta quirúrgica. Puede ajustar el espesor del hueso a la profundidad deseada basada en la longitud de tiempo aplicar la punta del cráneo.</li>
	<li>Ajustar el ángulo de la pieza de mano y cambiar el ángulo de la punta mientras se aplica presión en el cráneo para diluir el cráneo uniformemente.</li>
	<li>Para realizar un retiro completo de hueso sin dejar ningún hueso fino detrás, delgada del hueso hasta que grietas visibles en el área de la ventana. Quitar las escamas de la restantes del hueso delgado con fórceps sin dañar la duramadre subyacente.</li>
	<li>Remoje un pedazo de 1 mm de espuma de colágeno hemostático en frío ACSF. Mantenga la espuma húmeda con pinzas y coloque sobre el cráneo delgado. Permita que se sientan en el cráneo fino de unos 30 s para detener cualquier micro sangrados de países en desarrollo.</li>
	<li>Utilice pinzas para colocar un cubreobjetos de vidrio de 4 mm lateralmente sobre la ventana que ha sido adelgazada en el hueso.</li>
	<li>Use la parte posterior de un algodón pequeño de plástico o de madera aplicador con punta de aplicar aproximadamente 100 μl de acrílico dental en el cráneo para mantener la ventana en su lugar.</li>
</ol>3. post quirúrgico cuidado
<ol><li>Quitar el mouse del equipo quirúrgico y colóquela en una jaula climatizada para la recuperación. Monitor continuamente hasta que ha recuperado el sentido completo (determinado por el comportamiento, la marcha y movilidad normal).</li>
	<li>Evaluar los animales dos veces al día durante tres días de manifestaciones de dolor post-quirúrgico, incluyendo disminución de la actividad, aseo personal, alimentación y consumo de agua, vigilancia de comportamiento (por ejemplo, cojera o una postura jorobada) o mayor agresividad. No devolver el animal a la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente.</li>
	<li>Administrar la buprenorfina (0.05 – 0.1 mg/kg) por vía subcutánea como un analgésico 8 – 12 h después de la cirugía durante 3 días. Vigilar la zona de la ventana de cerca después de la cirugía para signos de infección, la inflamación y la dehiscencia. Si el animal vuelve a la base de alimentación y aseo personal comportamientos, consulte a un veterinario sobre posibles intervenciones o la eutanasia.</li>
</ol>

<ol><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li>
<li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210017/meta">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li>
<li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+surgery+in+implantology%3A+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li>
<li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation%3A+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li>
<li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthodontic+microsurgery%3A+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li>
<li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4646478/">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li>
<li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contemp+Dent+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li>
<li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0901502711002232">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li>
</ol>

Hay no hay revelaciones.

La cirugía puede modificarse cambiando la punta quirúrgica. Hay muchos diversos tamaños de punta que se puede aplicar a la pieza de mano. Cambiar el tamaño o la forma de la punta se traducirá en diferentes grandes ventanas. Además de la punta de 4 mm, también intentó una punta de 3 mm y encontró también funcionó bien. Incluso con riego de hielo frío ACSF, no fuimos capaces de obtener buenos resultados con consejos que eran demasiado estrechas (aproximadamente 0,25 mm) debido a las vibraciones concentradas causando demasiado calor y quema el hueso que lleva al daño a la duramadre subyacente. No hemos intentado la multitud de otros consejos que están disponibles, y esperamos que otros laboratorios puedan encontrar nuevas aplicaciones para estos consejos diferentes. Mientras que la cirugía es relativamente sencilla, encontramos que hay varios pasos que pueden requerir la solución de problemas. La primera es que la punta vibrante produce mucha turbulencia en la ACSF, que produce dificultad en determinar la profundidad del hueso durante el paso de la cirugía de reducción del hueso y disminuye la visibilidad. Recomendamos que si es muy difícil ver lo delgado el hueso es, tomar un descanso para secar el cráneo y la ventana aplicando un hisopo de algodón estéril en la parte del hueso. No aplique el aplicador de algodón directamente a la ventana, ya que la superficie rugosa es perjudicial para el hueso fino. Después de comprobar la profundidad, aplicar ACSF y continuar con la cirugía. También se encontró que si existe daño a la duramadre, es generalmente debido al cirujano poner demasiada presión en la punta. Sosteniendo la pieza de mano más suavemente y aplicar menos fuerza probablemente se solucionará este problema. Si el cirujano es raspado por la fuerza la punta del hueso, que causa una rotura en el hueso fino y dañar el cráneo. Por último, si después de adelgazamiento del hueso, el dura subyacente aparece magullado, es probablemente debido al exceso de calor de las vibraciones. Aumentando la tasa de flujo de la ACSF solucionará este problema.
La principal limitación del fasor es que la pieza de mano puede enrarecer el hueso, pero no puede quitar el hueso sobre la duramadre. La punta de diamante recubierto tiene pequeñas protuberancias ásperas. El roce necesario para diluir el cráneo sería desgastar la dura y causar sangrado si se utiliza para quitar el hueso. Así, el uso de fórceps es necesaria para eliminar la fina capa restante. Mientras que hay discusión en curso sobre si la proyección de imagen a través de un cráneo fina produce menos inflamación y menos proliferación de microglia y astrocitos reactivos, en algunos casos una ventana sin hueso restante es preferida, por ejemplo, para proporcionar una mayor profundidad de imagen3 .
Hemos optimizado la preparación de ventana craneal imagen multifotón en ratones. Fasor es, a nuestro conocimiento, la primera aplicación de la técnica piezoeléctrica a la cirugía de roedores ventana craneal para la proyección de imagen óptica. Encontramos que el uso de la cirugía piezoeléctrica en ratones comparte las ventajas del aumento de la velocidad y disminución de eventos adversos registrados también en los seres humanos7,8,9,10. Utilización del dispositivo piezoeléctrico dio lugar a cirugías más rápidas (figura 2A) y menos eventos adversos de sangrado comparado con una alta velocidad rotatoria del taladro (figura 2B). También encontramos, dentro de nuestro laboratorio, que fasor era más fácil para los nuevos cirujanos de aprender que los enfoques tradicionales para cirugía craneal ventana. Ventajas de la velocidad y facilidad de uso están probable que difieran entre los cirujanos. Preparaciones de cráneo fina requieren típicamente 30-45 min para adelgazar el hueso con un taladro y bisturí2, mientras que el enfoque de fasor normalmente requiere menos de 10 minutos.
Encontramos que en windows con FASORES podríamos imagen transitorios del calcio en neuronas piramidales de la capa 4 en la corteza de motor que habían sido transfectadas con virus adeno asociado codificación del indicador de calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). también encontramos que, en comparación con una ventana craneal cráneo fino preparada con un taladro y un bisturí, la proyección de imagen de la región era más grande, mientras que un cráneo fino elaborado con un taladro y bisturí tiene una ventana de proyección de imagen de 20 μm de diámetro2 . Con FASORES, pudimos rápidamente fina una superficie de 3-4 mm. Esto es similar a la ventana de proyección de imagen divulgada con puertos4. Esta ventana más grande conserva el beneficio de la proyección de imagen rápida para windows delgada del cráneo con un taladro dental y bisturí. Además, la ventana con FASORES puede ser reflejada inmediatamente, en lugar de deshuese tradicional windows que requieran semanas para sanar antes de que la ventana puede ser óptimo imagen3.
Esta técnica puede aplicarse para estudiar alteraciones en el flujo sanguíneo en los vasos debajo de la duramadre. Un importante estudio es comparar el immunoreactivity de fasor con otros métodos de ventana craneal. Esto sería importante para determinar si el fasor produce menos inflamación en comparación con los métodos existentes. Esperamos que la técnica quirúrgica piezoeléctrica documentada aquí permitirá que más laboratorios realizar ventanas craneales y utilizar con éxito en vivola proyección de imagen multifotón.
Asegúrese de que la pieza de mano es vibrar en la posición más baja y que la ACSF es ser irrigado con una velocidad constante. El frío del hielo que se debe aplicar constantemente la ACSF o se calientan y dañar la duramadre. Encontramos que la ACSF debe aplicarse a una velocidad de al menos 1 mL/min puede utilizar una jeringa en la mano, o usar una bomba peristáltica, en lugar de la irrigación incorporada en la pieza de mano. El sistema de irrigación en la pieza de mano expulsa ACSF con demasiada fuerza y produce mucha turbulencia, lo que afectará significativamente la visibilidad.

Cirugía de ventana craneal para preparar roedores multifotón imágenes en vivo se ha convertido en una técnica importante en Neurociencia. La remoción o adelgazamiento del hueso es necesario preparar el ratón para la proyección de imagen óptica con un microscopio multifotón. Esta cirugía se realiza por quitar completamente una zona del hueso para exponer la dura subyacente1, o por el adelgazamiento de una región del hueso sin el retiro completo de la dura2. El enfoque fino del cráneo puede producir menos inflamación y la activación de la microglia3 pero ofrece una menor profundidad de la proyección de imagen, un tamaño más pequeño de la ventana imagen (200 μm) y un período de tiempo limitado durante el cual la ventana puede ser reflejada debido a la regeneración de hueso2 . La adición de una ventana de cristal pulido y reforzado (puertos) puede aumentar el tamaño de imagen y el período de proyección de imagen pero es difícil de realizar4.
Ambas cirugías actuales utilizan un taladro de alta velocidad a fina o quitar el hueso del cráneo. La técnica cráneo fina también utiliza un bisturí después el taladro a la más delgada del hueso2. La técnica de los puertos requiere el paso adicional de alta velocidad de pulido con arena4. En una alta velocidad rotatoria del taladro, una turbina de aire o motor eléctrico hace que la broca al girar a alta velocidad. Como taladros rotativos sección de hueso y tejidos blandos, existe el riesgo de dañar la duramadre y subyacentes de los vasos sanguíneos. El éxito de la cirugía depende de la habilidad del cirujano. Además de estas ventanas con métodos quirúrgicos mecánicos, un método químico de ópticamente claro el cráneo con diferentes soluciones ha sido desarrollado5,6. Sin embargo, puesto que la cirugía piezoeléctrica es un método mecánico de la cirugía, aquí nuestras comparaciones se limitará a otros métodos mecánicos.
Piezoeléctrico de Aparatos quirúrgicos utilizan vibraciones ultrasónicas para romper hueso mineralizado sin dañar los tejidos blandos subyacentes y así ofrecen una aproximación para lograr rápidamente una gran área de hueso. En una pieza de mano quirúrgica piezoeléctrico, la turbina se sustituye por una pila de discos de cerámica y cuando se aplica corriente, los discos vibran a frecuencias ultrasónicas. Las vibraciones se transmiten a través de la pieza de mano para diamante recubiertos consejos para cortar el hueso sin dañar los tejidos blandos, una ventaja sobre taladros rotatorios que no discriminan entre tipos de tejidos. Cirugía piezoeléctrica fue desarrollada originalmente para su uso en humanos por Tomaso Vercellotti y ha conducido a mejoras en dental y cráneo-maxilofacial cirugía7,8,9,10,11 .
Cirugía piezoeléctrica se ha utilizado para crear una osteotomía en ratas Wistar y fue encontrada por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) y la histología para producir significativamente menos daño que un taladro dental tradicional12. Los autores concluyeron que la cirugía piezoeléctrica fue segura para quitar el hueso cerca tejido cerebral suave. Ratones, sin embargo, tienen una dura más delgado que se daña más fácilmente, y ese estudio no preparar windows para la proyección de imagen óptica crónica. La proyección de imagen crónica requiere que no estén dañados los vasos sanguíneos y que no forman coágulos de sangre debajo de la ventana. Daño a la duramadre conduce a la inflamación que causa la ventana para la nube, y activa la microglia y la proliferación de astrocytes reactivos. Aquí hemos optimizado la cirugía piezoeléctrica para ratones crear delgada cráneo y hueso completo windows craneal extracción conveniente para la proyección de imagen de crónica. Comparamos esta técnica quirúrgica de cirugías de ventana craneal con un taladro de alta velocidad.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>modelo Piezosurgery GP tiene la misma configuración</td></tr><tr><td>Punta de piezocirugía plana circular de 4 mm (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>Esta punta era ideal para nuestras ventanas, pero hay muchas otras puntas de diferentes tamaños disponibles.</td></tr><tr><td>Bastidor estereotax</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de ratón</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica para riego.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Facilita el riego y libera la otra mano para proporcionar estabilidad. La irrigación se puede realizar a mano con una jeringa si es necesario.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>importante para detener cualquier sangrado menor al instante.</td></tr><tr><td>C& B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Mucho más resistente que el acrílico dental normal.</td></tr><tr><td>Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica Puralube</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico Prairie Ultima</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td>Núcleo <td></td><td></td><td>vectorial de UPENN</td></tr></tbody></table>

piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Microscopía multifotón ha sido ampliamente adaptado para la proyección de imagen las neuronas en vivo. Proyección de imagen repetida requiere la implantación de una ventana craneal o adelgazamiento repetidas del cráneo. Ventana craneal cirugía generalmente se realiza con un taladro de alta velocidad, y muchos investigadores encuentran difícil para evitar que el taladro los delicados dura y los vasos sanguíneos. Amplia formación y la práctica es necesario quitar el hueso sin daño al tejido subyacente y así ventana craneal cirugía puede ser difícil, consume tiempo y producir daño tisular. Cirugía piezoeléctrica, que se utiliza extensivamente para la cirugía maxilofacial y dental, utiliza vibraciones ultrasónicas para eliminar el hueso sin dañar los tejidos blandos. Hemos desarrollado un método de aplicar cirugía piezoeléctrica para mejorar la cirugía craneal ventana en ratones en preparación para la proyección de imagen multifotón. Comparaciones dentro de nuestro laboratorio de encuentran que el método requiere menos tiempo de cirugía y tiene una menor tasa promedio de complicaciones debido a hemorragia dural que la cirugía de ventana craneal con un taladro.

Antes de proceder con la cirugía piezoeléctrica, quite cualquier residual periostio del cráneo. Una vez que el cráneo es liso y opaco (Figura 1a), el cirujano puede comenzar la cirugía piezoeléctrica. Al retirar el hueso con la punta vibrante del piezoeléctrico, es fundamental regar el cráneo con hielo frío ACSF. Riego adecuado se logra cuando la inferior 1 mm de la punta se sumerge en la ACSF (Figura 1b). Sin la adecuada irrigación, el hueso se sobrecalentar y dañar el cerebro. Después de que el cráneo ha sido adelgazado a la profundidad deseada por el cirujano, puede haber algún sangrado residual de los vasos sanguíneos situados en el hueso. Para rápidamente dejar todo sangrado, aplique un trozo pequeño de 1 mm de espuma de colágeno empapado en ACSF a la zona de la ventana. Deje el colágeno en el cráneo de aproximadamente 30 s (figura 1C). Después de retira la espuma de colágeno, la ventana aparece translúcida, que permite la clara visualización de los vasos sanguíneos en la duramadre. Dura será intacta sin hematomas importantes. (Figura 1 d). Si el dura aparece roja e inflamada, es probable debido a los vasos sanguíneos rotos de demasiada presión sobre la punta durante la cirugía. Para proteger la ventana de nuevo y prepararnos para la proyección de imagen de crónica, se debe colocar un cubreobjetos de cristal sobre el área. Un cubreobjetos de vidrio correctamente aplicada se sentará suavemente encima de la ventana y no causará ningún daño a la zona. Cubreobjetos vidrio debe cubrir la ventana entera. Si el cubreobjetos de vidrio se aplica correctamente en el cráneo, la ventana permanecerá transparente bajo el vidrio. Todos los vasos sanguíneos de la duramadre seguirá siendo visible (Figura 1e). Acrílico dental debe ser aplicado alrededor de lo cubreobjetos de cristal cumplir permanentemente la superficie del cráneo. También deben cubrir los bordes del cubreobjetos vidrio acrílico dental (figura 1f).
Se encontró que la cirugía piezoeléctrica es típicamente mucho más rápida que una tradicional ventana craneal, tomando alrededor de 10-12 minutos por cirugía (figura 2A). También se encontró que hubo menos complicaciones debido a la dura hematomas y sangrado según lo observado por el ojo (figura 2B). Una ventana adecuadamente preparada permitirá la proyección de imagen multifotón de indicadores fluorescentes en neuronas corticales en vivo. Elegimos el indicador rojo calcio JRGECO1a en cuerpos celulares de las neuronas corticales de la capa 4 de la imagen (Figura 3A-3B). Pudimos observar a oscilaciones de calcio en estos cuerpos de la célula a través de la ventana con FASORES.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Figura 1: cirugía piezoeléctrica. (a) el cráneo después de que ha sido adecuadamente preparado para fasor. Se ha eliminado todo el tejido perióstico, dejando una superficie lisa y limpia. (b) una imagen representativa del fasor en progreso. La parte inferior 1 mm de la vibrante punta quirúrgica está sumergido en el hielo frío ACSF. El líquido se aplica en el cráneo a un ritmo de 1 mL/min. Un movimiento circular ligero se aplica en el cráneo y el hueso se adelgaza mediante vibraciones ultrasónicas. (c) después de que el cráneo ha sido adelgazado, una pieza circular de 1 mm de espuma de colágeno empapado en frío que ACSF se permite descansar en la ventana para detener cualquier sangrado micro del hueso. (d) una ventana exitosa con una dura transparente muestra todos los vasos intactos. Hay no hay daños visibles o contusiones en la superficie del cerebro. (e) un cubreobjetos de cristal se coloca sobre la ventana para proteger la superficie del cerebro. acrílico Dental (f) se aplica en el cráneo para fijar permanentemente el cubreobjetos de cristal sobre la ventana. La escala de 1 mm en todas las imágenes de la barra.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Figura 2. Comparación de tasa de éxito en la formación de fasor o dental del taladro cirugía. (A) tiempo promedio por cirugía fue menor para el fasor cirugías taladro dental (p < 0.05, prueba de t de cola dos) n = 30 cirugías por grupo y promedio 10 cirugías por cirujano. (B) el porcentaje de cirugías exitosas (definido como ningún daño visible o sangrado al dura según lo observado por el ojo del cirujano a través del objetivo para zoom X 350) fue superior para el fasor taladro dental cirugía (n = 30 cirugías para cada grupo, una prueba de z de cola). Barras de error indican SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Figura 3. Multifotón imágenes en vivo a través de una ventana craneal adelgaza con FASORES. (A) calcio transitorios observados con el indicador rojo calcio JRGECO1a se reflejada en neuronas piramidales de la capa 4 en corteza motora murinos in vivo. Barra de escala = 100 μm. (B) la misma ventana pero diferentes regiones de la corteza de motor de capa 4. Headfixed mouse con ventana de 3 mm con FASORES. Barra de escala = 30 μm. reflejada con un microscopio multifotón, objetivo 40 X, la longitud de onda de excitación 1040 nm.

Cirugía piezoeléctrica ha conducido a mejoras en cirugía maxilofacial y dental humana. Hemos desarrollado un protocolo para optimizar la cirugía piezoeléctrica para cirugía craneal ventana en ratones.

Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico consiste en adelgazar el cráneo sin dañar el tejido subyacente e implantar una ventana craneal adecuada para la obtención de imágenes. Este método representa una mejora respecto a la cirugía de ventana craneal y podría permitir que un mayor número de cirujanos realicen esta técnica. La principal ventaja de este procedimiento es que permite cirugías más cortas con una tasa promedio más baja de complicaciones.Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que todos los instrumentos que se vayan a utilizar hayan sido autoclavados para garantizar la esterilidad. Anestesie el ratón con isoflurano. Aplique lubricante oftálmico veterinario en los ojos para prevenir el secado.Luego, pellizque el dedo del pie trasero para asegurar la profundidad adecuada de la anestesia. A continuación, elimine el vello del cuero cabelludo mediante la aplicación de gel depilatorio durante tres minutos. Luego, coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáxico sobre una almohadilla calefactora o una manta con recirculación de agua calibrada a 38 grados Celsius.Asegúrese de que la mascarilla que administra anestesia esté colocada correctamente. Administre buprenorfina por vía subcutánea para proporcionar analgesia prequirúrgica. Luego, desinfecte el cuero cabelludo con tres aplicaciones alternadas de clorhexidina o Betadine y etanol al 70 % utilizando un aplicador con punta de algodón.Por último, inyecte 100 microlitros de bupivacaína diluida al 50 % en solución salina bajo el cuero cabelludo para proporcionar anestesia local. Fije una punta circular estéril de cuatro milímetros al mango de la unidad de cirugía piezoeléctrica. El tamaño grande de la punta contribuye a la velocidad de la cirugía, ya que toda la ventana puede adelgazarse simultáneamente.Configure la unidad de cirugía piezoeléctrica para que vibre en la configuración más baja, ya que ajustes más altos podrían romper los vasos sanguíneos debido a vibraciones intensas. Llene una jeringa de 10 mililitros con ACSF helado y sosténgala con la mano que no sostiene la pieza de mano piezoeléctrica. Aplique suavemente la punta quirúrgica vibrante sobre el cráneo con un movimiento circular ligero y adelgace el hueso hasta la profundidad deseada para realizar una preparación de cráneo delgado.Irrigue el cráneo para evitar el sobrecalentamiento debido a las vibraciones de alta frecuencia, goteando el ACSF desde la jeringa sobre el cráneo a una velocidad de un mililitro por minuto. Ajuste suavemente el ángulo de la pieza de mano y cambie el ángulo de la punta mientras aplica presión sobre el cráneo para adelgazarlo de manera uniforme. Tenga cuidado de no adelgazar demasiado una sección de la ventana.Asegúrese de ajustar suavemente el ángulo de la pieza de mano para adelgazar el cráneo de manera uniforme. Revise el cráneo regularmente para evitar eliminar demasiado hueso y dañar el tejido subyacente. Coloque un trozo de un milímetro de espuma de colágeno hemostático empapado en ACSF frío sobre la duramadre expuesta.Deje que actúe sobre la dura durante aproximadamente 30 segundos para evitar que se desarrollen microhemorragias. Después de colocar lateralmente un cubreobjetos de vidrio de cuatro milímetros sobre la ventana delgada, use la parte trasera de un aplicador pequeño de punta de algodón de plástico o madera para aplicar aproximadamente una gota de pegamento de cianoacrilato en la esquina de la ventana. Y utilice las puntas de la pinza para asegurarse de que el cubreobjetos forme un sello con el cráneo.Finalmente, agregue 100 microlitros de acrílico dental sobre el cráneo para mantener la ventana en su lugar. Mientras el acrílico dental aún esté blando, utilice la punta de un aplicador de madera roto para retirar cualquier acrílico dental que obstruya la ventana de imagen. Una vez finalizado, retire al ratón del aparato quirúrgico y colóquelo en una jaula calentada para su recuperación.Monitoree continuamente hasta que el ratón haya recuperado plenamente la conciencia, evaluada mediante movilidad, marcha y comportamiento normales. Evalúe a los animales dos veces al día durante tres días en busca de manifestaciones de dolor posquirúrgico, incluyendo disminución de la actividad, aseo, consumo de alimento y agua, comportamiento de protección o aumento de la agresividad. Administre buprenorfina por vía subcutánea como analgésico entre ocho y 12 horas después de la cirugía durante tres días, según lo aprobado en nuestro protocolo del IACUC.Monitoree el área de la ventana en busca de dehiscencia, inflamación y signos de infección. Se obtuvieron imágenes de las transitoriedades de calcio observadas con el indicador rojo de calcio jRGECO1a en neuronas puras de la capa cuatro del cortex motor de un ratón con la cabeza fija, utilizando una ventana de tres milímetros preparada con PHASOR. Esta imagen se tomó a través de la misma ventana, pero muestra una región diferente de la capa cuatro del cortex motor.Como se observa aquí, el tiempo por cirugía fue menor con PHASOR en comparación con las cirugías con fresa dental, con una significancia estadística indicada como P < 0,05 mediante una prueba T de dos colas. El porcentaje de cirugías exitosas, definidas como ausencia de sangrado o daño visible a la dura, fue mayor con PHASOR que con las cirugías con fresa dental, según evaluación mediante una prueba Z de una cola. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 10 minutos si se lleva a cabo correctamente.Tras seguir este procedimiento, se puede realizar una variedad de métodos de imagen in vivo, incluida la imagen de multiphotones, para visualizar neuronas in vivo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

piezo-high-accuracy-surgical-osteal-removal-phasor-technique-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En ángulo recto microprismas insertado en la corteza cerebral del ratón permite obtener imágenes profundas de múltiples capas corticales con un punto de vista típicamente se encuentran en el segmento. De un milímetro microprismas ofrecen un campo de visión amplio (~ 900 m) y resolución espacial suficiente para resolver las espinas dendríticas. Demostramos capa de imagen V neuronal y vascular mediante imágenes neocortical microprismas.

Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

En este video, describimos el procedimiento quirúrgico para crear una ventana de calvario para acceder al cerebro de un modelo de ratón.

Generación de ventanas en el calvario en un modelo de ratón: un procedimiento quirúrgico para crear una ventana en la parte superior del cráneo del ratón

Este video presenta un procedimiento quirúrgico para implantar una ventana craneal en un modelo de ratón para un acceso óptico estable a diferentes regiones del cerebro.

Implantación de una ventana de imagen craneal en un modelo de ratón: un procedimiento quirúrgico para implantar cubreobjetos a base de vidrio para un acceso óptico estable a regiones del cerebro murino

Este video muestra el registro de la actividad neuronal del cerebro a través de una ventana óptica en ratones transgénicos. Los ratones expresan una proteína fluorescente que permite la detección de actividades neuronales. Se extrae cuidadosamente una pequeña porción del cráneo para instalar una ventana óptica, y luego se cubre el cráneo con cemento negro para bloquear la luz antes de la obtención de imágenes.

Instalación de ventanas ópticas en el cerebro de ratones transgénicos para visualizar actividades neuronales

Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón...

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Dos fotones de imágenes, acoplado a nanodissection láser, son herramientas útiles para el estudio de los procesos degenerativos y regenerativos en el sistema nervioso central con resolución subcelular. Este protocolo muestra cómo etiquetar, imagen y diseccionar las fibras individuales de escalada en la corteza cerebelosa in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Las ventanas craneales se han convertido en una técnica quirúrgica implementada ubicuamente para permitir imágenes intravitales en ratones transgénicos. Este protocolo describe el uso de un robot quirúrgico que realiza perforaciones óseas semiautomáticas de ventanas craneales y puede ayudar a reducir la variabilidad de cirujano a cirujano y mitigar parcialmente el daño de la barrera térmica hematoencefálica.

Evaluación del daño térmico de la craneotomía perforada por robot para la cirugía de ventana craneal en ratones

Este protocolo presenta un método completo y eficiente para analizar la reparación del hueso mandibular. Describimos una técnica reproducible para la fractura mandibular no estabilizada en un modelo de ratón, que permite analizar el proceso de reparación ósea endocondral con un mínimo daño tisular y pérdida ósea.

Técnica menos invasiva para la fractura mandibular no estabilizada en modelos murinos

Este estudio presenta un método escalable, confiable y reproducible para registros corticales crónicos repetidos en un modelo porcino. El método tiene aplicaciones en varios campos de la neurociencia, incluida la investigación del dolor y el diagnóstico de enfermedades neurológicas.

Técnica de ventana craneal crónica para registros corticales repetidos durante la anestesia en cerdos

Este protocolo describe un método quirúrgico en dos fases para crear una ventana craneal grande, resellable y que salve la duramadre en ratones. Esta técnica permite registros electrofisiológicos crónicos y multimodales de redes profundas del cerebro distribuido, como la Red de Modos Predeterminados, durante varias semanas.

Protocolo quirúrgico para una ventana craneal grande y resellable que permite grabaciones electrofisiológicas longitudinales y multimodales de la red de modo predeterminado del ratón

Aprende la técnica PHASOR de cirugía craneal piezoeléctrica en ratones para reducir el tiempo quirúrgico y mejorar la imagen in vivo de la actividad neuronal. Este método optimiza la preparación de ventanas craneales con mayor precisión y seguridad.

Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones (Video) | JoVE Journal

Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones

Explorar más videos