Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia

Un problema común en la microscopía de inmunofluorescencia es la presencia de fluorescencia de fondo endógena que puede interferir con su señal. En muchos casos, esta autofluorescencia puede hacer que sus resultados sean ininterpretables. En este protocolo demostraremos cómo eliminar la autofluorescencia de muestras de tejido cerebral humano utilizando fotoblanqueo con una lámpara de escritorio LED comercial.

Las principales ventajas de estos métodos son el importante ahorro de costes respecto a las técnicas actuales sin sacrificar la eficacia y que no se introducen compuestos exógenos en la muestra. Antes de comenzar, prepare soluciones madre de solución salina tamponada con una sola vez, TBS y azida de sodio al 10%. Por cada tres portaobjetos de microscopio de tamaño estándar que desee procesar, necesitará una sola placa de Petri cuadrada de 100 milímetros por 100 milímetros como cámara de portaobjetos.

Para cada cámara de portaobjetos, prepare 50 mililitros de 05%azida en TBS añadiendo 25 mililitros de azida de sodio al 10% a 50 mililitros de una vez TBS. Cree un andamio para elevar la cámara de portaobjetos de modo que pueda caber una cabeza de lámpara debajo. Para una placa de Petri cuadrada de 100 milímetros, se puede cortar a la forma de un recipiente de plástico para alimentos de tamaño similar.

Se puede utilizar cualquier cosa que pueda elevar de forma segura la cámara del portaobjetos sin impedir que la luz llegue a las muestras. Adquiera una lámpara de escritorio LED de fósforo blanco y retire los difusores o el plástico opaco que cubra la fuente de luz. Oriente la matriz de LED hacia arriba.

Para ello, se recomienda una lámpara con cuello flexible. Construya una cubierta de cúpula reflectante para el aparato iluminando el interior de una caja lo suficientemente grande como para cubrir las cámaras de deslizamiento y el andamio con papel de aluminio. Para una sola cámara, se puede utilizar una caja de puntas de pipeta de un milímetro.

Para este video, el tejido cerebral de los giros frontales orbitales FTLD-T humano fijado en formol se sometió al pretratamiento de fotoblanqueo. Los procedimientos de preparación de tejido y tinción de aminoácidos pueden variar según la fuente, la fijación y la inclusión de las secciones de tejido. En una cámara frigorífica, un armario frío o un refrigerador de cuatro grados centígrados, coloque la lámpara debajo del andamio y la cámara de muestras encima del andamio.

Llene la cámara de muestras con 50 mililitros de azida TBS. Sumerja secciones de tejido de 10 micrómetros de espesor montadas en portaobjetos de microscopio de vidrio estándar en la cámara de muestras utilizando pinzas limpias. Cubra el aparato con la cúpula reflectante y encienda la lámpara LED.

Deje que las muestras se fotoblanqueen durante 48 horas. Este tiempo de incubación puede variar, dependiendo de la intensidad de la lámpara y la cantidad de material autofluorescente en el tejido. Después del fotoblanqueo previo, los portaobjetos se pueden inmunoteñir con un protocolo estándar para su tejido y proteínas específicos de interés.

Con fines de demostración, el tejido cerebral FTLD-T se tiñó para tau fosforilado utilizando anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 y Texas Red. El DAPI se utilizó como contratinción nuclear. Prepare 500 mililitros de tampón de recuperación de antígenos, 500 mililitros de Triton X-100 al 0,025% en TBS, 10 mililitros de albúmina sérica bovina al 1%, BSA, en TBS, y dos mililitros de solución bloqueante, que consiste en suero de cabra agregado a BSA TBS.

Realice la recuperación de antígenos sumergiendo los portaobjetos fotoblanqueados en el tampón de recuperación de antígenos en un colector de portaobjetos. Calienta el colector a 90 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez que se ha retirado el colector del tratamiento térmico, es importante dejar que la cámara se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Quitar los portaobjetos inmediatamente hará que las secciones se sequen. Prepare su mezcla primaria de anticuerpos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En este caso, el anticuerpo antifosfo PHF tau p-serina 202 más treonina 205 AT8 se diluyó uno de cada 100 con BSA TBS y se dejó en hielo.

Se requieren 150 microlitros de mezcla de anticuerpos por sección. Después de que las secciones se hayan enfriado durante 30 minutos, transfiera los portaobjetos del colector de recuperación de antígenos a un frasco de tinción lleno de TBS Triton. Lave los portaobjetos en esta solución durante cinco minutos agitándolos suavemente.

Vacíe y reemplace el TBS Triton para repetir este paso de lavado por segunda vez. Después del lavado, retire los portaobjetos del frasco de tinción y absorba el exceso de tampón. Con un bolígrafo hidrofóbico, dibuja un contorno alrededor del tejido.

Esto evitará que sus soluciones se salgan de la corredera. Tenga cuidado de no dejar que los toboganes se sequen. Bloquee el tejido pipeteando 200 microlitros de solución de bloqueo en los portaobjetos y colóquelos dentro de una cámara humidificada.

Esta cámara puede ser algo tan simple como una rejilla deslizante dentro de la caja de puntas de pipeta que contiene una toalla de papel húmeda. Asegúrese de que toda la muestra de tejido esté cubierta con una solución de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante dos horas.

Retire la solución obstruida mediante aspirador o pipeta. Pipetee de 100 a 150 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios en los portaobjetos. Asegúrese de que toda la muestra esté cubierta con una solución de anticuerpos y de que las secciones se mantengan en una superficie nivelada para evitar la acumulación desigual de anticuerpos.

Incubar con anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche en una cámara humidificada. Al día siguiente, prepare la mezcla secundaria de anticuerpos. En este caso, Alexa 488 y Texas Red antiratón para cabras se diluyeron uno de cada 100 usando BSA TBS.

Recupere las secciones de tejido y extraiga la solución de anticuerpos primarios mediante aspirador o pipeta. Lave los portaobjetos dos veces de manera similar a como lo hizo anteriormente con un frasco de tinte lleno de TBS Triton durante cinco minutos en cada lavado. Después del lavado, absorba el exceso de tampón.

Pipetear de 100 a 150 microlitros de solución de anticuerpos secundarios, asegurándose una vez más de que la muestra de tejido esté completamente cubierta. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente en la cámara humidificada en la oscuridad. Prepare 0,1 microgramos por mililitro de contratinción DAPI en TBS de acuerdo con las recomendaciones del fabricante o dilución en serie.

Asegúrese de mezclar bien la solución madre de DAPI debido a la posible insolubilidad. Recupere los portaobjetos y retire la mezcla de anticuerpos secundarios. Lave las muestras dos veces, pero en lugar de usar TBS Triton, use TBS simple.

Aspire o pipetee la solución de lavado restante y pipetee de 100 a 150 microlitros de tinción de DAPI en las secciones de tejido. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Recupere las muestras y lávelas tres veces con TBS simple en lugar de dos.

Después del lavado, retire con cuidado la solución de lavado restante. Aplique el medio de montaje. Complete el montaje de la corredera cubriendo las muestras con cubreobjetos de vidrio.

Evite las burbujas colocando un borde de la cubierta hacia abajo y bajando muy lentamente el borde opuesto con pinzas. Deje que el material de montaje se seque antes de almacenarlo a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Las diapositivas ya están listas para ser visualizadas.

Los ajustes de la microscopía de fluorescencia variarán en función de los fluoróforos utilizados para la tinción y del microscopio. Encienda la lámpara de fluorescencia, el microscopio y la computadora, y deje que la lámpara se caliente durante 15 minutos. Coloque los portaobjetos de tejido teñidos en el microscopio de fluorescencia.

Utilice el campo brillante para localizar el tejido con un aumento de 10 veces. Una vez que se haya localizado una región adecuada de tejido, agregue una gota de agua sobre el cubreobjetos de la muestra. Cambie a una lente de inmersión en agua 20 veces.

Seleccione las longitudes de onda de excitación y emisión del láser apropiadas para cada fluoróforo en pistas separadas para obtener la mejor señal. Más detalles de los ajustes y longitudes de onda utilizados se pueden encontrar en el manuscrito adjunto. Ajuste la potencia del láser y la configuración de ganancia para optimizar la intensidad de la señal para cada pista.

Una vez que se encuentren los ajustes y el campo de visión adecuados, guarde una imagen compuesta que contenga los datos de fluorescencia de cada pista. Para visualizar la intensidad de fluorescencia en cada canal, instale la macro RGB Profile Tools para ImageJ. Abra el archivo de imagen confocal lsm en ImageJ y convierta las imágenes compuestas de las tres pilas a RGB yendo a la herramienta Imagen, Color, Canal.

Seleccione Compuesto y marque los tres canales. A continuación, vaya a Imagen, Tipo y color RGB. Seleccione el icono Herramientas de perfil RGB y dibuje una línea a través de la sección de la imagen que se va a perfilar.

En este vídeo se han descrito los pasos para realizar un pretratamiento de fotoblanqueo de muestras de tejido para producir fluorescencia de fondo. Este procedimiento se puede agregar a cualquier protocolo estándar de aminofluorescencia antes de la recuperación de antígenos y la tinción de aminoácidos. El aparato utilizado para el fotoblanqueo es económico y fácil de obtener, consta de componentes listos para usar.

Los LED de fósforo blanco emiten luz en un amplio espectro de longitudes de onda, lo que los hace muy adecuados para el fotoblanqueo de amplio rango. Utilizando una lámpara de escritorio LED fácilmente disponible, las muestras de tejido cerebral FTLD-T humano sin teñir se fotoblanquearon y se obtuvieron imágenes utilizando las longitudes de onda que serían apropiadas si estas muestras se tiñeran con Texas Red y Alexa 488. Las muestras no tratadas mostraron grandes cantidades de autofluorescencia.

Por el contrario, el fotoblanqueo dio lugar a una reducción significativa de la intensidad de las manchas de autofluorescencia que se asemejaban a la lipofuscina, así como a una fluorescencia de fondo general. Para una mayor validación de esta técnica, se tiñeron muestras de tejido cerebral FTLD-T para tau hiperfosforilado, una proteína que se pliega mal y se acumula en esta enfermedad como cuerpos de inclusión distintos. Se aplicaron dos anticuerpos secundarios diferentes para distinguir mejor entre el marcaje con tau y la fluorescencia inespecífica.

En estas imágenes compuestas, la colocalización de Alexa 488 y Texas Red se muestra en amarillo, lo que representa la proteína tau correctamente teñida. La aparición de regiones rojas o verdes indica fluorescencia inespecífica o extinción de uno de los cromóforos. En la muestra de control no tratada, se puede ver una señal de fondo significativa y no específica, particularmente en el canal rojo de Texas.

Tanto el pretratamiento del fotoblanqueo como la aplicación de un extintor químico dan como resultado una señal de fondo muy reducida. Si dividimos los canales de fluorescencia y observamos las imágenes con mayor aumento, se pueden hacer observaciones más detalladas. El control no tratado posee fluorescencia de fondo en todos los canales, así como características no específicas, principalmente en el canal rojo de Texas, que tienen una intensidad similar al marcaje específico de tau.

Si los cuerpos de inclusión de tau no tuvieran una morfología distinta y predecible, estos resultados de Texas Red podrían haber sido malinterpretados debido a la presencia de estas características autofluorescentes. El pretratamiento de fotoblanqueo suprime por completo estas características no específicas de Texas Red, al tiempo que conserva la mayoría de las señales específicas de tau Texas Red y Alexa 488. El fotoblanqueo, sin embargo, parece tener poco efecto sobre la fluorescencia de fondo DAPI.

El extintor químico redujo la fluorescencia de fondo en el canal Alexa 488 con la misma eficacia que el fotoblanqueo. Sin embargo, también redujo las intensidades de fluorescencia tanto de DAPI como de Texas Red, lo que sugiere la presencia de algún enfriamiento contraproducente. La cuantificación de estos efectos se puede ver en los perfiles de señal.

Como puede ver, este método produce imágenes limpias y libres de características confusas. Este pretratamiento de fotoblanqueo se puede incorporar a cualquier protocolo estándar de aminofluorescencia para eliminar la autofluorescencia y generar resultados inequívocos y de alta calidad.