Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia

Un problema común en la microscopía de inmunofluorescencia es la presencia de fluorescencia de fondo endógena que puede interferir con su señal. En muchos casos, esta autofluorescencia puede hacer que sus resultados sean ininteligibles. En este protocolo, demostraremos cómo eliminar la autofluorescencia de muestras de tejido cerebral humano utilizando fotoblanqueo con una lámpara de escritorio LED comercial.

Las principales ventajas de este método son los ahorros significativos de costos en comparación con las técnicas actuales sin sacrificar la eficacia, y que no se introducen compuestos exógenos en la muestra. Antes de comenzar, prepare soluciones stock de solución salina tamponada con tris una vez (TBS) y azida sódica al 10%. Por cada tres portaobjetos de tamaño estándar que desee procesar, necesitará un solo recipiente de Petri cuadrado de 100 milímetros por 100 milímetros como cámara para portaobjetos.

Para cada cámara de portaobjetos, prepare 50 mililitros de azida al 0,5% en TBS añadiendo 25 mililitros de azida sódica al 10% a 50 mililitros de TBS 1x. Cree un soporte para elevar su cámara de portaobjetos de manera que pueda colocarse debajo una cabeza de lámpara. Para una placa de Petri cuadrada de 100 milímetros, se puede cortar un recipiente de plástico para alimentos de tamaño similar a la forma deseada.

Cualquier cosa que pueda elevar de forma segura la cámara de la preparación sin obstaculizar la luz que llega a las muestras puede utilizarse. Adquiera una lámpara de escritorio con LED de fósforo blanco y retire cualquier difusor o plástico opaco que cubra la fuente de luz. Oriente la matriz de LED hacia arriba.

Para este fin, se recomienda una lámpara con un cuello flexible. Construya una cubierta reflectante en forma de domo para el aparato iluminando el interior de una caja lo suficientemente grande como para cubrir las cámaras para portaobjetos y el andamio con papel de aluminio. Para una sola cámara, se puede utilizar una caja para puntas de pipeta de un milímetro.

Para este video, el tejido cerebral de giros frontales orbitales humanos con FTLD-T fijado en formalina fue sometido al pretratamiento de fotoblanqueo. La preparación del tejido y los procedimientos de tinción amino pueden variar según la fuente, fijación e inclusión de sus secciones de tejido. En una cámara fría a cuatro grados Celsius, gabinete refrigerado o refrigerador, coloque la lámpara debajo del soporte y la cámara de muestra encima del soporte.

Llene la cámara de muestra con 50 mililitros de TBS con azida. Sumerja secciones de tejido de 10 micrómetros de espesor montadas sobre portaobjetos de vidrio estándar en la cámara de muestra utilizando pinzas limpias. Cubra el aparato con la cúpula reflectante y encienda la lámpara LED.

Deje que las muestras se fotodesvanezcan durante 48 horas. Este tiempo de incubación puede variar según la intensidad de la lámpara y la cantidad de material autofluorescente en el tejido. Después del pretratamiento de fotodesvanecimiento, las muestras pueden teñirse mediante inmunomarcado utilizando un protocolo estándar para su tejido y proteínas de interés específicos.

Con fines de demostración, se tiñó tejido cerebral de FTLD-T para la proteína tau fosforilada utilizando anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 y Texas Red. Se utilizó DAPI como contratiñido nuclear. Prepare 500 mililitros de tampón de recuperación de antígenos, 500 mililitros de Triton X-100 al 0,025 % en TBS, 10 mililitros de albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % en TBS y dos mililitros de solución bloqueante, compuesta por suero de cabra agregado al TBS con BSA.

Realice la recuperación del antígeno sumergiendo las laminillas fotoblanqueadas en tampón de recuperación de antígenos dentro de un recipiente para portaobjetos. Caliente el recipiente a 90 grados Celsius durante 30 minutos. Una vez que el recipiente se haya retirado del tratamiento térmico, es importante permitir que la cámara se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Retirar inmediatamente las laminillas hará que los cortes se sequen. Prepare la mezcla del anticuerpo primario según las recomendaciones del fabricante. En este caso, el anticuerpo anti-PHF tau fosforilado p-serina 202 más treonina 205 AT8 se diluyó uno en 100 con BSA TBS y se dejó sobre hielo.

Se requieren 150 microlitros de mezcla de anticuerpos por sección. Después de que las secciones hayan enfriado durante 30 minutos, transfiera los portaobjetos desde el recolector de recuperación de antígenos a un frasco de tinción lleno con TBS Triton. Lave los portaobjetos en esta solución durante cinco minutos con agitación suave.

Vacíe y reemplace el Tritón TBS para repetir este paso de lavado una segunda vez. Después del lavado, retire los portaobjetos del frasco de tinción y elimine cualquier exceso de tampón con una punta de papel absorbente. Utilizando un lápiz hidrofóbico, dibuje un contorno alrededor del tejido.

Esto evitará que las soluciones se salgan de la laminilla. Tenga cuidado para no dejar que las laminillas se sequen. Bloquee el tejido pipeteando 200 microlitros de solución bloqueadora sobre las laminillas y colóquelas dentro de una cámara humedecida.

Esta cámara puede ser algo tan sencillo como un portadiapositivas dentro de una caja de puntas de pipeta que contenga una toalla de papel húmeda. Asegúrese de que toda la muestra de tejido esté cubierta con la solución de bloqueo. Incube a temperatura ambiente durante dos horas.

Elimine la solución bloqueante mediante aspiración o pipeta. Añada 100 a 150 microlitros de la mezcla de anticuerpo primario sobre los portaobjetos. Asegúrese de que toda la muestra quede cubierta con la solución de anticuerpo y de que las secciones se mantengan sobre una superficie nivelada para evitar acumulaciones desiguales de anticuerpo.

Incubar con el anticuerpo primario a cuatro grados Celsius durante la noche en una cámara humidificada. Al día siguiente, preparar la mezcla de anticuerpo secundario. En este caso, se diluyeron anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa 488 y anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Texas Red uno en 100 utilizando BSA TBS.

Recupere las secciones de tejido y elimine la solución de anticuerpo primario mediante aspiración o pipeta. Lave las laminillas dos veces de manera similar a la anterior, utilizando un frasco de tinción lleno con TBS Triton durante cinco minutos por cada lavado. Después del lavado, retire cualquier tampón en exceso con papel absorbente.

Pipetee de 100 a 150 microlitros de solución de anticuerpo secundario, asegurándose nuevamente de que la muestra de tejido quede completamente cubierta. Incube durante dos horas a temperatura ambiente en una cámara humedecida y en la oscuridad. Prepare una contratiñición de DAPI de 0,1 microgramo por mililitro en TBS según las recomendaciones del fabricante o mediante dilución seriada.

Asegúrese de mezclar completamente la solución stock de DAPI debido a la posible insolubilidad. Recupere los portaobjetos y elimine la mezcla del anticuerpo secundario. Lave las muestras dos veces, pero en lugar de usar TBS Triton, utilice TBS simple.

Aspire o pipete el resto de la solución de lavado y añada 100 a 150 microlitros de tinción con DAPI sobre sus secciones de tejido. Incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Recupere las muestras y lávelas tres veces con TBS simple en lugar de dos.

Después del lavado, retire cuidadosamente la solución restante de lavado. Aplique el medio de montaje. Finalice el montaje de la preparación cubriendo las muestras con láminas de cubierta de vidrio.

Evite las burbujas colocando un borde del cubreobjetos hacia abajo y bajando muy lentamente el borde opuesto usando pinzas. Permita que el medio de montaje se seque antes de almacenar a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Los portaobjetos ya están listos para ser visualizados.

La configuración para la microscopía de fluorescencia variará según los fluorocromos utilizados para la tinción y el microscopio. Encienda la lámpara de fluorescencia, el microscopio y la computadora, y permita que la lámpara se caliente durante 15 minutos. Coloque las laminillas de tejido teñidas en el microscopio de fluorescencia.

Utilice el campo brillante para localizar el tejido a 10 aumentos. Una vez localizada una región adecuada del tejido, agregue una gota de agua encima del cubreobjetos de la muestra. Cambie a una lente de inmersión en agua de 20 aumentos.

Seleccione longitudes de onda de excitación y emisión láser adecuadas para cada fluoróforo en canales separados para obtener la mejor señal. Se pueden encontrar más detalles sobre los ajustes y longitudes de onda utilizados en el manuscrito adjunto. Ajuste la potencia del láser y los valores de ganancia para optimizar la intensidad de la señal en cada canal.

Una vez encontradas las configuraciones adecuadas y el campo de visión, guarde una imagen compuesta que contenga los datos de fluorescencia de cada pista. Para la visualización de la intensidad de fluorescencia en cada canal, instale la macro RGB Profile Tools para ImageJ. Abra el archivo de imagen confocal lsm en ImageJ y convierta las imágenes compuestas de las tres pilas a RGB yendo a Imagen, Color, Herramienta de canales.

Seleccione Compuesto y marque los tres canales. A continuación, vaya a Imagen, Tipo y Color RGB. Seleccione el icono de Herramientas de perfil RGB y trace una línea a través de la sección de la imagen que se va a perfilar.

En este video, se han descrito los pasos para realizar un pretratamiento de fotoblanqueo de muestras de tejido con el fin de producir fluorescencia de fondo. Este procedimiento puede añadirse a cualquier protocolo estándar de fluorescencia amino previamente a la recuperación del antígeno y a la tinción amino. El aparato utilizado para el fotoblanqueo es económico y fácil de obtener, y consta de componentes disponibles comercialmente.

Los LED con fósforo blanco emiten luz a través de un amplio espectro de longitudes de onda, lo que los hace altamente adecuados para el blanqueo fotónico de amplio rango. Utilizando una lámpara LED de escritorio fácilmente disponible, se realizó el blanqueo fotónico e imagen de muestras de tejido cerebral humano con DTLP-T sin teñir, empleando las longitudes de onda que serían apropiadas si estas muestras estuvieran teñidas con Texas Red y Alexa 488. Las muestras no tratadas mostraron grandes cantidades de autofluorescencia.

En contraste, el fotoblanqueo provocó una reducción significativa en la intensidad de los puntos de autofluorescencia que se asemejaban a la lipofuscina, así como de la fluorescencia de fondo general. Para una mayor validación de esta técnica, se colorearon muestras de tejido cerebral de FTLD-T para la proteína tau hiperfosforilada, una proteína que se pliega incorrectamente y se acumula en esta enfermedad en forma de cuerpos de inclusión distintos. Se aplicaron dos anticuerpos secundarios diferentes para distinguir mejor entre la marcación de tau y la fluorescencia no específica.

En estas imágenes compuestas, la colocalización de Alexa 488 y Texas Red se muestra en amarillo, lo que representa la proteína tau teñida correctamente. La aparición de regiones rojas o verdes indica fluorescencia no específica o apagado de uno de los cromóforos. En la muestra control no tratada, se puede observar una señal de fondo y una señal no específica significativas, particularmente en el canal de Texas Red.

Tanto el pretratamiento con fotoblanqueo como la aplicación de un agente quenchador químico resultan en una señal de fondo altamente reducida. Si dividimos los canales de fluorescencia y observamos las imágenes con mayor magnificación, se pueden realizar observaciones más detalladas. El control sin tratar presenta fluorescencia de fondo en todos los canales, así como características no específicas, principalmente en el canal Texas Red, que tienen una intensidad similar a la marcación específica de tau.

Si los cuerpos de inclusión de tau no tuvieran una morfología definida y predecible, estos resultados de Texas Red podrían haberse interpretado erróneamente debido a la presencia de estas características autofluorescentes. El tratamiento previo con fotoblanqueo elimina por completo estas características no específicas de Texas Red, al tiempo que conserva la mayor parte de las señales específicas de tau en Texas Red y Alexa 488. Sin embargo, el fotoblanqueo parece tener poco efecto sobre la fluorescencia de fondo de DAPI.

El agente químico de apagado redujo la fluorescencia de fondo en el canal Alexa 488 tan eficazmente como el fotoblanqueo. Sin embargo, también redujo las intensidades de fluorescencia de DAPI y Texas Red, lo que sugiere la presencia de un apagado contraproducente. La cuantificación de estos efectos puede observarse en los perfiles de señal.

Como puede observarse, este método produce imágenes nítidas, libres de características confusas. Este pretratamiento con fotoblanqueo puede incorporarse en cualquier protocolo estándar de fluorescencia amino para eliminar la autofluorescencia y generar resultados de alta calidad y sin ambigüedades.