Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

El objetivo general de este procedimiento experimental es esbozar un enfoque fundamental en una metodología detallada para medir la heterogeneidad genética en el sitio objetivo de una manera confiable y robusta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la edición de genes, como por ejemplo, cómo se puede analizar y medir la mutagénesis in situ. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una metodología estandarizada para la reparación dirigida por homología o la corrección génica utilizando oligonucleótidos monocatenarios.

Para comenzar el protocolo, cultive células HTT11619 en 25 mililitros de medio previamente preparado para el cultivo de células HTT116 en un matraz T-175. Aspirar el medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato o PBS de dulbecco, sin calcio ni magnesio, y luego aspirar el PBS. A continuación, añada tripsina gota a gota al matraz T-175, utilizando una pipeta de cinco mililitros.

Permita que las células se desprendan en una incubadora. Golpee el matraz para desalojar las células y luego enfríe las células con los ocho mililitros de medio completo en toda la superficie del matraz. A continuación, pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper los grupos de células y transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros.

Antes de girar las células, tome 10 microlitros del tubo cónico de 15 mililitros y combínelo con 10 microlitros de azul de tripán para contar las células, luego granule las células. Transfiera 10 microlitros de las células mezcladas con azul de tripán al hemocitómetro y cuente las cuatro rejillas alrededor del exterior. Por cada placa de 10 centímetros de células a sincronizar, agregue cinco mililitros de medio completo y seis micromolares de afidiolina.

A continuación, transfiera 100 microlitros del pellet de celda resuspendida a cada placa de centímetros y agite la placa suavemente para mezclar. Incubar las placas para sincronizar las células en el borde G1S. Cuatro horas antes de la orientación, aspire el medio, lave con PBS.

Aspire el PBS y agregue cinco mililitros de medio completo. Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante cuatro horas. Introduzca la secuencia del gen EGFP mutante en el generador en línea de Zane Labs y elija las secuencias guía de CRISPR que se unan muy cerca del sitio objetivo.

Mezcle el ARN en concentraciones molares iguales a 45 micromolares. Añada 6,75 microlitros de un stock de 200 micromolares de ARN CR y 6,75 microlitros de un stock de 200 micromolares de ARN trazador a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, añade 16,50 microlitros de tampón IDT para hacer un volumen final de 30 microlitros.

A continuación, calienta la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos, en una máquina de PCR. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. Para cada muestra, diluya 2,22 microlitros de ARN CR en complejo de ARN trazador y 2,78 microlitros de tampón IDT hasta un volumen final de cinco microlitros.

Diluir 1,67 microlitros de proteína Cas9 de un caldo de 60 micromolares en 3,33 microlitros de medio de suero bajo, hasta un volumen final de cinco microlitros. Mezcla cinco microlitros de proteína Cas9 con cinco microlitros de ARN complejo. Aspirar el medio, lavar con cinco mililitros de PBS.

Aspire el PBS y agregue un mililitro de tripsina precalentada a cada placa de 10 centímetros. Coloque las placas en la incubadora. A continuación, toque la placa de 10 centímetros para asegurarse de que todas las células se desprendan y luego apague con cuatro mililitros de medio completo, dispersándolo por toda la superficie de la placa.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper los grupos de células y transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Reserva 10 microlitros del tubo cónico de 15 mililitros y combínalo con 10 microlitros de azul de tripán para contar las células. Granule las células girando durante cinco minutos a 125 x G a temperatura ambiente.

Aspirar el medio y lavar con cinco mililitros de PBS. Pelar las células girando 125 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transfiera 100 microlitros de la suspensión de la celda a cada cubeta de separación de cuatro milímetros de electroporación.

Agregue 10 microlitros del complejo RNP a 100 microlitros de células, con una densidad de 5 x 10 a la quinta celda. Agregue dos ODN micromolares a cada muestra. A continuación, lleve la rejilla a una máquina de electroporación.

Golpee ligeramente cada una de las muestras y colóquelas en la cámara. Vuelva a colocar la rejilla en la campana y transfiera cada muestra a un pocillo que contenga dos mililitros de medio completo en una placa de seis pocillos. Incube la placa antes de verificar los niveles de corrección.

Aspirar el medio y lavar las células con dos mililitros de PBS. Reemplace el PBS con 500 microlitros de tripsina precalentada en cada pocillo de la placa de seis pocillos. Coloque las placas en la incubadora.

A continuación, golpee la placa para asegurarse de que todas las células se desalojen y luego apague con un mililitro de medio completo dispersándolo por toda la superficie del pocillo. Pase las celdas a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y pellet. Después de peletizar las células, aspire el medio, luego vuelva a suspender el pellet de celdas en 500 microlitros de tampón FACS.

Electroporar las células HTT11619 sincronizadas y liberadas a una concentración de 5 x 10 a la quinta célula por 100 microlitros, con el complejo RNP a 100 picomoles y 100 picomoles de 72 NTODN a 2,0 micromolares. Transfiera las células a una placa de seis pocillos y permita que se recuperen durante 72 horas. A continuación, clasifique las celdas individualmente en placas de 96 pocillos, utilizando un clasificador fac con un láser de 488 nanómetros para EGFP más menos.

De los pozos que tienen crecimiento, aísle el ADNg celular utilizando un kit de aislamiento de ADN disponible comercialmente. Amplifique las regiones que rodean la base objetivo a través de PCR. Por último, realice el análisis de secuenciación de ADN en las muestras.

72 horas después de la incubación, el análisis de citometría de flujo, confirma la reparación funcional de la proteína verde fluorescente. Se observó una respuesta gradual a la dosis a medida que aumentaban los niveles coordinados de RNP y 72NT. Una reacción de edición génica en ausencia de la partícula RNP, corrigió aproximadamente el 1% de las células objetivo cuando se utiliza una concentración 10 veces mayor del oligonucleótido 72NT en la reacción de edición génica de agente único.

Se seleccionaron 16 clones de las muestras positivas para EGFP y se analizó la integridad genética que rodeaba el sitio objetivo mediante un secuenciador de ADN. Las 16 células positivas para EGFP contenían el intercambio de nucleótidos predicho en el sitio objetivo. Se analizaron 15 aislados clonales no verdes para determinar la heterogeneidad en el sitio objetivo.

No se observó intercambio de bases de ADN en aproximadamente la mitad de las muestras. El resto de las expansiones clonales examinadas mostraron una población heterogénea de mutaciones de deleción. El tamaño de la deleción osciló entre una base y 19 bases.

CRISPR, Cas9 y moléculas de ADN donante de oligonucleótidos monocatenarios trabajando en tándem pueden conducir a la reparación precisa de la mutación puntual en el gen EGFP, como se demuestra en este nuevo modelo para la reparación de mutaciones puntuales, una vía molecular, en la que el ADN del donante accede a la plantilla de replicación para la reparación de la base mutante. Un proceso que hemos denominado ExACT. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la edición génica exploraran el grado de heterogeneidad en el sitio objetivo, como resultado de la actividad de edición génica en líneas celulares.