Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

El objetivo general de este método de preparación de la retina es utilizar microscopía de video para medir la reactividad arterial retiniana en ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación del flujo sanguíneo retiniano y podría contribuir a mejorar nuestro entendimiento de la fisiopatología de diversas enfermedades oculares. La principal ventaja de esta nueva técnica es que permite medir la reactividad de los vasos sanguíneos retinianos con una resolución óptica muy alta.

Y al mismo tiempo, no requiere mucho equipo sofisticado. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque puede ser complicado localizar la arteria oftálmica y sus ramas. Demostraré este procedimiento junto con Jenia Kouchek Zadeh y Wael Omran, estudiantes de posgrado de mi laboratorio.

Prepárese para los procedimientos experimentales disponiendo los instrumentos necesarios. Luego, use un par de tijeras de acero para cortar el cráneo del ratón en sentido sagital en dos mitades y utilice tijeras de ojo para retirar la piel y el cerebro. Use las tijeras de ojo para eliminar el hueso del cráneo hasta que solo quede el hueso orbitario y transfiera la órbita a un recipiente de disección que contenga tampón Krebs-Henseleit frío con hielo, colocado bajo un microscopio quirúrgico.

Corte el hueso orbital con tijeras para ojos y use pinzas de precisión tipo cuatro y tijeras de Vannas de resorte para estudiantes para retirar suavemente el globo ocular y el tejido orbital. Utilizando pinzas de precisión tipo cinco y tijeras de capsulotomía de Vannas, retire cuidadosamente la glándula de Harder, el tejido conectivo y los músculos extraoculares, teniendo cuidado de no dañar la rama principal de la arteria oftálmica. Use suturas de Nylon 10-0 para ligar las ramas orbitales en el extremo proximal de la rama principal de las arterias oftálmicas y use las pinzas de precisión tipo cuatro para transferir el globo ocular a una placa de Petri que contenga etanol al 70%.

Es muy importante que todas las ramas orbitarias de la arteria oftálmica sean ligadas para evitar fugas durante el experimento. Después de 10 segundos, regrese el globo ocular al recipiente de disección. La córnea presentará un aspecto blanquecino debido a la exposición al etanol.

Sustituya el tampón por una solución de Krebs fresca y utilice el microscopio y una aguja de calibre tres para perforar la córnea periférica. Use las tijeras de capsulotomía de Vannas para diseccionar la córnea y cortar suavemente el tejido del iris. A continuación, coloque un punto afilado de las tijeras de capsulotomía de Vannas entre la coroides y la retina y corte la coroides y la esclerótica.

Para montar la retina en una cámara de perfusión hecha a medida, primero use un portaabrazadera para insertar el extremo de una micropipeta de vidrio con una punta de 100 micrómetros de diámetro en el tubo de silicona de la cámara. Luego conecte la jeringa al otro extremo del tubo para lavar la punta de la micropipeta y eliminar cualquier residuo. Llene la cámara de perfusión con tampón Krebs frío y coloque la cámara bajo un microscopio estereoscópico.

Coloque una plataforma de plástico transparente con una indentación de 1,8 milímetros encima de dos alambres de acero de 1,6 milímetros de diámetro dentro de la cámara de perfusión y coloque un anillo de acero inoxidable sobre la plataforma. Utilice una cucharilla para transferir la retina con el nervio óptico, manteniendo la arteria oftálmica aún adherida, hacia la plataforma y retire el extremo suturado de la arteria oftálmica. Coloque dos lazos previamente hechos de sutura de Nylon 10-0 sobre la micropipeta y asegure la arteria a la micropipeta con las suturas.

Utilice una pinza de punta fina para colocar la retina sobre la plataforma transparente y use un segundo par de pinzas de punta fina para rasgar suavemente la cápsula anterior del cristalino. Extraiga el cristalino y use tijeras microquirúrgicas para eliminar por completo la cápsula del cristalino y el vítreo. A continuación, realice cuatro incisiones radiales en la retina, a la mitad de la distancia entre la pars plana y el nervio óptico, y coloque el anillo de acero inoxidable sobre la retina para fijarla a la plataforma.

Para preparar las arteriolas retinianas para el análisis, transfiera la cámara de perfusión bajo un microscopio de luz y seleccione la lente objetivo de inmersión en agua de 100X. Conecte tubos a los puertos de entrada y salida de una bomba paracíclica y circule la cámara con tampón de Krebs a 37 grados Celsius, oxigenado con 95% de oxígeno y carbonatado con 5% de dióxido de carbono. Conecte el tubo de silicona equipado con la micropipeta a una manguera de silicona de reserva mediante una llave de paso de tres vías y llene el depósito con tampón de Krebs hasta una altura correspondiente a 50 milímetros de mercurio.

Utilizando los objetivos, enfoque manualmente la superficie retiniana para buscar vasos sanguíneos o glóbulos rojos. Cuando se encuentre un vaso sanguíneo, enfoque el vaso y abra la llave de paso de tres vías. El diámetro del vaso debe aumentar inmediatamente y deben aparecer glóbulos rojos.

Después de un período de equilibración de 30 minutos, las arteriolas desarrollarán tonos intrínsecos débiles con una reducción del diámetro luminal inferior al 10%. Añada un reactivo restrictor retinal de ratón a la solución del baño y confirme la viabilidad del vaso. A continuación, haga circular la bomba para eliminar el agonista del baño y agregue tampón Krebs fresco a la cámara.

En este experimento representativo, la U46619, un análogo del tromboxano, produjo respuestas vasoconstrictoras dependientes de la concentración en arteriolas retinianas de ratones C57Bl/6J de tipo silvestre, con una reducción de aproximadamente el 50 % en el diámetro luminal desde el reposo a una concentración de 1 × 10⁻⁶ M. En arteriolas preconstruidas con el agonista, la administración acumulativa de acetilcolina indujo aumentos dependientes de la concentración en el diámetro luminal, alcanzando aproximadamente el 25 % del diámetro preconstruido a una concentración de acetilcolina de 1 × 10⁻⁵ M, lo que indica una endotelio vascular íntegro. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 90 a 120 minutos si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar estos procedimientos, recuerde ligar todas las ramas arteriales retrobulbares, sumergir el ojo en etanol antes de abrir el globo ocular para evitar la torsión de la arteria oftálmica, y finalmente verificar las puntas de las micropipetas de vidrio en busca de obstrucciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la retina de ratón para la medición arterial mediante microscopía de video in vitro.