Name: Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a analizar la actividad de la DNA polimerasa a nivel de nucleótido único mediante electroforesis en gel de acrilamida y etiquetado fluorescente infrarrojo. Este método permite observar cambios precisos durante la síntesis de DNA.

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Este trabajo fue financiado por la Corporación de investigación para el progreso científico (Cottrell Colegio académico Premio #22548) y biotecnologías TriLink (ResearchReward beca #G139).

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
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<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
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<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
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<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito un ensayo para caracterizar la síntesis mediada por la ADN polimerasa de la DNA de M. Utilizando cebadores de ADN etiquetados infrarrojo cercano, y usando electroforesis en gel de poliacrilamida de desnaturalización para resolver diverso tamaño de oligonucleótidos, podemos obtener la resolución de un solo nucleótido en oligonucleótidos, permitiendo una medición precisa de la síntesis. Estos enfoques se pueden utilizar para medir ya sea el conjunto de la actividad de la enzima (sección 2.1) o para med...

Polimerasas de la DNA realizan precisa y eficiente la síntesis de ADN y son esenciales para mantener la integridad del genoma. La habilidad de sintetizar cientos de nucleótidos por segundo sin errores también hace herramientas esenciales de polimerasas de la DNA en biología molecular y biotecnología. Sin embargo, estas propiedades también limitan las aplicaciones de substratos DNA M; en términos generales, naturales polimerasas de la DNA no pueden sintetizar muchos sustratos potencialmente valiosos de M-DNA, probablemente debido a la alta presión selectiva contra la utilización de sustratos no estándar en vivo. Muchos grupos han desarrollado enfoques de evolución dirigida para generar mutantes polimerasas de la DNA capaces de M-DNA síntesis1a,2,3,4,5; estos esfuerzos han ampliado la utilidad biotecnológica de ADN6,7,8.
Para evaluar la capacidad del mutantes polimerasas de la DNA para sintetizar ADN M, tenemos9,10y otros11,12,13 suelen utilizar mediciones en vitro de ADN actividad de la polimerasa, que se describen en este manuscrito. En estos experimentos, polimerasas de la DNA son co incubados con una cartilla/plantilla etiqueta duplex y sustratos de trifosfato de nucleósido; los productos se evalúan por electroforesis en gel. Dependiendo de la pregunta experimental concreta, polimerasas de ADN mutantes, primers modificados, plantillas modificadas o los trifosfatos de nucleósidos modificados pueden utilizarse, permitiendo la evaluación bioquímica sistemática de la actividad de la enzima del mutante.
Históricamente, estos ensayos se han basado en una etiqueta radiactiva de 5' a la síntesis de ADN; por lo general, se han utilizado 32P y 33P; por lo general, etiquetado se consigue utilizando T4 Polinucleótido quinasa11. Sin embargo, debido a la vida finita y relativamente alto costo de las etiquetas radiactivas y su disposición segura, nuestro grupo utiliza en cambio un fluoróforo de infrarrojo cercano de sintético 5' etiquetado ADN. Utilizando a un toner de relativamente bajo costo de infrarrojo cercano de gel, hemos observado los límites de detección similares a estudios previos usando etiquetas radiactivas (resultados no publicados). Hemos reproducido con éxito más allá de observaciones9, y no hemos observado grandes diferencias cuantitativas con constantes de velocidad previamente medido (resultados no publicados).
Para analizar el tamaño del ADN y así, el grado de síntesis de ADN, contamos con métodos de electroforesis en gel de poliacrilamida desarrollados originalmente para secuenciación de Sanger14 antes de la llegada de electroforesis capilar15. La distancia de separación o de la movilidad puede ser utilizada como una medida del peso molecular; gran formato, geles verticales de poliacrilamida puede alcanzar la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación cuantitativa de oligonucleótidos de ADN de diferentes longitudes.
Colectivamente, estos experimentos son un método robusto para la caracterización de la polimerasa. Debido al tiempo de naturaleza delicada de las reacciones, preparación y cuidado es necesario para lograr resultados reproducibles. Además, mientras que el gel de acrilamida es una forma altamente efectiva para medir la síntesis de ADN, así como numerosas otras DNA modificar reacciones, con la resolución de un solo nucleótido, puede ser un desafío técnico. Aquí el protocolo que permitirá a los usuarios para llevar a cabo estos experimentos evitando los errores más comunes.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetilado BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (es decir, DTT)</td><td>Productos de investigación Internacional</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (es decir, EDTA) (solución 0.5M)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Naranja G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (todos los demás NTPs modificados)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>cebador</td><td></td>surtido</tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>Utilizamos el tinte IR700 que se puede comprar como una síntesis personalizada. Por lo general, compramos los oligonucleótidos purificados por HPLC. La secuencia es 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>plantilla 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Síntesis personalizadas</td> Por <td>lo general, compramos los oligonucleótidos purificados por HPLC. La secuencia es 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67% de acrilamida y 1,33% de bis-acrilamida</td></tr><tr><td>Tris/Borato/EDTA (TBE) sólido</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Urea ultrapure</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de gel</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera de resorte blanca grande de polipropileno</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>espaciadores de 0,75 mm</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td>Juego de</tr><tr><td>placas de vidrio con muescas de 33x42</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td> Separador de placa de cuña <td></td></tr><tr><td></td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Peine para electroforesis en gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de electroforesis en gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>agua</td><td></td><td></td> ultrapura <td>utilizamos un sistema Milli-Q de Millipore</td></tr><tr><td>ADN polimerasas</td><td></td><td></td><td>Los preparamos en nuestro laboratorio utilizando protocolos publicados.</td></tr></tbody></table>

ensayo de actividad polimerasa de la dna usando la dna etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en gel de acrilamida

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Para cualquier enzima, robustos métodos cuantitativos son necesarios para la caracterización de las enzimas nativas y de ingeniería. Para polimerasas de la DNA, síntesis de ADN puede ser caracterizada mediante un en vitro síntesis análisis de ADN seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida. El objetivo de este análisis es cuantificar la síntesis de ADN natural y DNA modificado (M-DNA). Estos enfoques son particularmente útiles para la resolución de oligonucleótidos con la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación de pasos individuales durante la síntesis de oligonucleótidos enzimática. Estos métodos se han aplicado a la evaluación de una gran variedad de propiedades bioquímicas y biofísicas, como la medición de constantes de velocidad de estado estacionario de cada paso de la síntesis de ADN, la tasa de error de la síntesis de ADN y la afinidad de unión de ADN. Mediante el uso de modificado componentes incluyendo pero no limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-ADN o mutantes polimerasas de la DNA, la utilidad relativa del sustrato-ADN polimerasa pares pueden evaluarse con eficacia. Detallamos aquí, el ensayo, incluyendo los cambios que deben realizarse para acomodar no tradicionales primer ADN etiquetado estrategias tales como la fluorescencia etiquetada ADN cerca de infrarrojo. Además, hemos detallado pasos técnicos cruciales para gel de acrilamida verter y correr, que puede a menudo ser un desafío técnico.

Se muestran un análisis de gel de poliacrilamida al éxito de una caracterización cualitativa de la actividad total (descrito en la sección 2.1, figura 1) y de la cinética de estado estacionario (descrito en la nota final de la sección 2.1, figura 2). Un análisis de gel de poliacrilamida al fracasado también se muestra (figura 3).
Tenga en c...

Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la actividad de la ADN polimerasa a nivel de nucleótido individual. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ADN polimerasa, como qué pasos específicos de la síntesis de ADN están limitados por modificaciones del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que permite observar cambios de nucleótidos individuales, posibilitando una observación precisa de la actividad de la polimerasa.Al intentar este procedimiento, es importante recordar planificar con anticipación. Muchos de los pasos son sensibles al tiempo. Para comenzar este procedimiento, primero prepare los tampones, la mezcla de dúplex de ADN y la dilución de proteína según se describe en el protocolo escrito.A continuación, ajuste la temperatura de un baño seco a 50 grados Celsius. Añada 24 microlitros de la mezcla de dúplex apareada a un tubo de microcentrifugado que contiene 25 microlitros de dNTPs 2X. Después de esto, transfiera 9,8 microlitros de esta mezcla a un tubo de microcentrifugado que contiene 20 microlitros de tampón de parada naranja para preparar el control sin enzima.Luego, agregue 0,8 microlitros de enzima 50X a la mezcla de dNTP apareada. Utilice una pipeta de gran volumen para mezclar completamente la solución. Incube en el baño seco.Detenga la reacción retirando 10 microlitros de cada mezcla de reacción y luego añadiéndolos a un tubo de microcentrifugado que contiene 20 microlitros de tampón de parada naranja. Prepare la mezcla de acrilamida para electroforesis en gel según se describe en el protocolo escrito. A continuación, lave minuciosamente dos placas de gel de 33 centímetros por 42 centímetros con agua y jabón.Seque cada cara de la placa con toallas de papel y luego use toallitas delicadas para tareas para secar las áreas restantes. Enjuague las placas secas con etanol al 70 % y limpie cada una nuevamente con toallitas para tareas. Después de esto, pase una mano enguantada bajo agua desionizada y luego, usando los dedos humedecidos, humedezca suavemente algunos espaciadores de 0,75 milímetros.Coloque los separadores a lo largo del borde de la placa ranurada. Utilice toallitas para tareas para limpiar cualquier agua que pueda haber salpicado sobre las placas. Una las placas y luego use cinta de gel para cubrir la parte inferior y los lados, dejando la parte superior sin cinta.Asegúrese de que la cinta esté alineada uniformemente y sellada firmemente. Con una cuchilla, corte los extremos de la cinta. Luego agregue una capa adicional de cinta en la parte inferior del gel.Después de preparar los reactivos, obtenga una botella con pulverizador y retire el embudo puntiagudo. Utilizando un cilindro graduado, agregue 125 mililitros de agua. Luego, use un marcador permanente para marcar el nivel del agua en el exterior de la botella.Deseche el agua. A continuación, prepare los anillos de corcho y el sándwich de placas junto al fregadero según se indica en el protocolo escrito. Coloque la botella de spray vacía y las soluciones preparadas de APS y TEMED en el otro lado del fregadero.Coloque un peine de pocillos con el número deseado de pocillos y cuatro abrazaderas cerca. Luego, agregue solución de gel de acrilamida al 20 % al frasco con pico hasta alcanzar el nivel marcado. Al mismo tiempo, agregue 120 microlitros de TEMED y 600 microlitros de APS a la solución de gel de poliacrilamida.Agregue rápidamente 600 microlitros adicionales de APS. Tape inmediatamente el frasco con pulverizador y mezcle girando. A continuación, coloque el sándwich de placas en el fregadero.Comience a verter, aplicando una presión lenta y constante sobre la botella para asegurar que la solución de gel fluya de manera uniforme. Vierta hasta que el gel alcance la zona marcada y comience a desbordarse ligeramente por el borde marcado. Incline las placas para eliminar cualquier burbuja de aire.Luego agregue el peine de pocillos al sándwich de la placa. Coloque las abrazaderas sobre el peine de manera que presionen hacia abajo, permitiendo una distribución uniforme de los pocillos. Deseche rápidamente cualquier solución de gel restante en la botella de presión en un recipiente de desecho adecuado.Lave con agua desionizada tres veces a través de la boquilla de pulverización para limpiar el frasco. Para comenzar, retire todos los clips sujetapapeles del sándwich de placas. Con una cuchilla, corte y retire la cinta adhesiva del gel de los bordes.Limpie las superficies de vidrio con toallas de papel y agua para eliminar la mayor cantidad posible de residuo de gel polimerizado. Utilice una cuchilla a lo largo de los bordes para raspar cualquier gel restante. A continuación, empuje uniformemente el peine de pozos por ambos lados para retirarlo.Con una cuchilla, corte cualquier exceso de gel a lo largo del borde superior del sándwich de la placa. Luego, corte a lo largo del borde marcado de la placa. Utilizando una jeringa y agua desionizada, enjuague los pocillos para eliminar cualquier residuo.Asegúrese de que cada pocillo pueda llenarse con agua y no esté bloqueado por exceso de gel polimerizado. A continuación, coloque el sándwich de placas en el aparato de modo que la placa más larga quede orientada hacia afuera, mientras que el espacio ranurado quede orientado hacia adentro. Sujete el sándwich de placas y la placa de aluminio juntos, fijados al aparato.Agregue clips adicionales al exterior de la placa para favorecer una corrida uniforme. Añada tampón TBE utilizando solo la cantidad necesaria para cubrir las muescas de la base y los pocillos en la parte superior. Realice la electroforesis en gel a 50 vatios durante 20 minutos para calentar las placas.Después de esto, utilice una jeringa y tampón TBE para limpiar los pocillos. Repita el lavado con la jeringa varias veces para asegurarse de que todas las sales de tampón residuales hayan sido eliminadas de los pocillos. A continuación, prepare los carriles más externos en cada lado según se indica en el protocolo del texto.Agregue tres microlitros de formamida al 95 % con azul de bromofenol a los pozos correspondientes del gel. Cargue todas las muestras y déjelas asentar durante un minuto. Después de conectar el aparato y la fuente de alimentación, ajuste la potencia entre 50 y 55 vatios.Corra el gel durante aproximadamente tres horas o hasta que el frente del colorante azul de bromofenol haya recorrido al menos dos tercios del camino hacia abajo del gel. Después de esto, obtenga una imagen del gel según se describe en el protocolo del texto. En este estudio se desarrolla un ensayo para caracterizar la síntesis de ADN modificado mediada por la ADN polimerasa.Una caracterización cualitativa exitosa de la actividad general muestra bandas individuales bien definidas y regulares. La actividad se evalúa por la longitud de los productos y por la proporción del cebador marcado que se convierte en productos más grandes. Como puede observarse, las enzimas E6 y E5 son las más activas, mientras que E4 y E1 son las menos activas.También se puede realizar un análisis cuantitativo utilizando cinética de estado estacionario con estos métodos. Dado que solo se sintetizan los productos N y N+1, el evento singular puede cuantificarse con éxito. La metodología básica descrita aquí también puede utilizarse para estudiar una serie de otras enzimas que modifican el ADN o el ARN, además de las polimerasas.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Este estudio presenta un ensayo FRET radiométrico simple y fácil de usar para la detección y evaluación cuantitativa de la actividad de la ADNasa, y demuestra su aplicación en el análisis de una nucleasa débil.

Evaluación de la actividad de la ADNasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Este protocolo describe un ensayo de replicación de ADN de una sola molécula basado en microscopía de fluorescencia, que permite la visualización en tiempo real de las interacciones entre las ADN polimerasas y obstáculos como las estructuras G-cuádruples.

Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex

Aprende a analizar la actividad de la DNA polimerasa a nivel de nucleótido único mediante electroforesis en gel de acrilamida y etiquetado fluorescente infrarrojo. Este método permite observar cambios precisos durante la síntesis de DNA.

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida (Video) | JoVE Journal

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

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