Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

El objetivo general de este flujo de trabajo iterativo que combina el diseño experimental basado en Kringing y la tecnología de microbiorreactores para un rendimiento de cultivo suficiente es describir un enfoque genérico para el diseño a medida de medios de cultivo microbianos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de bioprocesos microbianos, como la optimización de los medios de cultivo, las condiciones del bioproceso, así como el fenotipado de la cepa. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos preguntamos si los medios de cultivo optimizados para la producción de metabolitos pequeños también eran los más adecuados para la producción de proteínas heterólogas.

La principal ventaja de esta técnica es que acelera los tiempos generales de desarrollo mediante una combinación inteligente de experimento y modelado. El encargado de demostrar este procedimiento será Roman Jansen, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Comience este procedimiento con el estudio, la concepción y la definición de los métodos, tal como se detalla en el protocolo de texto.

Esterilice placas de pocillos profundos para el almacenamiento de soluciones madre en una mesa de trabajo limpiando las placas con etanol al 70 por ciento y secándolas posteriormente en una campana de flujo laminar. Inicie el cultivo de semillas inoculando 50 mililitros de medio BHI que contenga 25 miligramos por litro de kanamicina con una alícuota del banco de células de trabajo. Coloque todo el material de laboratorio necesario en la mesa de trabajo robótica y vierta las soluciones de stock en el material de laboratorio correspondiente.

Luego, inicie el flujo de trabajo robótico para la preparación de los medios de modo que el último paso, que es la inoculación, se alcance a tiempo para el inicio del cultivo de semillas. Muestree el cultivo de semillas después de aproximadamente dos horas para monitorear el crecimiento midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros o O-D-600. Continúe monitoreando el crecimiento a cada hora.

Después de aproximadamente cinco horas, el cultivo alcanza un O-D-600 entre tres y cuatro, y se utiliza para inocular los principales cultivos. Coloque el cultivo de semillas en la mesa de trabajo del manipulador de líquidos y continúe con el protocolo de preparación de medios. Sellar las placas de microtitulación de cultivo después de la inoculación.

A continuación, coloque el M-T-P de cultivo sellado en el dispositivo Biolector. A continuación, inicie el protocolo de cultivo predefinido. Deseche las soluciones madre restantes de acuerdo con las normas de bioseguridad, si es necesario.

A continuación, siembra el cultivo desde la mesa de trabajo robótica. Limpie el material de laboratorio reutilizable antes de iniciar el protocolo de descontaminación del manipulador de líquidos. Detenga la referencia cultural principal después de un tiempo de ejecución de 17 horas y procese los datos como se describe en el protocolo de texto.

Para cuantificar el título de G-F-P, primero transfiera las suspensiones celulares de todos los pozos de cultivo a tubos de reacción prelabrados. A continuación, centrifugar las suspensiones celulares durante 10 minutos a velocidad máxima utilizando una centrífuga de sobremesa para obtener el sobrenadante libre de celdas. A continuación, transfiera 200 microlitros de cada sobrenadante libre de células a un M-T-P negro de 96 pocillos con fondo transparente.

Lea la fluorescencia específica de G-F-P a 488 nanómetros para la excitación y 520 nanómetros para la longitud de onda de emisión utilizando un lector de microplacas adecuado. Después de medir la fluorescencia G-F-P, la microplaca se puede utilizar directamente para determinar el contenido de proteínas de los sobrenadantes libres de células con protocolos estándar como un ensayo de Bradford o B-C-A. Finalmente, proceda al análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.

El procedimiento demostrado constituye una ronda de experimentos, los resultados se utilizan para diseñar rondas posteriores con la máxima mejora esperada de la señal G-F-P. En cada ronda se colocan experimentos de referencia para analizar la variabilidad de los datos y detectar valores atípicos experimentales. Este diagrama de contorno ofrece una visión general del procedimiento de optimización.

El análisis del conjunto de datos recopilados a través de la iteración tres reveló una limitación del efecto positivo del magnesio, identificando un rango de concentración óptimo. Por lo tanto, se decidió ampliar aún más el rango de concentración solo para el calcio en la iteración cuatro. El procedimiento se repitió dos veces en la iteración cinco y seis hasta que se encontró una saturación de la señal G-F-P.

Esta saturación se explica por la precipitación de sal de calcio para las concentraciones de calcio aplicadas, que no están disponibles para la célula. La séptima iteración se utilizó para explorar los límites con más detalle. Los rangos de concentración óptimos de los componentes del medio para la señal G-F-P saturada se pueden identificar de forma fiable con una prueba Z estadística.

Muestra la meseta identificada tal y como se determina y visualiza utilizando la caja de herramientas del kit Kringing. La caja de herramientas del kit Kringing está disponible de forma gratuita y viene con un tutorial detallado que explica cómo usar sus funciones. La naturaleza genérica del protocolo presentado permite diversas adaptaciones, como el estudio de otros huéspedes de expresión microbiana o la optimización de otras propiedades de la proteína objetivo, como el patrón de glicosilación o los enlaces disulfuro.

La integración de un sistema de embriones aumenta el rendimiento experimental, lo que permite un gran ahorro de tiempo Al reemplazar biorreactores totalmente controlables e influenciados por sistemas amniares, se debe considerar la escalabilidad de los resultados. El modelado matemático y el diseño de experimentos ayudan a maximizar el contenido de información de los datos de medición con respecto al objetivo estudiado.