Name: Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende a optimizar medios de cultivo microbianos mediante diseño experimental Kriging y microbioreactores automatizados. Este protocolo iterativo acelera el desarrollo de bioprocesos para producción de proteínas heterólogas.

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Las actividades científicas del centro de ciencia de bioeconomía fueron apoyadas financieramente por el Ministerio de innovación, ciencia y tecnología en el marco de la Strategieprojekt NRW BioSC (núm. 313/323-400-002 13). Los autores agradecen a la Consejería de innovación, ciencia e investigación de Renania del Norte-Westfalia y la Heinrich Heine University Düsseldorf para una beca a Lars Freier dentro de la Biotecnología Industrial graduado de CLIB Cluster. Más financiación recibió del programa de espacios de activación "Laboratorios de innovación de Helmholtz" de alemán Asociación de Helmholtz para la "microbiana bioprocesos Lab – A Helmholtz laboratorio de innovación".

Los autores no tienen nada que revelar.

La naturaleza genérica del protocolo presentado permite adaptaciones diferentes, por ejemplo, para el estudio de otros expresión microbiana anfitriones9,47,48,49,50, 51, o para optimizar otras propiedades de la proteína diana, como los bonos de disulfuro o patrón de glicosilación. El protocolo también deba adaptarse a los equipos de laboratorio disponibles. La integración de un sistema MBR permite aumentar el rendimiento experimental, que permite grandes ahorros en el tiempo. Sin embargo, al reemplazar Biorreactores completamente instrumentadas y controlables por sistemas MBR, escalabilidad de resultados debe considerar8,37,52,53. El uso de modelos matemáticos y metodologías DOE ayuda a maximizar el contenido de información de datos de medición con respecto a los objetivos estudiados54 eficiente planificación experimental y datos basados en el modelo de interpretación15.
Modificaciones al método Junto al multiusos expandible robótica manejo de líquidos y sistemas como el utilizado en este estudio, cabe mencionar que existen varios sistemas disponibles comercialmente que son capaces de realizar esta tarea y pueden ser colocados dentro para manejo de líquidos menor de bancos de trabajo de flujo laminar. Si no existe ningún sistema de pipeteo automatizado, composiciones de diferentes medios según el plan DOE pueden realizarse mediante pipeteo manual utilizando pipetas individuales o múltiples canales. Puesto que la preparación manual es más propenso y requerirá trabajo altamente enfocado durante mucho tiempo, se recomienda preparar un menor número de composiciones de diferentes medios de comunicación.
Dependiendo de las capacidades del sistema MBR empleada, el correspondiente protocolo de cultivo variará. Por ejemplo, si no hay medición en línea de formación de biomasa está disponible, puede ser suficiente medir la concentración de biomasa después de la terminación del experimento de crecimiento. En combinación con monitoreo en línea del pH y oxígeno disuelto, que está implementado en varios sistemas MBR, la saturación del crecimiento puede ser determinada con seguridad. En principio, el crecimiento puede realizar experimentos en MTPs solo colocadas dentro sacudiendo incubadoras, sin el uso de un sistema MBR. En este caso, las condiciones de cultivo apropiado deben garantizarse: (1) cultivos de oxígeno limitado pueden evitarse utilizando MTPs con geometrías adecuadas, en combinación con adecuada agitación frecuencias y sacudiendo diámetros, por ejemplo, Plaza 96 o 24 profundo placas bien funcionaron a 1.000 rpm en pasos de 3 mm o en 250 rpm en pasos de 25 mm, respectivamente. Lo importante es menor las velocidades de transferencia de oxígeno máxima alcanzable, menor la fuente de carbono debe ser concentrada. Como se mencionó anteriormente, para este estudio, el uso de glucosa 10 g/L es conveniente evitar la limitación de oxígeno para las condiciones de cultivo empleadas; (2) muestras de las culturas MTP para la cuantificación de biomasa y producto deben reducirse al mínimo. Cada vez que el MTP se retira de la incubadora de agitación, transferencia de oxígeno será inmediatamente avería que puede resultar en condiciones de cultivo desfavorables; (3) en la opinión de los autores, no se recomienda el uso de lectores MTP como dispositivos de cultivo como estos dispositivos no fueron desarrollados para este propósito. Por ejemplo, agitación mecánica fueron construida para la mezcla ocasional de microplacas después de añadir el reactivo y por lo tanto, a menudo carece de robustez para tramos largos de duración continua agitación durante días. Por otra parte, suficiente entrada de potencia necesaria para cultivos microbianos no puede realizarse en estos lectores. La integración de lecturas de densidad óptica en breve intervalos requiere detener el movimiento de agitación, resultando en repetidos períodos de la limitación de oxígeno. Además, evaporación en dichos sistemas durante períodos de larga de la cultivación distorsionaran los resultados. Para más detalles sobre el tema sorprendentemente complejo sobre el uso de MTPs para cultivos microbianos, el lector es referido a la literatura citada22,23,24,25,26 y referencias en esto.
Otras consideraciones A pasos de optimización iterativo de acelerar, se aconseja seleccionar con cuidado el método analítico para la cuantificación del producto. Métodos rápidos y simples se debe preferir a costa de precisión y exactitud, como la estrategia de diseño experimental iterativo tolera imprecisión experimental. Sin embargo, los resultados finales deben ser verificados contra los métodos de cuantificación de producto suficientemente preciso y exacto que podrían ser más complicados. En general, una evaluación cuidadosa y toma de decisiones acerca de los procedimientos de estudio requieren esfuerzo al principio del estudio, pero pagarán a largo plazo, después de que se han establecido métodos de rutina.
Se recomienda definir un experimento de referencia que se compara a todos los experimentos durante la optimización. Es decir, el componente medio aplicado concentraciones así como salida medido se normaliza mediante dividiendo los valores de referencia. Esta manera, cada una aplicada y valor medido se puede interpretar como el x-fold del valor de referencia. Para tener en las variaciones de la cuenta entre las placas, cinco experimentos de referencia se realizan en cada plato. El valor medio de los resultados medidos se utiliza para la normalización.
Generalmente no se puede garantizar que el medio desarrollado también es óptimo para otras cepas. Sin embargo, el mejor medio es muy probable que también será apropiado para el cultivo de cepas de expresión con pequeñas diferencias genéticas, por ejemplo, cuando producir variantes de la enzima con solo aminoácido las substituciones obtenidos de los estudios de mutagénesis ( Aunque incluso mutaciones puntuales se han descrito para el metabolismo celular efecto y expresión heteróloga rendimiento55,56). En este caso, el protocolo presentado puede ser un primer paso, seguido por protocolos de expresión de alto rendimiento proyecciones57. Si se utiliza el protocolo de desarrollo medio con posterior escala a los cultivos fed-batch, el medio optimizado debe verificarse para las condiciones correspondientes de bioprocesos, clon campañas en la microescala de evaluación identificados diferentes top ejecutantes de diferentes estrategias de alimentación y cultivo medios52,58. Además, el introducido KriKit36 generalmente pueden contribuir a la optimización de bioprocesos holística mejorada.Sólo recientemente, las capacidades de la herramienta se ampliaron para apoyar también optimización multi-objetivo40, que puede ser importante para la optimización de ambos procesos upstream y downstream59,60.

La tecnología genética recombinante moderna permite el amplio uso de enzimas técnicas para diversas aplicaciones en la industria farmacéutica, animal alimentación, química orgánica y1,2,3de procesamiento de alimentos. La producción de enzimas técnicas en grandes cantidades es un tema importante para la biotecnología industrial y para la producción de proteína recombinante optimizado y tanto la tensión y es necesario ingeniería de bioprocesos. Para la generación de cepas de producción eficiente ingeniería bibliotecas genéticas diferentes están disponibles, por ejemplo, para equilibrado gene expresión4 o secreción creciente eficiencia5.
Glutamicum del Corynebacterium es un productor importante de aminoácidos en la escala industrial6,7 y representa un huésped atractiva expresión no convencional de la producción secretora de proteínas recombinantes8 ,9. El general secretores (s) y la vía de desplazamiento del gemelo-arginine (Tat) están presentes en C. glutamicum y se aplicaron con éxito para la secreción de la proteína recombinante10. Amplia experiencia en ingeniería de bioprocesos en producción de aminoácidos a escala industrial, así como la capacidad de secretar proteínas g/L cantidades11 y gran robustez sobre inhomogeneidades de bioprocesos encontradas gran escala cultivos12,13, hacen de C. glutamicum un organismo plataforma prometedora para la producción de secreción de proteínas heterólogas a escala industrial.
Optimización del medio de nutrición se sabe para mejorar la producción de proteínas recombinantes con sistemas microbianos14,15,16,17 y por lo tanto, el ajuste del medio de la composición es un paso gratificante en bioprocesos y desarrollo con respecto a la productividad óptima18,19,20,21. Intenso trabajo de investigación sobre la aplicación de placas de microtitulación (MTPs) para cultivo microbiano22,23,24 allanó el camino para el desarrollo y diseño del MTPs para cultivo microbiano25 ,26 y el desarrollo de sistemas de microbioreactor basados en MTP (MBR) con monitoreo en línea y ambiental control de27,28. MBRs permiten un aumento significativo en el rendimiento de cultivo experimental. Además, existen sistemas MBR derivados de otros tipos de biorreactores, por ejemplo, columnas de burbujas o de tanque agitado reactores, bioprocesos microbianos optimización29,30,31, 32.
En general, estudios de optimización se benefician de mayor rendimiento experimental, que se convierte en aún más potente en combinación con metodologías de DOE, ejemplo, a evaluar las interacciones entre las variables de diseño o reducir espacios de búsqueda multidimensional. En consecuencia, el uso combinado de los sistemas MBR, automatización de laboratorio y DOE ha demostrado para ser un método eficaz en biotecnología8,16,33,34,35.
Un protocolo para la optimización de los medios de comunicación se presenta la combinación de automatización de laboratorio de vanguardia, tecnología MBR con monitoreo de procesos en línea y diseño experimental/análisis de Kriging basado en los datos. La metodología de Kriging se implementa en un Toolbox de MATLAB ("KriKit") que puede ser descargado y utilizado sin cargo36. Como ejemplo de aplicación, maximización de la producción de proteína (GFP) secretores de ﬂuorescent verde con C. glutamicum se muestra mediante la optimización de la composición del medio mínimo CgXII. Título GFP fue elegido como el objetivo de optimización puede cuantificarse fácilmente y se aplica extensamente como proteína modelo para estudios en MBR sistemas37,38,39.
El marco presentado se divide en cuatro pasos, que se ilustran en la figura 1. Los pasos son indicados por rectangulares y corresponden a las secciones del protocolo. El primer paso (figura 1A) es definir los objetivos del proyecto y determinar los métodos necesarios. La combinación de metodologías DOE, tecnología MBR y automatización de laboratorio permite un mayor rendimiento experimental que exige el procesamiento de datos de gran alcance. El segundo paso (figura 1B) tiene como objetivo detectar las variables de diseño (es decir, medio componentes) con alta influencia en el objetivo de la optimización. Esto conduce a un número reducido de variables de diseño de interés. El tercer paso (figura 1) comprende una optimización iterativa para una investigación más detallada de la relación funcional entre las variables de diseño restante y el objetivo de interés. Utilizando el conjunto de datos sucesivamente ampliado, se aplica el método de Kriging para predecir los resultados experimentales en lugares. El ciclo iterativo se detiene tan pronto como el modelo Kriging predice un óptimo o meseta con suficiente exactitud. Los resultados se verifican en el cuarto paso (figura 1), a partir de un análisis de sensibilidad adicional alrededor de la óptima identificada. Si inicialmente, se encuentran componentes insensibles a ser insensible también en la región óptima, es razonable asumir que esto es cierto durante el procedimiento de optimización iterativo en el tercer paso. Luego, se recomienda verificar los resultados de optimización mediante la aplicación de métodos, ortogonales, como un ensayo de actividad o SDS-Page.
La naturaleza genérica del protocolo presentado permite la adaptación fácil a equipo de laboratorio diferentes, otros hosts de expresión y proteínas objetivo de elección, así como bioprocesos más variables como valor de pH, temperatura cultivo.Además, otros objetivos de optimización como la tasa de producción de la proteína, rendimiento específico o la calidad del producto pueden ser elegidos para caber el alcance de otros estudios de optimización.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figura 1 : Flujo de trabajo de estudio optimización. Las cajas cuatro marco corresponden a las secciones del Protocolo, "Concebir el estudio y definición de métodos" (sección 1), "Análisis de sensibilidad" (sección 2), "Iterativo optimización" (sección 3) y "Validación" (sección 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Para el cultivo en el dispositivo BioLector</td></tr><tr><td>Lámina de sellado</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Sellado estéril para placa de flores</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml; lich</td><td>n/a</td><td>Disponible gratuitamente, se requiere la instalación de MATLAB</td></tr><tr><td>Robot de pipeteo Janus</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Incluye la instalación del software "WinPrep"</td></tr><tr><td>Microplaca de pozo profundo de 12 columnas</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Contenedor para soluciones madre medianas</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 pocillos, transparentes,</td><td>655101 Greiner</td><td></td> de fondo F <td>para ensayo de proteínas Bradford</td></tr> <tr><td>y micro; Microplacas transparentes de 96 pocillos, cuerpo negro, fondo F transparente</td><td>Greiner</td><td>655087</td><td>Para la medición de fluorescencia en sobrenadantes libres de células</td></tr><tr><td>Pipeta Research&nbsp; además de pipetas multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Facilita la manipulación manual de líquidos con microplacas</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp; Geles prefabricados</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Para el análisis de SDS-Page de supernanantes libres de células</td></tr><tr><td>Bradford Reactivo</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a Lleva</td><td>el plásmido pEKEx2 con fusión del gen GFP y el péptido señal PhoD de B.subtilis como inserto de expresión. El plásmido proporciona resistencia a la kanamicina. Descrito y publicado por Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash; 42 (2007)</td></tr></tbody></table>

protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología microbioreactor automatizada

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Un negocio en biotecnología industrial con fábricas de la célula microbiana es el proceso iterativo de la cepa ingeniería y optimización de condiciones de bioprocesos. Un aspecto importante es la mejora del medio de cultivo para proporcionar un ambiente óptimo para la formación microbiana del producto de interés. Es bien aceptado que la composición de los medios de comunicación puede influir dramáticamente en desempeño de bioprocesos. Optimización del medio de nutrición se sabe para mejorar la proteína recombinante producción con sistemas microbianos y por lo tanto, este es un paso gratificante en el desarrollo de bioprocesos. Sin embargo, recetas de medios muy a menudo estándar se toman de la literatura, desde el diseño a medida del medio de cultivo es una tarea tediosa, que requiere tecnología de microbioreactor para el suficiente rendimiento de cultivo, análisis de producto rápida, así como apoyo por robotics lab para fiabilidad en pasos para manejo de líquidos. Además, avanzados métodos matemáticos son necesarios para analizar racionalmente los datos de medición y diseñar eficientemente experimentos paralelos como para alcanzar el contenido óptimo de la información.
La naturaleza genérica del protocolo presentado permite la adaptación fácil a equipo de laboratorio diferentes, otros hosts de expresión y proteínas blanco de interés, así como otros parámetros de bioprocesos. Además, otros objetivos de optimización como la tasa de producción de la proteína, rendimiento específico o la calidad del producto pueden ser elegidos para caber el alcance de otros estudios de optimización. La caja de herramientas aplicadas de Kriging (KriKit) es una herramienta general para el diseño de experimentos (DOE) que contribuye a la optimización de bioprocesos holística mejorada. También soporta la optimización multi-objetivo que puede ser importante en la optimización de procesos upstream y downstream.

Se aplicó el protocolo introducido para maximizar la concentración de GFP secretada. Específicamente, el título GFP después 17 h de cultivo fue elegido como el objetivo de la optimización. Detección en línea de la fluorescencia de GFP permite cuantificación simple producto. Sin embargo, la normalización de la señal GFP con los datos de un cultivo de referencia es indispensable para asegurar la comparabilidad de los resultados y la reproducibilidad. Se realizó una selección previa de los componentes de los medios de comunicación de manera racional como se describe en la sección 1. Los experimentos fueron realizados siguiendo las instrucciones de la sección 1: se definieron los parámetros de los procedimientos de laboratorio húmedo para el estudio entero asegurando consistencia y reproducibilidad de los resultados.
Como se describe en la sección 2, se realizó una revisión inicial para identificar los componentes relevantes que muestran un impacto significativo en el objetivo de la optimización para el estudio adicional y más detallado. El sistema MBR basado en MTP permite 48 experimentos a realizar en paralelo. Teniendo en cuenta el máximo número posible de experimentos paralelos en un MTP (48) y el número total de marcas (11) componentes de los medios de comunicación el 2IV11-6 fraccional del diseño una elección apropiada. Este diseño experimental comprende 32 experimentos y permite la estimación del efecto principal para cada uno de los componentes de los medios de comunicación investigados. Los pozos restantes del cultivo (16) fueron utilizados para múltiples repeticiones de experimentos con el medio de referencia para evaluar reproducibilidad y efectos posicionales. Es decir, cada experimento se lleva a cabo una vez (sin repeticiones), excepto las de la experiencia de referencia (cinco repeticiones).
La tabla 1 resume los resultados de los análisis de proyección. En el rango de concentración considerado, variando la mayoría de los componentes de los medios de comunicación no muestran un efecto notable sobre el objetivo. Componente NH4+ muestra un fuerte efecto negativo, mientras que el Ca2 + y Mg2 + muestran la más fuerte tendencia positiva. El efecto de Mg2 + no es significativo para la gama actual de concentración pero podría ser para un rango más amplio de concentración. En consecuencia, se decidió omitir NH4+ del medio y a investigar el efecto de Ca2 + y Mg2 + en experimentos adicionales.
Sección 3 describe el procedimiento de optimización iterativo que se utiliza para maximizar la señal de la fluorescencia de GFP y variando las concentraciones de Ca2 + y Mg2 +. En la iteración 1, se probó la hipótesis que NH4+ puede omitirse. El rango de concentración de Ca2 + y Mg2 + se adoptó a partir del análisis de la proyección. La concentración mínima de NH4+ se establece en cero y la máxima concentración se adoptó desde el experimento de la proyección. En los siguientes experimentos, las concentraciones del componente se distribuyeron sobre un 3 x 3 x 3 rejilla dentro del rango de concentración definida, dando por resultado 27 experimentos. Durante los cultivos, se incluyeron cinco repeticiones de medio de referencia que sirve como estándar interno y para garantizar que ningún efecto posicional sobre el MTP se produjo. Para los restantes 16 pozos, las concentraciones de NH4+, Ca2 +y Mg2 + se distribuyeron al azar dentro de los rangos dados.
Figura 5 A visualiza los resultados de las primeras iteraciones. Rótulos de los ejes se refieren a las concentraciones de componentes utilizadas en el medio original de referencia, indicada por x Ref. Las superficies azules representan las interpolaciones de Kriging que se calcularon con el software KriKit. Cada superficie se asocia con un nivel de concentración relativa de NH4+ (azul oscuro: 0 x Ref, cuadriculado: 1 x Ref, celeste: 2 x Ref). Esta representación visual revela que es favorable a omitir NH4+. Superficies de interpolación también muestran los efectos positivos de Mg2 + y Ca2 +, como todo lugar de planos con el aumento de las concentraciones.
Basado en los resultados de la iteración 1, se decidió ampliar la concentración rango de Ca2 + y Mg2 + por la duplicación de las concentraciones máximas y cambiando la ventana de diseño experimental a la esquina superior derecha, ver figura 5 B. dentro de este rango, las concentraciones fueron distribuidas en una cuadrícula de 6 x 6. Esto asegura una distribución uniforme en el rango de concentración total, conduce a resultados óptimos de interpolación de Kriging. Figura 5 B muestra el diagrama de interpolación de Kriging basado en los datos combinados se mide en dos iteraciones (puntos rojos y amarillos cuadrados). Para ambos, Ca2 + y Mg2 +, sigue el efecto positivo del aumento de sus concentraciones. En consecuencia, el procedimiento se repitió al duplicar la concentración máxima y por lo tanto, la ventana de diseño experimental se trasladó a explorar los límites de la esquina superior derecha.
Figura 6 A ofrece una visión general del procedimiento de optimización restantes. El análisis del conjunto de datos recogido hasta la iteración 3 reveló que una limitación del efecto positivo de Mg2 +, es decir, una concentración óptima gama de Mg2 + se identificó. Por lo tanto se decidió ampliar el rango de concentración sólo para Ca2 + (iteración 4). Este procedimiento se repitió dos veces (iteración 5 y 6) hasta que se encontró una saturación de la señal de la GFP. Esta saturación se explica por la precipitación de sales de Ca para las concentraciones aplicadas de Ca2 +, que no están disponibles para las células.
Como los resultados experimentales son siempre perturbados por el ruido, la interpolación Kriging resultante aparece irregular e inspección visual podría conducir a conclusiones falsas. Sin embargo, el rango de concentración óptimo de componentes de los medios de comunicación para la señal saturada de GFP se puede identificar confiablemente con el estadístico z -test, que también se implementa en KriKit. El z -test utiliza directamente la intrínseca información estadística proporcionada por el Kriging método, es decir, valores de predicción y las incertidumbres de la predicción. Figura 6 B muestra la meseta identificada, como determinado y visualizado utilizando el toolbox KriKit.KriKit herramientas libremente disponibles36 y viene con un tutorial detallado que explica cómo utilizar sus características.
Si se encuentran más de dos componentes relevantes, visualización 3D llega a su límite. KriKit proporciona otros métodos posibles de representación visual como películas o "proyección de parcela". Si el potencial óptimo se encuentra dentro del rango de concentración definida, nuevos experimentos se diseñan automáticamente utilizando el mejoramiento esperado40,46. El diseño experimental basado en la mejora prevista está integrado en la caja de herramientas KriKit. Información más detallada puede encontrarse en la documentación del software.
Después del procedimiento iterativo, se realizó una verificación de los resultados, como se describe en la parte D. La validez de la hipótesis iniciales se comprobó mediante la realización de un análisis de sensibilidad adicional utilizando la óptima composición media. Es decir, todos los componentes de los medios de comunicación inicial de interés fueron variados, pero Ca2 + y Mg2 + fijaron a sus niveles de concentración óptima. En este estudio, las concentraciones óptimas <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref y <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6.8 x Ref fueron elegidos. La tabla 2 muestra los resultados de la evaluación de validación. Similar a la sensibilidad inicial de cribado (CF. tabla 1), NH4+ todavía tiene una influencia negativa importante y efectos restantes son aún insignificantes.
Debido al fácil acceso, la señal de la fluorescencia de GFP de la suspensión del cultivo se utilizó para cuantificar la concentración extracelular de GFP durante todos los experimentos. Por razones de verificación, la fluorescencia de GFP fue validada contra otras medidas. Porque GFP es secretada a través de la vía de Tat, la señal de fluorescencia no puede discriminar entre intra - y extracelular GFP. Así, los cultivos fueron reproducidos utilizando el medio de referencia y el medio optimizado. Además de la medición de la fluorescencia de los sobrenadantes libres de células de cultivo, contenido de proteínas se cuantificó por el ensayo de Bradford y (semi)-mejoramiento cualitativo de la GFP visualizado por SDS-Page15. Todas las mediciones resultantes señales aproximadamente se duplicó para cultivos con medio optimizado en comparación con el medio de referencia y validado los aproximadamente 100% mejoramiento de rendimiento de secreción del medio optimizado. En consecuencia, fluorescencia específica de la GFP de suspensión de cultivo se puede considerar una métrica adecuada para el objetivo de la optimización, es decir, la concentración extracelular de GFP.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figura 2 : Captura de pantalla de la lista de pipetas de volumen para análisis de sensibilidad. Entradas en la primera columna asignan un identificador único para todos los volúmenes de una fila; Este identificador es el MTP bien número de cultivo objetivo MTP en la mesa de trabajo de controlador líquido, CF. C figura 4. Columnas restantes codifican volúmenes para diferentes soluciones ("Sln-01" a "Sln-15") para se pipetea. El volumen acumulado de una fila se corresponde con el volumen de cultivo final del bien. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figura 3 : Captura de pantalla del software de control "WinPREP" para manejo de líquidos. Izquierda: Ordenó por filas los comandos, incluyendo un comando de transferencia para cada solución madre a se pipetea. Antes el comando final para la adición de inóculo, se inserta un prompt de usuario para garantizar que la cultura de la semilla se coloca en la mesa justo a tiempo. Derecha: Esquema de la mesa de trabajo, incluyendo el laboratorio fuente para variación de existencias (dos placas de pozos profundos con 12 pozos de columna), el canal de reactivo Stock resto, inóculo, agua y el cultivo de objetivo de preparación de medios MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figura 4 : Recopilación de capturas de pantalla detallada de configuración de uso de una solución madre. (A) sin envolver comando para el pipeteo de la acción de Fe. Fuente para laboratorio y fuente bien dentro están marcados en la mesa de trabajo por el marco de lectura y columna roja de la placa de la pozo profundo correspondiente. Laboratorio de destino y destino pozos dentro están marcadas por marco azul alrededor de los pozos azules del cultivo objetivo MTP. (B) vista de ejemplo detallado en la asignación de volúmenes para este paso (solución stock de Fe). Número de destinos se lee de la lista de pipeteo, que tiene 48. Los volúmenes de descarga para todos los pozos de destino para solución stock de Fe se encuentra en la columna 4 en la lista de pipeteo. Observe que la primera columna en la lista de pipeteo contiene identificadores y no volúmenes transferidos, véase la figura 2. (C) detalles en destino bien de numeración. Escrito en la fila #1 de la lista correspondiente de pipetear los volúmenes se pipetea en bien marcada como #1 y así sucesivamente. Pozos #01, #08, #41 y #48 corresponden a pozos A01, A08, F01 y F08 para la codificación alfanumérica, que también se imprime en la cultivación MTP sí mismo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figura 5 : Detalla los resultados de la primera iteración. (A) interpolación Kriging basado en los datos experimentales de la iteración 1. Puntos rojos indican el conjunto de datos. Para la comparación, todas las superficies de interpolación tres estén superpuestas en una parcela (azul oscuro: 0 x Ref, cuadriculado: 1 x Ref, celeste: 2 x Ref). Una representación alternativa de los resultados puede encontrarse en otra parte15. (B) interpolación Kriging basado en los experimentos realizados en iteración 1 (puntos rojos) y la iteración 2 (cuadros amarillos).Partes de los datos presentados en esta figura han sido previamente publicados15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figura 6 : Representación de los resultados de optimización iterativa recogidos. Kriging Final (A) modelo de predicción. (B) identificación estadística de zona óptima (rojo) basado en el estadístico z-test, que es proporcionado por KriKit. Cajas indican pasos sucesivos de diseño iterativo y ejecución de experimentos. Partes de los datos presentados en esta figura han sido previamente publicados15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Valor medio del coeficiente normalizado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0,08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: resultados de los análisis de sensibilidad. Valores del coeficiente que representa el efecto promedio al aumento de la concentración de componente de medios respectivos de su valor de centro hasta su valor máximo. Para diseños experimentales óptimos, como en la literatura estándar y había utilizado aquí, la desviación estándar representa directamente la variación experimental debido a la replicación del experimento de referencia. Valores del coeficiente fueron normalizados por el valor máximo (0.0422 para componente Ca2 +). Desviación típica Coeficiente normalizado y absoluta es de 0.54 y 0.0226, respectivamente.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Valor medio del coeficiente normalizado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0,52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: resultados de los análisis de sensibilidad final. Valores del coeficiente que representa el efecto promedio al aumento de la concentración de componente de medios respectivos de su valor de centro hasta su valor máximo. Como se utilizó un diseño experimental óptimo, la desviación estándar sólo depende de la variación experimental usando la composición medio optimizada. Variación experimental aumentó levemente en comparación con la variación usando el medio de referencia. Valores del coeficiente fueron normalizados por el valor máximo (0.0106 para componente Mn2 +). Desviación típica Coeficiente normalizado y absoluta es de 3.63 y 0.0385, respectivamente.

Este manuscrito describe un enfoque genérico para el diseño a medida de los medios de cultivo microbianos. Esta opción está activada por un flujo de trabajo iterativo combinando Kriging experimental diseño y microbioreactor tecnología suficiente rendimiento de cultivo, que se apoya en la robótica de laboratorio para aumentar la fiabilidad y rapidez en los medios de comunicación para manejo de líquidos preparación.

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

El objetivo general de este flujo de trabajo iterativo que combina el diseño experimental basado en Kringing y la tecnología de microbiorreactores para un rendimiento de cultivo suficiente es describir un enfoque genérico para el diseño a medida de medios de cultivo microbianos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de bioprocesos microbianos, como la optimización de los medios de cultivo, las condiciones del bioproceso, así como el fenotipado de la cepa. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos preguntamos si los medios de cultivo optimizados para la producción de metabolitos pequeños también eran los más adecuados para la producción de proteínas heterólogas.La principal ventaja de esta técnica es que acelera los tiempos generales de desarrollo mediante una combinación inteligente de experimento y modelado. El encargado de demostrar este procedimiento será Roman Jansen, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Comience este procedimiento con el estudio, la concepción y la definición de los métodos, tal como se detalla en el protocolo de texto.Esterilice placas de pocillos profundos para el almacenamiento de soluciones madre en una mesa de trabajo limpiando las placas con etanol al 70 por ciento y secándolas posteriormente en una campana de flujo laminar. Inicie el cultivo de semillas inoculando 50 mililitros de medio BHI que contenga 25 miligramos por litro de kanamicina con una alícuota del banco de células de trabajo. Coloque todo el material de laboratorio necesario en la mesa de trabajo robótica y vierta las soluciones de stock en el material de laboratorio correspondiente.Luego, inicie el flujo de trabajo robótico para la preparación de los medios de modo que el último paso, que es la inoculación, se alcance a tiempo para el inicio del cultivo de semillas. Muestree el cultivo de semillas después de aproximadamente dos horas para monitorear el crecimiento midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros o O-D-600. Continúe monitoreando el crecimiento a cada hora.Después de aproximadamente cinco horas, el cultivo alcanza un O-D-600 entre tres y cuatro, y se utiliza para inocular los principales cultivos. Coloque el cultivo de semillas en la mesa de trabajo del manipulador de líquidos y continúe con el protocolo de preparación de medios. Sellar las placas de microtitulación de cultivo después de la inoculación.A continuación, coloque el M-T-P de cultivo sellado en el dispositivo Biolector. A continuación, inicie el protocolo de cultivo predefinido. Deseche las soluciones madre restantes de acuerdo con las normas de bioseguridad, si es necesario.A continuación, siembra el cultivo desde la mesa de trabajo robótica. Limpie el material de laboratorio reutilizable antes de iniciar el protocolo de descontaminación del manipulador de líquidos. Detenga la referencia cultural principal después de un tiempo de ejecución de 17 horas y procese los datos como se describe en el protocolo de texto.Para cuantificar el título de G-F-P, primero transfiera las suspensiones celulares de todos los pozos de cultivo a tubos de reacción prelabrados. A continuación, centrifugar las suspensiones celulares durante 10 minutos a velocidad máxima utilizando una centrífuga de sobremesa para obtener el sobrenadante libre de celdas. A continuación, transfiera 200 microlitros de cada sobrenadante libre de células a un M-T-P negro de 96 pocillos con fondo transparente.Lea la fluorescencia específica de G-F-P a 488 nanómetros para la excitación y 520 nanómetros para la longitud de onda de emisión utilizando un lector de microplacas adecuado. Después de medir la fluorescencia G-F-P, la microplaca se puede utilizar directamente para determinar el contenido de proteínas de los sobrenadantes libres de células con protocolos estándar como un ensayo de Bradford o B-C-A. Finalmente, proceda al análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.El procedimiento demostrado constituye una ronda de experimentos, los resultados se utilizan para diseñar rondas posteriores con la máxima mejora esperada de la señal G-F-P. En cada ronda se colocan experimentos de referencia para analizar la variabilidad de los datos y detectar valores atípicos experimentales. Este diagrama de contorno ofrece una visión general del procedimiento de optimización.El análisis del conjunto de datos recopilados a través de la iteración tres reveló una limitación del efecto positivo del magnesio, identificando un rango de concentración óptimo. Por lo tanto, se decidió ampliar aún más el rango de concentración solo para el calcio en la iteración cuatro. El procedimiento se repitió dos veces en la iteración cinco y seis hasta que se encontró una saturación de la señal G-F-P.Esta saturación se explica por la precipitación de sal de calcio para las concentraciones de calcio aplicadas, que no están disponibles para la célula. La séptima iteración se utilizó para explorar los límites con más detalle. Los rangos de concentración óptimos de los componentes del medio para la señal G-F-P saturada se pueden identificar de forma fiable con una prueba Z estadística.Muestra la meseta identificada tal y como se determina y visualiza utilizando la caja de herramientas del kit Kringing. La caja de herramientas del kit Kringing está disponible de forma gratuita y viene con un tutorial detallado que explica cómo usar sus funciones. La naturaleza genérica del protocolo presentado permite diversas adaptaciones, como el estudio de otros huéspedes de expresión microbiana o la optimización de otras propiedades de la proteína objetivo, como el patrón de glicosilación o los enlaces disulfuro.La integración de un sistema de embriones aumenta el rendimiento experimental, lo que permite un gran ahorro de tiempo Al reemplazar biorreactores totalmente controlables e influenciados por sistemas amniares, se debe considerar la escalabilidad de los resultados. El modelado matemático y el diseño de experimentos ayudan a maximizar el contenido de información de los datos de medición con respecto al objetivo estudiado.

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Bioingeniería

Se describe un método para la purificación por afinidad de etiquetado de proteínas recombinantes utilizando robótica de manejo de líquidos. Este método es generalmente aplicable a la purificación a pequeña escala de solubles Su-etiquetados proteínas en un formato de alto rendimiento.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

Fuente: Hemmerich, J., et al. Protocolo para la optimización de la producción de proteínas heterólogas utilizando tecnología automatizada de microbioreadores. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demuestra el uso de un microbioreactor automatizado para monitorizar el crecimiento bacteriano y la secreción de proteínas fluorescentes en respuesta a diferentes formulaciones de medios. Una bacteria genéticamente modificada que expresa una proteína fluorescente secretora se cultiva bajo selección...

Monitorización del crecimiento bacteriano en formulaciones de medios distintos con un microbioractor automatizado

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

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Se diseñó un aparato de cultivo continuo para uso con sistemas de optogenética para iluminar cultivos de microbios y periódicamente celdas de imagen en el efluente con un microscopio invertido. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas a la iluminación pueden ser medidos durante varios días.

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Se presenta un protocolo detallado para la operación concurrente de culturas de célula paralelo 48 bajo variadas condiciones en un sistema de microbioreactor. Proceso de cultivo celular, la cosecha y el análisis del título de anticuerpos posterior se describen.

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Este protocolo detalla los pasos, costos y equipamiento necesario para generar e. coli-basado en extractos celulares e implementar en vitro reacciones de la síntesis de proteína dentro de 4 días o menos. Para aprovechar la naturaleza flexible de esta plataforma para aplicaciones generales, se discuten las condiciones de reacción que pueden ser adaptadas y optimizadas.

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Aquí, presentamos un procedimiento detallado para ejecutar un Diseño de Experimento en un microbiorreactor automatizado seguido de cosecha celular y cuantificación de proteínas usando una columna de Proteína A.

Optimización de procesos mediante microbiorreactores automatizados de alto rendimiento en el cultivo de células de ovario de hámster chino

El control optogenético del metabolismo microbiano ofrece un control dinámico flexible sobre los procesos de fermentación. El protocolo aquí muestra cómo configurar fermentaciones reguladas por luz azul para la producción química y de proteínas a diferentes escalas volumétricas.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Este protocolo proporciona un método para la optimización global sistemática de biosensores codificados genéticamente a través de la generación y evaluación de bibliotecas genéticas asistidas por automatización. Esto se combina con metodologías de diseño de experimentos para agilizar la experimentación y permitir la selección de componentes genéticos para ajustar los biosensores a resultados de diseño específicos.

Muestreo eficiente del espacio de diseño de biosensores codificados genéticamente habilitado con un diseño de experimentos y flujo de trabajo de automatización

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Aprende a optimizar medios de cultivo microbianos mediante diseño experimental Kriging y microbioreactores automatizados. Este protocolo iterativo acelera el desarrollo de bioprocesos para producción de proteínas heterólogas.

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada (Video) | JoVE Journal

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