Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

El objetivo general de este procedimiento es regenerar placas electrónicas comerciales equipadas para un analizador de células en tiempo real (RTCA). Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración de chips desechables a base de oro, incluida la regeneración de planes electrónicos utilizados en RTCA. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de regeneración se puede llevar a cabo utilizando reactivos de laboratorio suaves y fácilmente disponibles con baja toxicidad.

Primero tuvimos la idea de este método cuando comenzamos a usar el Analizador de Células en Tiempo Real, que costaba chips a base de oro. Comience este procedimiento con la incubación y proliferación de células A549 en una placa de cultivo celular como se describe en el protocolo de texto. Agregue 150 microlitros de medio celular a cada pocillo de incubación de la placa electrónica L8. Deje la placa durante 30 minutos en la campana de bioseguridad para mantener el equilibrio.

Después de 30 minutos, inserte manualmente la placa electrónica L8 en el analizador de células en tiempo real en la incubadora de CO2 a 37 grados centígrados. A continuación, inicie el programa de operación Real-Time Cell Analyzer en la computadora. En la página de configuración del patrón de experimento predeterminado, seleccione Modelo de experimento y asigne un nombre al ensayo en ejecución.

En su página de diseño, seleccione los pocillos correspondientes que se incluyen en el experimento e introduzca la información, como el tipo de célula, el número y los nombres de los fármacos, en los cuadros de edición. En su página de programación, agregue los pasos experimentales y, a continuación, seleccione el tiempo de ejecución de cada paso y el intervalo de adquisición de datos en tiempo real. Haga clic en iniciar para medir la impedancia de fondo de los medios.

Se guardará el archivo del experimento. Los datos resultantes se restarán automáticamente. En la página de la gráfica, agregue pozos y se mostrará el gráfico del índice de celda de tiempo.

Para el experimento de proliferación celular, primero haga clic en el botón de pausa para pausar el programa. Luego saque la placa electrónica y agregue 100 microlitros de tampón de suspensión de celda A549 por pocillo a temperatura ambiente. Deje la placa durante 30 minutos en la campana de bioseguridad para que las células se depositen en el fondo de los pocillos de incubación.

Inserte manualmente la placa electrónica en la estación de análisis de celdas en tiempo real. A continuación, haga clic en el botón de inicio para continuar con el experimento. En la página de trazado, el analizador registra continuamente los valores de índice de celda, o curvas, a lo largo del experimento.

Una vez finalizado el experimento, introduzca la página de trazado y abra el archivo del experimento. A continuación, seleccione todos los pocillos de incubación probados y las curvas de índice celular resultantes que se pueden promediar o normalizar por última vez antes de añadir fármacos o cambiar el medio para reducir las variaciones entre ensayos. En la página de análisis de datos, se puede calcular EC50 o IC50.

Después de realizar la evaluación de la citotoxicidad del medicamento contra el cáncer como se describe en el protocolo de texto, saque la placa electrónica que contiene células de la estación Analizador de células en tiempo real. Coloque la placa electrónica usada en una campana de bioseguridad estéril a temperatura ambiente y mezcle bien el medio de cultivo con una pipeta. A continuación, utilice una pipeta para aspirar todo el medio.

Enjuague las placas electrónicas con 200 microlitros de agua desionizada tres veces a temperatura ambiente. Digiera las células restantes en las placas electrónicas con tripsina recién preparada al 0,25% durante una o dos horas en una incubadora a 37 grados centígrados. Cuando se complete la digestión, trabaje en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente para mezclar la solución de incubación de cinco a 10 veces con una pipeta y luego retire la solución.

Enjuague las placas electrónicas con 200 microlitros de agua desionizada dos veces. A continuación, lavar con 200 microlitros de etanol al 100% dos veces, seguidas del mismo volumen de etanol al 75% dos veces. Finalmente, enjuague con otros 200 microlitros de agua desionizada dos veces.

Invierta la placa electrónica sobre una gasa estéril o papel de seda para decantar el agua restante a temperatura ambiente. A continuación, realice la esterilización ultravioleta en la placa electrónica regenerada durante una o dos horas en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente. Después de usar las placas para la administración de fármacos utilizando material mesoporoso como se describe en el protocolo de texto, digiera las células restantes con tripsina como antes.

Como la pipeta se usa con frecuencia en los experimentos, la persona debe tener cuidado para evitar rascar la punta y la superficie de los microchips. Enjuague los microchips con 200 microlitros de agua desionizada una vez en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente. A continuación, eleva los microchips con 200 microlitros de etanol absoluto dos veces a temperatura ambiente.

A continuación, enjuague los microchips con 200 microlitros de etanol al 75% una vez a temperatura ambiente. Agregue 250 microlitros de etanol al 75% en cada pocillo y selle la placa electrónica con la película de sellado a temperatura ambiente. Después de girar la placa electrónica a 114 veces G durante dos minutos, vacíe la placa.

Invierta la placa electrónica sobre una gasa estéril o papel de seda para decantar el líquido restante a temperatura ambiente. Repita los enjuagues de etanol al 75% seguidos del centrifugado. A continuación, realice la esterilización ultravioleta en la placa electrónica regenerada durante una o dos horas en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente.

Evalúe las características ópticas de la superficie de la placa electrónica regenerada desmontando primero la parte inferior del pozo de incubación como se describe en el protocolo de texto. Para evaluar la viabilidad de las células adheridas después de la absorción de fármacos contra el cáncer en las placas electrónicas frescas y regeneradas, utilice un microscopio de barrido láser confocal para controlar la fluorescencia espontánea de las moléculas DOX absorbidas por las células A549. Para registrar la fluorescencia espontánea del DOX absorbido por las células, utilice un objetivo de aceite de 63 veces y 485 nanómetros como longitud de onda de excitación.

A continuación, evalúe los comportamientos electroquímicos de los electrodos regenerados puliendo primero el electrodo de oro y el electrodo de carbono vítreo hasta obtener una superficie similar a un espejo con una suspensión de iluminación en un paño de pulido. A continuación, sonique los electrodos en agua para eliminar cualquier partícula. A continuación, active el electrodo de oro en ácido sulfúrico 0,5 molar.

Obtenga datos de espectroscopía de impedancia electroquímica, o EIS, del electrodo de oro desnudo y el electrodo de carbono vítreo en una solución de electrolito de cloruro de potasio de 10 milimolares, que contiene un feracianuro de potasio milimolar. Ahora, deje caer 10 microlitros de una suspensión de celda en la superficie del electrodo de oro en el GCE. Después de agregar las celdas, incube el electrodo de oro en el GCE en una incubadora a 37 grados Celsius durante tres horas antes de obtener los datos EIS de los electrodos modificados con celdas, como se describe en el protocolo de texto.

Para regenerar los electrodos, sumerja el electrodo de oro en el GCE modificado con celdas en tripsina al 0,25% durante 0,5 a dos horas. Enjuague ambos electrodos suavemente con agua cuatro veces. Luego, enjuague los electrodos suavemente con etanol absoluto cuatro veces.

A continuación, sumerja el electrodo de oro en el GCE en etanol al 75% durante aproximadamente cinco minutos. Después de cinco minutos, enjuague el chip suavemente con etanol al 75% cuatro veces antes de obtener los datos EIS de los electrodos regenerados, como se describe en el protocolo de texto. Para evaluar la eficiencia de regeneración de la placa electrónica de oro en orden, se realizaron observaciones microscópicas tanto para placas electrónicas frescas como tratadas.

No se encontraron diferencias virtuales en las propiedades ópticas de la superficie del microchip. La troescencia de las moléculas de doxorrubicina se utiliza para evaluar el estado celular en los microchips de oro antes y después de la regeneración. La homogeneidad similar y la morfología celular bien definida demostraron la reutilización de los chips.

El protocolo de regeneración se aplica para la prueba real de la proliferación celular. Las curvas de crecimiento obtenidas de múltiples pocillos de incubación de una placa electrónica probada muestran una buena consistencia, lo que indica la regeneración exitosa del chip comercial. En la imagen, la placa electrónica regenerada L8 se probó para la evaluación de la citotoxicidad utilizando materiales de sílice mesoporosa.

El índice celular de la muestra tratada con materiales mesoporosos disminuyó en comparación con el control, lo que indica una ligera citotoxicidad de los materiales. La encapsulación y liberación adicional del fármaco anticancerígeno doxorrubicina por materiales mesoporosos causó una disminución drástica en la curva de crecimiento de las células A549. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tipo de tiempo de digestión del sumidero puede diferir de una viruta a otra. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de escaneo láser confocal, o incluso la espectroscopia, la espectroscopia de impedancia electroquímica para responder preguntas adicionales como la evaluación del efecto de regeneración.