Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

El objetivo general de este procedimiento es regenerar placas electrónicas comerciales preparadas para un Analizador en Tiempo Real de Células, o RTCA. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración de chips desechables basados en oro, incluyendo la regeneración de placas electrónicas utilizadas en RTCA. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de regeneración puede realizarse utilizando reactivos de laboratorio suaves, fácilmente disponibles y de baja toxicidad.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando comenzamos a utilizar el Analizador de Células en Tiempo Real, que tiene un costo elevado debido a sus chips basados en oro. Inicie este procedimiento con la incubación y proliferación de células A549 en una placa de cultivo celular, tal como se describe en el protocolo escrito. Añada 150 microlitros de medio celular a cada pocillo de incubación de la placa electrónica L8. Deje la placa durante 30 minutos en la cabina de seguridad biológica para su equilibrio.

Después de 30 minutos, inserte manualmente la placa electrónica L8 en el Analizador de Células en Tiempo Real dentro del incubador de CO₂ a 37 grados Celsius. A continuación, inicie el programa de operación del Analizador de Células en Tiempo Real en la computadora. En la página de configuración predeterminada del modelo de experimento, seleccione Modelo de Experimento y asigne un nombre al ensayo en curso.

En su página de diseño, seleccione los pocillos correspondientes que están incluidos en el experimento e ingrese la información, como el tipo celular, el número y los nombres de los fármacos, en los cuadros de edición. En su página de programación, agregue los pasos experimentales y luego seleccione el tiempo de ejecución de cada paso y el intervalo de adquisición de datos en tiempo real. Haga clic en iniciar para medir la impedancia de fondo del medio.

Se guardará el archivo del experimento. Los datos resultantes se restarán automáticamente. En la página del gráfico, agregue pozos y se mostrará el gráfico de tiempo-índice celular.

Para el experimento de proliferación celular, primero haga clic en el botón de pausa para detener el programa. Luego retire la placa electrónica y agregue 100 microlitros de tampón de suspensión de células A549 por pocillo a temperatura ambiente. Deje la placa durante 30 minutos en la cabina de seguridad biológica para permitir que las células sedimenten en el fondo de los pocillos de incubación.

Inserte manualmente la placa electrónica en la estación del analizador celular en tiempo real. Luego, haga clic en el botón de inicio para continuar el experimento. En la página de gráficos, el analizador registra continuamente los valores del índice celular, o curvas, durante todo el experimento.

Una vez finalizado el experimento, ingrese a la página de gráficos y abra el archivo del experimento. Luego, seleccione todos los pocillos de incubación analizados y las curvas resultantes del índice celular que puedan promediarse o normalizarse por última vez antes de añadir fármacos o cambiar el medio, con el fin de reducir las variaciones entre los ensayos. En la página de análisis de datos, se puede calcular la CE50 o la CI50.

Después de realizar la evaluación de citotoxicidad del fármaco anticancerígeno según se describe en el protocolo del texto, retire la placa electrónica que contiene las células de la estación de Analizador de Células en Tiempo Real. Coloque la placa electrónica usada en una campana de seguridad biológica estéril a temperatura ambiente y mezcle completamente el medio de cultivo utilizando una pipeta. Luego, use una pipeta para aspirar todo el medio.

Lave las placas electrónicas con 200 microlitros de agua desionizada durante tres veces a temperatura ambiente. Diga las células restantes en las placas electrónicas con tripsina recién preparada al 0,25 % durante una a dos horas en un incubador a 37 grados Celsius. Cuando la digestión haya finalizado, trabaje en la cabina de seguridad biológica a temperatura ambiente, mezclando la solución de incubación de cinco a 10 veces mediante una pipeta y luego retire la solución.

Lave las placas electrónicas con 200 microlitros de agua desionizada dos veces. Luego, lave con 200 microlitros de etanol al 100 % dos veces, seguido del mismo volumen de etanol al 75 % dos veces. Finalmente, enjuague con otros 200 microlitros de agua desionizada dos veces.

Dar la vuelta a la placa electrónica sobre una gasa estéril o papel de filtro para decantar el agua restante a temperatura ambiente. A continuación, realizar la esterilización con luz ultravioleta sobre la placa electrónica regenerada durante una a dos horas en la cabina de seguridad biológica a temperatura ambiente. Después de usar las placas para la administración de fármacos utilizando material mesoporoso según se describe en el protocolo del texto, digerir las células restantes con tripsina como antes.

Dado que la pipeta se utiliza frecuentemente en los experimentos, la persona debe tener cuidado para evitar rayar la punta y la superficie de los microchips. Enjuague los microchips con 200 microlitros de agua desionizada una vez en la cabina de seguridad biológica a temperatura ambiente. Luego, enjuague los microchips con 200 microlitros de etanol absoluto dos veces a temperatura ambiente.

A continuación, lave los microchips con 200 microlitros de etanol al 75 % una vez a temperatura ambiente. Añada 250 microlitros de etanol al 75 % en cada pocillo y selle la placa electrónica con la película sellante a temperatura ambiente. Después de centrifugar la placa electrónica a 114 × g durante dos minutos, vacíe la placa.

Invierta la placa electrónica sobre una gasa estéril o papel de tejido para decantar el líquido restante a temperatura ambiente. Repita los lavados con etanol al 75 % seguidos de la centrifugación. Luego, realice la esterilización con luz ultravioleta en la placa electrónica regenerada durante una a dos horas en la cabina de seguridad biológica a temperatura ambiente.

Evalúe las características ópticas de la superficie regenerada de la placa electrónica desmontando primero la parte inferior del pozo de incubación, como se describe en el protocolo escrito. Para evaluar la viabilidad de las células adheridas tras la absorción del fármaco anticancerígeno en placas electrónicas nuevas y regeneradas, utilice un microscopio confocal de barrido láser para monitorear la fluorescencia espontánea de las moléculas de DOX absorbidas por las células A549. Para registrar la fluorescencia espontánea del DOX absorbido por las células, use un objetivo de inmersión en aceite de 63 aumentos y una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros.

A continuación, evalúe los comportamientos electroquímicos de los electrodos regenerados puliendo primero el electrodo de oro y el electrodo de carbono vítreo hasta obtener una superficie similar a un espejo, utilizando una suspensión abrasiva sobre un paño de pulido. Luego, someta los electrodos a sonicación en agua para eliminar cualquier partícula. A continuación, active el electrodo de oro en ácido sulfúrico 0,5 molar.

Obtenga datos de espectroscopía de impedancia electroquímica, o EIS, del electrodo de oro desnudo y del electrodo de carbono vítreo en una solución electrolítica de cloruro de potasio 10 milimolar, que contenga ferricianuro de potasio 1 milimolar. A continuación, agregue 10 microlitros de una suspensión celular sobre la superficie del electrodo de oro en el ECv. Después de añadir las células, incube el electrodo de oro en el ECv en un incubador a 37 grados Celsius durante tres horas antes de obtener los datos de EIS de los electrodos modificados con células, como se describe en el protocolo del texto.

Para regenerar los electrodos, sumerja el electrodo de oro en el GCE modificado con células en tripsina al 0,25 % durante 0,5 a dos horas. Enjuague ambos electrodos suavemente con agua cuatro veces. Luego, enjuague los electrodos suavemente con etanol absoluto cuatro veces.

A continuación, sumerja el electrodo de oro en el GCE en etanol al 75 % durante aproximadamente cinco minutos. Después de cinco minutos, enjuague suavemente el chip con etanol al 75 % cuatro veces antes de obtener los datos de EIS de los electrodos regenerados, como se describe en el protocolo del texto. Para evaluar la eficiencia de regeneración de la placa electrónica de oro dispuesta en matriz, se realizaron observaciones microscópicas tanto en placas electrónicas nuevas como tratadas.

No se encontró diferencia apreciable en las propiedades ópticas de la superficie del microchip. Se utiliza la fluorescencia de las moléculas de doxorrubicina para evaluar el estado celular en los microchips de oro antes y después de la regeneración. La homogeneidad similar y la morfología celular bien definida demostraron la reutilización de los chips.

El protocolo de regeneración se aplica para la prueba real de proliferación celular. Las curvas de crecimiento obtenidas a partir de múltiples pocillos de incubación de una placa electrónica analizada muestran una buena consistencia, lo que indica la regeneración exitosa del chip comercial. Aquí se muestra la evaluación de citotoxicidad realizada con la placa electrónica regenerada L8 utilizando materiales de sílice mesoporosa.

El índice celular de la muestra tratada con materiales mesoporosos disminuyó en comparación con el control, lo que indica una ligera citotoxicidad de los materiales. La encapsulación adicional y la liberación del fármaco anticancerígeno doxorrubicina mediante materiales mesoporosos provocaron una disminución drástica en la curva de crecimiento de las células A549. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tiempo de digestión del sumidero de tipo puede variar de un chip a otro. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como microscopía confocal de barrido láser, o incluso espectroscopía, espectroscopía de impedancia electroquímica, con el fin de responder preguntas adicionales, como la evaluación del efecto de regeneración.