RGB y la proyección de imagen espectral raíz planta Phenotyping y investigación fisiológica: montaje Experimental y protocolos de la proyección de imagen

El objetivo general de este procedimiento es obtener información completa sobre las raíces de las plantas que crecen en rizocajas llenas de tierra mediante la combinación de diferentes métodos de imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del fenotipado y la mejora de plantas, como la contribución de diferentes arquitecturas radiculares a una mejor resistencia al estrés abiótico. La principal ventaja de este enfoque es que combina imágenes RGB para la arquitectura raíz e imágenes hiperespectrales para la funcionalidad raíz.

El potencial del uso de imágenes hiperespectrales para las raíces se extiende hacia una amplia gama de parámetros de la rizosfera porque la información espectral puede revelar cambios fisicoquímicos a pequeña escala introducidos por las raíces de las plantas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de llenado de la caja de rizo deben realizarse con cuidado. De lo contrario, el crecimiento y la visibilidad de las raíces se verán afectados negativamente.

Comience este procedimiento con la preparación de las rizocajas para el relleno del sustrato como se detalla en el protocolo de texto. Humedecer previamente el suelo seco hasta obtener un contenido gravimétrico de agua de 0,108 gramos por gramo añadiendo 400 gramos de agua para obtener 3.705 gramos de suelo seco. Mezcle la tierra y el agua suavemente para obtener una distribución homogénea del agua.

Interrumpa manualmente los agregados más grandes para mantener el tamaño de partícula menor o igual a dos milímetros. Es fundamental obtener una capa homogénea de suelo junto a la ventana de observación de gas, evitando los espacios de aire. Las puntas de las raíces de las plantas se deshidratan rápidamente, creciendo en espacios de aire.

Además, la calidad de la imagen espectral para el mapeo del agua se ve afectada negativamente. Llene la tierra prehumedecida en las rizocajas abiertas y compacte suavemente con una lámina de poliestireno para cubrir el volumen interior de la caja, lo que da como resultado una densidad aparente homogénea de 1,3 gramos por centímetro cúbico. Agregue la cantidad restante de agua para lograr el contenido de agua objetivo de 0,31 centímetros cúbicos por centímetro cúbico rociando sobre la superficie con una botella rociadora.

Asegure un tamaño de gota pequeño para evitar la degradación de la estructura de la superficie, así como una humectación homogénea. Mantenga la caja en equilibrio durante la pulverización para controlar la cantidad de agua que realmente se agrega al sustrato. Deje que el agua se redistribuya durante 10 minutos y luego presione el vidrio sobre la superficie y fíjelo con los rieles metálicos laterales.

El peso final promedio de las rizocajas con sustrato mojado fue de 17.818 más o menos 68 gramos. Equipe la sala climática con ocho lámparas LED que proporcionan una iluminación homogénea de 450 micromoles por metro cuadrado por segundo con picos espectrales de 440 y 660 nanómetros para un crecimiento óptimo de las plantas. Después de configurar los parámetros ambientales de acuerdo con las necesidades de la planta y del experimento, cubra la ventana de vidrio con una placa de madera para mantener la zona de la raíz a oscuras y evitar el crecimiento de algas debido a la luz que penetra a través de la superficie del vidrio.

Luego coloque las rizocajas a una inclinación de 45 grados usando un marco metálico adecuado. Esto maximiza el crecimiento de las raíces hacia la superficie del vidrio debido al gravitropismo. Para obtener imágenes RGB de la raíz, ilumine la rizobox con cuatro tubos de luz fluorescente de 24 vatios conectados a una distancia de 80 centímetros de la rhizobox.

También monte cuatro tubos UV de 15 vatios a 20 centímetros de la iluminación alternativa de la rizobox, haciendo uso de la autofluorescencia de la raíz en caso de bajo contraste entre la raíz y el fondo del sustrato de color brillante. Encienda las lámparas UV y luego monte la caja de rizo que se va a fotografiar en el soporte de la caja de imágenes. A continuación, tome dos imágenes para cubrir la mitad superior e inferior de una rizocaja con una superposición de unos tres centímetros.

Adquiera y procese las imágenes RBG como se detalla en el protocolo de texto. Por último, ejecute el análisis de las imágenes raíz RBG adquiridas y, posteriormente, controle si hay regiones que no coinciden. En este caso, defina una región de exclusión y reinicie el análisis.

En el caso de las raíces no clasificadas, agregue clases de color adicionales y reinicie el análisis. Para los elementos clasificados erróneamente como raíces, active o aumente las opciones de filtrado de escombros y bordes rugosos. Realice la adquisición de imágenes determinando primero los tiempos de integración de la cámara para el escaneo de rizobox y el estándar de blanco en el software de la cámara.

Para ello, abra la interfaz gráfica de usuario de imágenes y mueva la cámara a una posición de la caja rizada donde haya raíces. Ajuste el tiempo de integración de la cámara apuntando a un objeto ligero de manera que aproximadamente el 85% del rango dinámico completo de la cámara se utilice en el histograma mostrado por el software. Establecer correctamente el tiempo de integración para diferentes sustratos y tejidos radiculares es fundamental para aprovechar al máximo el rango dinámico de la cámara infrarroja evitando cualquier pérdida de información al exceder su rango.

Repita el proceso para el estándar blanco moviendo el sistema de posicionamiento de la cámara para apuntar al estándar blanco antes de cerrar el software de la cámara. A continuación, abra la GUI de imágenes de Matlab e ingrese todas las configuraciones del escaneo de rhizobox actual. Adquiera los estándares de blanco y oscuro antes de cada ejecución de imágenes una vez al día.

El estándar oscuro representa el ruido de la cámara, mientras que el estándar blanco proporciona la máxima reflectividad. Estos datos son necesarios para la normalización de la imagen durante el preprocesamiento. Defina si se escanea toda la caja rizada o solo una parte de ella.

Para el presente caso, se obtienen imágenes de rizocajas enteras. A continuación, inicie el escaneo. Para la medición espectral del contenido de agua, se necesita una caja de caldera.

Subdivida una caja de rizo en compartimentos de cinco centímetros usando láminas de poliestireno para llenarlos con tierra con diferentes contenidos de agua. Escanee la rizobox de calibración con la misma configuración que se utilizó para las rizoboxes plantadas. Como ejemplo, para combinar los rasgos de la raíz y sobre el suelo, obtenga el porómetro de la hoja para medir la conductancia de los estomas.

Equilibre el dispositivo a las condiciones ambientales durante al menos una hora en la cámara climática. Tome medidas de al menos tres hojas por planta. Aquí se muestra una imagen representativa del crecimiento de la raíz del cultivar de remolacha azucarera, Ferrara, basada en imágenes RGB.

A los 35 días después de la siembra, las raíces de la planta se han alargado hasta llegar al fondo de la rizocaja. Algunos ejes de raíz en la parte superior de la caja de rizo no se pudieron segmentar a partir de imágenes RGB. La senescencia de las raíces basales más viejas cambia su color a marrón.

Por lo tanto, falla la separación entre estas raíces y el fondo del suelo en función de un umbral de color. Mediante el uso de imágenes hiperespectrales, la segmentación se basa en diferentes características espectrales del primer plano de la raíz y el fondo del suelo. Esto mejora el resultado de la segmentación.

Las diferencias en la longitud de la raíz medida con respecto a una imagen de referencia rastreada manualmente son solo del 1,5%Además, las imágenes espectrales permiten un mapeo preciso del contenido de agua alrededor de la raíz para inferir la absorción de agua. Aquí están los esqueletos de la raíz que se muestran en negro. Las áreas más claras muestran regiones de mayor agotamiento de agua cerca de los ejes de las raíces.

Mientras que las áreas azules más oscuras representan regiones con mayor contenido de agua del suelo fuera del alcance de las raíces. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llenar correctamente las rizocajas para garantizar un crecimiento y una visibilidad satisfactorios de las raíces. Esta es la base para la obtención de imágenes posteriores y los resultados representativos del fenotipado de la raíz.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para la clasificación espectral, como la agrupación de K-medias o las máquinas de vectores de soporte, para obtener información detallada sobre las propiedades de la raíz y la rizosfera, como la senescencia y la descomposición de la raíz. Una vez establecida, esta técnica permite fenotipar de forma integral los sistemas radiculares y la respuesta al estrés abiótico. Se puede caracterizar un conjunto de 10 cultivares con una duración experimental total de menos de tres meses.