RGB y la proyección de imagen espectral raíz planta Phenotyping y investigación fisiológica: montaje Experimental y protocolos de la proyección de imagen
8 de agosto de 2017
Se presenta un protocolo experimental para la evaluación de suelo cultivado planta raíz sistemas RGB y la proyección de imagen hyperspectral. Combinación de tiempo de imagen RGB serie con información quimiométricas de hyperspectral optimiza penetraciones en la dinámica de la raíz de planta.
El objetivo general de este procedimiento es obtener información exhaustiva sobre las raíces de las plantas que crecen en rizocajas llenas de suelo, combinando diferentes métodos de obtención de imágenes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del fenotipado y mejoramiento vegetal, como la contribución de diferentes arquitecturas radiculares a una mayor resistencia al estrés abiótico. La principal ventaja de este enfoque es que combina la obtención de imágenes RGB para la arquitectura radical y la obtención de imágenes hiperspectrales para la funcionalidad de las raíces.
El potencial del uso de la imagen hiperespectral para raíces se extiende hacia una amplia gama de parámetros del rizosfera, ya que la información espectral puede revelar cambios fisicoquímicos a pequeña escala introducidos por las raíces de las plantas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de llenado del rizocaja deben realizarse con cuidado. De lo contrario, el crecimiento de las raíces y su visibilidad se verán negativamente afectados.
Comience este procedimiento con la preparación de las cajas radiculares para el llenado del sustrato, tal como se describe en el protocolo escrito. Humedezca previamente el suelo seco hasta alcanzar un contenido gravimétrico de agua de 0,108 gramos por gramo, agregando 400 gramos de agua por cada 3.705 gramos de suelo seco. Mezcle suavemente el suelo y el agua para obtener una distribución homogénea del agua.
Disgregar manualmente los agregados más grandes para mantener el tamaño de partícula menor o igual a dos milímetros. Es fundamental obtener una capa homogénea de suelo junto a la ventana de observación de gas, evitando huecos de aire. Las puntas de las raíces de las plantas se deshidratan rápidamente al crecer hacia los huecos de aire.
Además, la calidad de la imagen espectral para la cartografía del agua se ve afectada negativamente. Llene las cajas radiculares abiertas con el suelo previamente humedecido y compáctelo suavemente utilizando una lámina de poliestireno para cubrir el volumen interno de la caja, logrando así una densidad aparente homogénea de 1,3 gramos por centímetro cúbico. Añada la cantidad restante de agua para alcanzar el contenido hídrico objetivo de 0,31 centímetros cúbicos por centímetro cúbico rociándola sobre la superficie con una botella pulverizadora.
Asegúrese de un tamaño pequeño de gota para evitar la degradación de la estructura superficial, así como un mojado homogéneo. Mantenga la caja sobre una balanza durante la pulverización para monitorear la cantidad de agua que se agrega realmente al sustrato. Deje que el agua se redistribuya durante 10 minutos y luego presione el vidrio contra la superficie y fíjelo con los rieles metálicos laterales.
El peso final promedio de las cajas de rizosfera con sustrato humedecido fue de 17.818 ± 68 gramos. Equipe la cámara climática con ocho lámparas LED que proporcionen una iluminación homogénea de 450 micromoles por metro cuadrado por segundo, con picos espectrales a 440 y 660 nanómetros, para un crecimiento óptimo de las plantas. Después de ajustar los parámetros ambientales según las necesidades de la planta y del experimento, cubra la ventana de vidrio con una placa de madera para mantener la zona radicular en la oscuridad y evitar el crecimiento de algas debido a la penetración de luz a través de la superficie de vidrio.
Luego coloque las cajas radiculares en una inclinación de 45 grados utilizando un marco metálico adecuado. Esto maximiza el crecimiento de las raíces hacia la superficie de vidrio debido a la gravitropismo. Para la imagenología RGB de raíces, ilumine la caja radicular utilizando cuatro tubos fluorescentes de 24 vatios colocados a una distancia de 80 centímetros de la caja radicular.
Además, monte cuatro tubos UV de 15 vatios a 20 centímetros del sistema de iluminación alternativa del rizocaja, aprovechando la autofluorescencia de las raíces en caso de bajo contraste entre la raíz y el fondo del sustrato de color brillante. Encienda las lámparas UV y luego coloque el rizocaja que se va a capturar en el soporte del caja de imagen. A continuación, tome dos imágenes para cubrir la mitad superior e inferior de un rizocaja con una superposición de aproximadamente tres centímetros.
Adquiera y procese las imágenes RGB según se describe en el protocolo escrito. Finalmente, realice el análisis de las imágenes adquiridas de las raíces en RGB y posteriormente verifique si existen regiones que no coincidan. En ese caso, defina una región de exclusión y reinicie el análisis.
Para raíces no clasificadas, agregue clases de color adicionales y reinicie el análisis. Para elementos clasificados erróneamente como raíces, active o aumente las opciones de filtrado de residuos y bordes irregulares. Realice la adquisición de imágenes determinando primero los tiempos de integración de la cámara para el escaneo del rizocaja y el estándar blanco en el software de la cámara.
Para ello, abra la interfaz gráfica de usuario de imagen y mueva la cámara a una posición del rizocaja donde haya raíces. Ajuste el tiempo de integración de la cámara apuntando a un objeto iluminado de forma que aproximadamente el 85 % del rango dinámico completo de la cámara se utilice en el histograma mostrado por el software. Establecer correctamente el tiempo de integración para diferentes sustratos y tejidos radiculares es fundamental para aprovechar al máximo el rango dinámico de la cámara infrarroja, evitando cualquier pérdida de información al exceder su rango.
Repita el proceso para el estándar blanco moviendo el sistema de posicionamiento de la cámara para enfocar el estándar blanco antes de cerrar el software de la cámara. A continuación, abra la interfaz gráfica de usuario de imágenes en Matlab e introduzca todos los ajustes del escaneo actual del rizobox. Adquiera los estándares oscuro y blanco antes de cada sesión de imagen, una vez al día.
El estándar oscuro representa el ruido de la cámara, mientras que el estándar blanco proporciona la reflectividad máxima. Estos datos son necesarios para la normalización de imágenes durante el preprocesamiento. Defina si se escanea todo el rizobox o solo una parte de él.
Para el caso presente, se toman imágenes de rizocajas completas. Luego inicie el escaneo. Para la medición espectral del contenido de agua, se necesita una rizocaja de calibración.
Subdivida una caja de rizosfera en compartimentos de cinco centímetros utilizando láminas de poliestireno para llenarlos con suelo a diferentes contenidos de agua. Escanee la caja de rizosfera de calibración con los mismos ajustes utilizados para las cajas de rizosfera plantadas. Como ejemplo, para combinar características de raíces y partes aéreas, obtenga el porómetro foliar para la medición de la conductancia estomática.
Equilibre el dispositivo a las condiciones ambientales durante al menos una hora en la cámara climática. Tome mediciones de al menos tres hojas por planta. Aquí se muestra una imagen representativa del crecimiento de la raíz de la variedad de remolacha azucarera Ferrara, basada en imágenes RGB.
A los 35 días después de la siembra, las raíces de la planta se han alargado hasta alcanzar la base de la caja radicular. Algunos ejes radiculares en la parte superior de la caja radicular no pudieron segmentarse a partir de las imágenes RGB. La senescencia de las raíces basales más viejas cambia su color a marrón.
Por lo tanto, la separación entre estas raíces y el fondo del suelo basada en un umbral de color falla. Mediante el uso de imágenes hiperspectrales, la segmentación se basa en diferentes características espectrales del primer plano de la raíz y del fondo del suelo. Esto mejora el resultado de la segmentación.
Las diferencias en la longitud de la raíz medida respecto a una imagen de referencia rastreada manualmente son solo del 1,5 %. Además, la imagen espectral permite un mapeo detallado del contenido de agua alrededor de la raíz para inferir la absorción de agua. Aquí, el esqueleto de la raíz se muestra en negro. Las áreas más claras indican regiones con mayor agotamiento de agua cerca de los ejes de la raíz.
Mientras que las zonas más oscuras de color azul representan regiones con mayor contenido de agua en el suelo fuera del alcance de las raíces. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llenar adecuadamente las cajas rizosféricas para garantizar un crecimiento radicular satisfactorio y una buena visibilidad. Esto constituye la base para obtener posteriormente imágenes y resultados representativos de fenotipificación radical.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos de clasificación espectral, como agrupamiento K-medias o máquinas de vectores de soporte, para obtener información detallada sobre las propiedades de las raíces y la rizosfera, como la senescencia y descomposición de las raíces. Una vez establecida, esta técnica permite fenotipar de forma integral los sistemas radiculares y la respuesta al estrés abiótico. Un conjunto de 10 cultivares puede caracterizarse con una duración experimental total de menos de tres meses.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para evaluar sistemas de raíces de plantas cultivadas en suelo mediante imágenes RGB e hiperespectrales. La combinación de estos métodos de imagen proporciona información sobre la dinámica y la arquitectura de las raíces de las plantas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fenotipificación vegetal
- Arquitectura de la raíz
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- Comprender los sistemas radiculares es fundamental para mejorar el mejoramiento vegetal.
- Diferentes arquitecturas radiculares contribuyen a la resistencia al estrés abiótico.
- La imagen hiperespectral puede revelar cambios fisicoquímicos en la rizosfera.
- La preparación cuidadosa de las cajas rizosféricas es esencial para obtener imágenes precisas.
Objetivo del estudio
- Obtener información completa sobre las raíces de las plantas en rizocajas llenas de suelo.
- Combinar imágenes RGB e hiperespectrales para un análisis mejorado.
- Responder preguntas clave en fenotipado y mejora vegetal.
Métodos Utilizados
- Preparación de cajas radiculares con suelo prehumedecido.
- Imagen RGB para la evaluación de la arquitectura radical.
- Imagen hiperespectral para analizar la funcionalidad de las raíces.
- Calibración de los ajustes de imagen para una adquisición precisa de datos.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de sistemas radiculares mediante técnicas combinadas.
- Identificación de las condiciones óptimas para la visibilidad de las raíces.
- Conocimientos sobre la relación entre la arquitectura radicular y la resistencia al estrés.
- Demuestra la eficacia del método en un ambiente controlado.
Conclusiones
- El enfoque combinado de imágenes mejora la comprensión de la dinámica de las raíces.
- La metodología puede aplicarse a diversas especies vegetales para la investigación.
- Estudios futuros pueden basarse en estos hallazgos para mejorar las estrategias de mejora vegetal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La fenotipificación del sistema radicular proporciona información crítica para los programas de mejora de cultivos dirigidos a la tolerancia al estrés abiótico y a la eficiencia en el uso de recursos. La combinación de imágenes RGB e hiperespectrales permite la evaluación simultánea de la arquitectura radical y de las propiedades funcionales de la rizosfera, apoyando la validación temprana de objetivos en la biotecnología agrícola. Este enfoque integrado mejora la confianza predictiva al relacionar rasgos subterráneos con el desempeño fenotípico bajo condiciones de estrés.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis sobre la arquitectura radical relacionadas con la resistencia a la sequía y la eficiencia en la absorción de nutrientes.
- Valor operativo: Proporciona métricas cuantitativas y no destructivas para el desarrollo del sistema radical a lo largo del tiempo en sistemas basados en suelo.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Los datos hiperspectrales mejoran la precisión en la segmentación raíz-suelo, reduciendo los falsos negativos en la cuantificación de rasgos radiculares.
- Valor operativo: Permite protocolos de imagen estandarizados y reproducibles para plataformas de fenotipado radicular de alto rendimiento.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Permite la correlación de los patrones de absorción de agua por las raíces con las respuestas fisiológicas aéreas bajo estrés controlado.
- Valor operativo: Facilita la continuidad traslacional desde el fenotipado de descubrimiento hasta la modelización de la respuesta al estrés con relevancia de campo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método respalda los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos estructurales y funcionales de las raíces que informan la selección de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las líneas de desarrollo de características en cultivos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis sobre la arquitectura del sistema radical y su contribución a fenotipos de resistencia al estrés.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y estandarizados de morfología radical y espectros adecuados para la validación de ensayos.
- Análisis: Ofrece datos quimiométricos y mapas de contenido de agua para la asociación de rasgos funcionales y análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Conecta los resultados de imágenes radiculares con respuestas fisiológicas del conjunto de la planta, apoyando la continuidad hacia la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imágenes reutilizable aplicable a múltiples especies de cultivos y escenarios de estrés.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la vinculación de rasgos radiculares con la tolerancia al estrés abiótico mediante fenotipado multimodal.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y escalabilidad del análisis de imágenes radiculares entre lotes experimentales y laboratorios.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en el avance de rasgos al permitir la detección temprana de fenotipos radiculares desfavorables.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización basada en datos de cultivares de cultivos según el rendimiento validado del sistema radicular bajo estrés.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en fisiología vegetal, sistemas de imagen y análisis de datos espectrales para la ejecución del protocolo.
- Los equipos necesarios incluyen cámaras RGB, sensores hiperspectrales, iluminación controlada y cámaras ambientales.
- La estandarización entre equipos exige una preparación consistente de los rizocajas, configuraciones de iluminación y parámetros de adquisición de imágenes.
- La adaptación a diferentes tipos de suelo o arquitecturas radiculares puede requerir ajustes en los umbrales de segmentación y en los protocolos de calibración.
- Las limitaciones prácticas incluyen tiempos más largos de adquisición y procesamiento para los datos hiperspectrales en comparación con la imagen RGB.
