Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas libres de huella, o IPSC, a partir de células pancreáticas humanas en condiciones libres de células alimentadoras, luego editar las células utilizando ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 y finalmente caracterizar los clones monoclonales modificados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la edición del genoma de células madre humanas, como la generación de IPSC libres de huella y la edición con ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9. La ventaja principal de esta técnica es que se pueden generar líneas clonales de IPSC editadas con alta fiabilidad y no hay evidencia de mosaicismo.

Después de recubrir una placa de seis pocillos con colágeno frío, siembre células pancreáticas primarias humanas de bajo pase en medio Prigrow III el día 2 para alcanzar aproximadamente 2,5 x 10⁵ células o al menos un 60 % de confluencia por pocillo el día de la transducción o día cero. El día de la transducción, tras cosechar y contar las células según el protocolo descrito en el texto, descongele en hielo un conjunto de tubos de vector Sendai y agregue cuidadosamente los volúmenes calculados de cada tubo a 1 mL de medio Prigrow III precalentado. Pipetee suavemente para mezclar la solución.

Aspire el Prigrow III de las células y agregue lentamente la mezcla del virus de reprogramación a los pocillos. A continuación, incube las células en un incubador a 37 grados Celsius durante la noche. Veinticuatro horas después de la transducción, deseche cuidadosamente la mezcla de virus de las células y sustitúyala por medio fresco Prigrow III.

El sexto día, agregue 1 mL de solución de disociación celular a las células e incúbelas durante 10 minutos. Luego, utilizando Prigrow III con inhibidor de rock, siembre todas las células en placas de MEF preparadas el día anterior. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche.

Observe regularmente las placas en busca de la aparición de agregados celulares o colonias indicativas de células reprogramadas, las cuales formarán agregados clonales con una morfología tipo adoquín, un núcleo grande y nucleolos prominentes. Marque las colonias probables de iPSC y revíselas regularmente para evaluar su crecimiento. Casi cuatro semanas después de la transducción, tras preparar las placas de MEF de 24 pocillos, prepare la membrana matriz alícuotando según el factor de dilución indicado en el certificado de análisis.

Seleccione 24-48 colonias y transfiéralas a placas de 24 pocillos recubiertas con membrana matriz y mTeSR1. Incube las placas durante 24 horas y cambie el medio cada día. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles.

Añada 500 mcL de dispasa para separar las colonias robustas sembradas sobre la membrana matricial. Después de incubar las células durante 20 minutos, vuelva a sembrarlas en placas de 12 pocillos recubiertas con membrana matricial. Amplifique y caracterice los clones mediante tinción de fosfatasa alcalina, tinción inmunológica y análisis por FACS según el protocolo descrito en el texto.

Para transfectar las HIPSC después de sintetizar las SGRNA según el protocolo descrito en el texto, prepare una mezcla maestra de nucleofección para cada muestra combinando 0,5 mcg de proteína Cas9 y 0,5 mcg de cada SGRNA en un volumen de reacción de 22 mcL. Después de aspirar el medio que contiene el inhibidor de rock, use 2 mL de RTPBS para lavar cada pocillo de las ISPC. Luego aspire el PBS y agregue 1 mL de solución de desprendimiento celular.

Incube la placa a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Reuspenda las células en 3 mL de medio mTeSR1 y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de medio mTeSR1.

Al mezcla maestra de nucleofección, añada 16,4 µL del suplemento para células primarias P3 y 3,6 µL del suplemento uno del kit Nucleofector. Después de contar y centrifugar las células, re suspenda cada unidad de 0,5 x 10⁶ células en 22 µL de la mezcla maestra de transfección previamente preparada. Transfiera rápidamente las células al compartimento central de un pocillo de una tira Nucleocuvette.

Luego, coloque la tira en un dispositivo Nucleofector y nucleofecte las células utilizando el programa CB150. Tras la nucleofección, agregue rápidamente 80 mcL de medio mTeSR1 precalentado que contenga 10 micromolar de inhibidor de rock a cada pocillo de las células nucleofectadas. Mezcle suavemente aspirando y expulsando con una pipeta.

Transfiera suavemente las células desde la tira a los pocillos de una placa de 12 pocillos recubierta con matriz de membrana que contenga medio mTeSR1 con inhibidor de ROCK. En el segundo día de incubación tras preparar las placas de MEF, sustituya el medio de los HIPSC del mTeSR1 al mTeSR1 suplementado con 1XSMC4 durante al menos dos horas antes de la clasificación de células individuales. Aspire el medio de los HIPSC y use PBS para lavar suavemente las células.

Luego, agregue 500 mcL de solución de desprendimiento celular en cada pocillo e incube las células a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Genere una suspensión de células individuales agregando 1 mL de mTeSR1 a cada pocillo y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Separe las células individuales en los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos previamente preparada.

Cuatro días después de la clasificación, debería ser evidente la formación de colonias. En este momento, sustituya el medio de cultivo por medio HESC suplementado con SMC4 1X. Después de extraer y amplificar el ADN objetivo según el protocolo descrito, utilice un kit analizador de fragmentos para analizar la región genómica diana amplificada por PCR de todos los clones mediante la mezcla de colorante para geles, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Confirme los clones de iPSC pluripotentes según el protocolo descrito. Antes de la transducción con virus Sendai, las células pancreáticas muestran una morfología típica alargada. Aparecen pequeñas colonias compactas sobre MEFs al día 12, que se asemejan a colonias de células pluripotentes humanas.

Normalmente, las colonias de iPSC humanas completamente reprogramadas tienen límites muy definidos y pueden seleccionarse entre los días 23 y 30. Aquí se muestra una colonia disociada al día 23. Se presenta una imagen típica de contraste de fases de una colonia de iPSC tras su selección y cultivo en condiciones libres de alimentadores, tras la reprogrmación con virus Sendai de células pancreáticas.

Las colonias de IPSC teñidas de rojo con fosfatasa alcalina están a la derecha. Las IPSC se confirmaron mediante tinción inmunológica para los marcadores de pluripotencia OCT4 y NANOG, como se observa en estos paneles. En este experimento, las IPSC se tiñeron con marcadores de superficie celular y se realizó un análisis por FACS en una suspensión de células individuales.

El pico verde representa las IPSC pancreáticas, y el pico púrpura contiene células negativas para IPSC. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener condiciones asépticas o estériles para la clasificación celular y el cultivo celular. Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la edición genética en IPSC y en ESC, y se pueden responder preguntas adicionales mediante modificaciones genéticas precisas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar de manera confiable iPSCs libres de huellas y libres de células alimentadoras, y realizar edición genómica bialélica.