Name: Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a generar iPSCs libres de huellas a partir de células pancreáticas humanas sin alimentador y editarlas con CRISPR/Cas9. Este método permite obtener clones monocelulares modificados con alta fiabilidad y sin mosaicismo.

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Trabajo en el laboratorio fue apoyado por beca de postdoctorado para Dr. Anjali Nandal y concesión exploración del fondo de investigación de la célula de vástago de Maryland a BT (TEDCO).

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
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<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
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<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
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<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
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<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
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<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
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BT es un miembro fundador de renovar Biosciences Inc.

Reprogramación de células somáticas humanas iPSCs ha proporcionado un gran impulso a los campos de investigación de la biología básica, medicina personalizada, enfermedades modelado, desarrollo de medicamentos y medicina regenerativa16. Muchos métodos actuales y ampliamente utilizados de generación de iPSC humano requieren el uso de virus con el riesgo de la integración en el genoma del anfitrión o episomal vectores con baja eficiencia de reprogramación. Aquí, presentamos un método eficiente para ...

La reprogramación de células somáticas humanas para el estado de pluripotencialidad por la sobreexpresión de factores de reprogramación ha revolucionado la investigación con células madre con aplicaciones en modelado de enfermedad, medicina regenerativa y desarrollo de medicamentos. Varios métodos de reprogramación no están disponibles para la entrega de factores de reprogramación y generar iPSCs, pero el proceso es mano de obra intensiva y no muy eficiente1. Los métodos virales, aunque eficiente, están asociados con problemas de integración de virus y tumorigenicidad2,3,4. En este manuscrito, Divulgamos el uso de virus Sendai citoplásmico entrega factores y establecer líneas de huella libre iPSC que carecen de integración de cualquier secuencia de vectores virales en sus genomas5. El virus Sendai es un virus ARN que se diluye de pasajes de la célula citoplasma ~ 10 después de la infección y produce factores de reprogramación en abundancia, llevando a la rápida y eficaz reprogramación6,7. IPSCs establecido puede ser transición fácilmente al medio sin alimentador para evitar el uso de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como células de alimentador8.
En esta publicación, además de que el virus de Sendai mediada por reprogramación, también Describimos un protocolo mejorado para la edición de iPSCs, que tiene el potencial para suministrar células humanas ilimitadas con modificaciones genéticas deseadas para la investigación. Hemos utilizado tecnología CRISPR/Cas9 para la modificación de iPSCs, que ahora está siendo usada para una amplia gama de aplicaciones incluyendo knock-ins y nocauts, deleciones genómicas a gran escala, combinado biblioteca de descubrimiento de genes, ingeniería genética de numerosos organismos modelo y gene terapia9,10,11. Esta técnica consiste en la formación de complejos de Streptococcus pyogenes-derivadas Cas9 nucleasa y 20-mer guía RNAs que logran el reconocimiento de destino a través de bases con secuencia de genomic destino junto a 3' nucleótido protospacer adyacente secuencia de adorno (PAM). La nucleasa Cas9 induce un nucleótidos rotura trenzado doble ~ 3 desde el sitio de PAM, que es posteriormente reparado predominante por no homóloga se terminan uniendo vía (NHEJ) a inserciones o deleciones en el marco de lectura abierto y lo funcional Knockout de genes12.
Nuestro protocolo mejorado incluye los detalles para el cultivo de las células pancreáticas humanas, su reprogramación en mitotically inactivado fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) para lograr una mayor eficiencia de reprogramación, la posterior adaptación a la cultura libre de alimentador sobre Matrigel, caracterización de iPSCs establecida, guiada por CRISPR RNA diseño y preparación, entrega en iPSCs como complejos de RNP, única célula clasificación para generar líneas clonales de iPSCs editado, fácil detección e identificación de ediciones y caracterización de clones de la célula. Deleciones genómicas eficientemente se obtuvieron en este estudio por la introducción de la proteína Cas9 y dos complejos CRISPR sgRNA RNP para inducir roturas trenzados doble (distritales) y supresión de la intervención del segmento. Este método capitaliza el uso de dos guías para generar deleciones en el marco de lectura abierto, alta eficiencia de NHEJ a bajo número de clones necesidad de ser caracterizado y fácil proyección preliminar de clones por el capilar automatizado unidad de electroforesis, analizador de fragmento. Estos genoma eficaz edición de métodos para generar modelos de enfermedades humanas basadas en células madre se convertirá pronto en un enfoque estándar y de rutina en cualquier laboratorio de células madre. Finalmente, la edición del genoma exacto hará posible ir más allá de los modelos de enfermedad de célula de vástago y potencialmente podría ayudar a catalizar las terapias basadas en células.

<table><tbody><tr><td>Vectores virales de Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Descongelar en hielo; S No: 1</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05%, 100 ml; S No: 2</td></tr><tr><td>Inhibidor de rocas (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Uso 10 &mu; M; S No: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medio</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S No: 4</td></tr><tr><td>Reemplazo de suero (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S No: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>11960069 1X; S No: 6</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Alícuota; S No: 7</td></tr><tr><td>L-glutamina (Glutamax, 100X), líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S No: 8</td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S Nº: 9</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1.000; S No: 10</td></tr><tr><td>Hemacitómetros Hausser</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S No: 11</td></tr><tr><td>Solución de gelatina al 0,1%</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Incubar a 37&ordm; C durante 1 hora; S No: 12</td></tr><tr><td>SSEA-4 anticuerpo</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S No: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>4745S</td><td>1/200; S No: 14</td></tr><tr><td>OCT4 anticuerpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1.000; S No: 15</td></tr><tr><td>Colágeno I, Rat Tail Life</td><td>Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Mantener frío; S No: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluorescente 488/568 (anticuerpos secundarios)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2.000; S No: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S No: 18</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S No: 20</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S No: 21</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S No: 22</td></tr><tr><td>Alcance de disección&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S Nº: 23</td></tr><tr><td>Campana de recogida</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S Nº: 24</td></tr><tr><td>15&nbsp; ml Tubo de centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S No: 25</td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Tubo de centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S No: 26</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S No: 28</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S No: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medio</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No: 31</td></tr><tr><td>Countess&trade; Contador de células</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No: 32</td></tr><tr><td>Sistema de rayos X Faxitron</td><td>CellRad</td><td></td><td>S No: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologías celulares innovadoras AT-104</td><td></td><td>S No: 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>stock de 1 mg/ml; S No: 35</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No: 36</td></tr><tr><td>hESC matrigel calificado</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Para diluir, use DMEM/F-12 frío; S No: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>Caldo 10 ug/ml; S No: 38</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% de existencias en PBS; S No: 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100; S Nº: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S No: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No: 42</td></tr><tr><td>Kit de fosfatasa alcalina</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S No: 43</td></tr><tr><td>Cas9 proteína</td><td>PNA</td><td>Bio CP01-50</td><td>Descongelación y alícuota; S No: 44</td></tr><tr><td>Suero de cabra o burro</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>S No: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S No: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S No: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S No: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S No: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S No: 50</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S No: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S No: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S No: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S No: 54</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S No: 55</td></tr><tr><td>Kit de clonación CloneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S Nº: 56</td></tr><tr><td>Analizador de fragmentosTM</td><td>Advanced Analytical S</td><td></td><td>Nº: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 kit medio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Caliente a temperatura ambiente; S No: 58</td></tr><tr><td>Medio de congelación mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No: 59</td></tr><tr><td>Medio de congelación CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No: 61</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No: 62</td></tr><tr><td>Células pancreáticas humanas</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S No: 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; Medio de inducción neural</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5835</td><td>S No: 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>S No: 65</td></tr><tr><td>2% B27-insulina</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>S No: 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>S No: 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>S No: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>S No: 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>S No: 70</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>S No: 71</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>S No: 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>S No: 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>S No: 74</td></tr><tr><td>TUJ1 anticuerpo</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S No: 75</td></tr><tr><td>Anticuerpo NKX2-5</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No: 76</td></tr><tr><td>Anticuerpo SOX17</td><td>R & D systems</td><td>AF1924</td><td>S No: 77</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No: 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>S No: 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (clasificador de células)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S No: 80</td></tr></tbody></table>

eficiente generación y edición de ipscs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema crispr cas9

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Células madre pluripotentes embrionarias e inducidas pueden uno mismo-renovar y diferenciarse en múltiples tipos de células del cuerpo. Las células pluripotentes así son codiciadas para la investigación en medicina regenerativa y actualmente en ensayos clínicos para enfermedades oculares, diabetes, enfermedades cardíacas y otros trastornos. El potencial de diferenciarse en tipos celulares especializados juntados con los recientes avances en tecnologías, incluyendo el sistema CRISPR/Cas de edición genómica han proporcionado oportunidades adicionales para adaptar el genoma de iPSC para variadas aplicaciones incluyendo las enfermedades al modelado, terapia génica y sesgar las vías de diferenciación, para nombrar unos pocos. Entre las tecnologías disponibles de la edición, el CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes ha surgido como una herramienta de elección para la edición específica del genoma eucariótico. Los CRISPRs son fácilmente accesible, barato y muy eficiente en ediciones específicas de la ingeniería. El sistema requiere una nucleasa Cas9 y una secuencia de guía (20-mer) específica para el objetivo genómico contigua a un 3-nucleotide "NGG" protospacer-adyacente-motivo (PAM) para apuntar Cas9 para el locus genómico deseado, junto con un trazador de enlace Cas9 universal (RNA juntos llamados ARN guía individual o sgRNA). Aquí presentamos un paso a paso el protocolo para la generación eficiente de iPSC alimentador independiente y libre de huella y describir metodologías para la edición del genoma de iPSC usando los complejos de Cas9 ribonucleoproteína (RNP). El genoma edición protocolo es eficaz y puede ser fácilmente multiplexado por sgRNAs pre-secuestrantes para más de un objetivo con la proteína Cas9 y entregar simultáneamente en las células. Por último, se describe un enfoque simplificado para la identificación y caracterización de iPSCs con ediciones deseadas. Tomados en conjunto, las estrategias se deben optimizar la generación y edición de iPSC para múltiples aplicaciones.

En esta publicación, hemos seguido un protocolo simple pero eficiente para la generación de iPSC de células pancreáticas humanas mediante integración o vectores de virus Sendai huella libre. Figura 1A se muestra una representación esquemática de este protocolo de reprogramación. Las células pancreáticas humanas fueron compradas comercialmente, cultivados en medio de Prigrow III y transduced con virus Sendai como se explicó anteriormente. Transduced huso en fo...

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas libres de huella, o IPSC, a partir de células pancreáticas humanas en condiciones libres de células alimentadoras, luego editar las células utilizando ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 y finalmente caracterizar los clones monoclonales modificados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la edición del genoma de células madre humanas, como la generación de IPSC libres de huella y la edición con ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9. La ventaja principal de esta técnica es que se pueden generar líneas clonales de IPSC editadas con alta fiabilidad y no hay evidencia de mosaicismo.Después de recubrir una placa de seis pocillos con colágeno frío, siembre células pancreáticas primarias humanas de bajo pase en medio Prigrow III el día 2 para alcanzar aproximadamente 2,5 x 10⁵ células o al menos un 60 % de confluencia por pocillo el día de la transducción o día cero. El día de la transducción, tras cosechar y contar las células según el protocolo descrito en el texto, descongele en hielo un conjunto de tubos de vector Sendai y agregue cuidadosamente los volúmenes calculados de cad

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Las herramientas de edición del genoma, como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), han mejorado en gran medida la eficiencia de la selección de genes en células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Este manuscrito describe un protocolo para generar un indicador de hiPSC específico del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas.

Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Aprende a generar iPSCs libres de huellas a partir de células pancreáticas humanas sin alimentador y editarlas con CRISPR/Cas9. Este método permite obtener clones monocelulares modificados con alta fiabilidad y sin mosaicismo.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

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