Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas (IPSC) sin huella a partir de células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimento, luego editar las células utilizando ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 y, finalmente, caracterizar los clones de células individuales modificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la edición del genoma de células madre humanas, como la generación de IPSC sin huella y la edición con ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden generar líneas clonales de IPSCs editadas con alta fiabilidad y no hay evidencia de mosaicismo.

Después de recubrir una placa de seis pocillos con colágeno frío, coloque células pancreáticas primarias humanas de paso temprano en medio Prigrow III en el día 2 para lograr aproximadamente 2,5 x 10 a las 5 células o al menos un 60% de confluencia por pocillo el día de la transducción o el día cero. El día de la transducción, después de recolectar y contar las células de acuerdo con el protocolo de texto, descongele en hielo un juego de tubos vectoriales Sendai y agregue cuidadosamente los volúmenes calculados de cada tubo a 1 ml de medio Prigrow III precalentado. Pipetear suavemente para mezclar la solución.

Aspire el Prigrow III de las células y agregue lentamente la mezcla de virus de reprogramación a los pocillos. Luego incube las células en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Veinticuatro horas después de la transducción, deseche cuidadosamente la mezcla de virus en las células y reemplácela con medio Prigrow III fresco.

En el sexto día, agregue 1 ml de solución de desprendimiento de células a las células e incube durante 10 minutos. A continuación, utilizando Prigrow III con inhibidor de rocas, coloque todas las células en placas de MEFs preparadas el día anterior. Incuba las células a 37 grados centígrados durante la noche.

Observe las placas con regularidad para detectar la aparición de grupos o colonias de células indicativas de células reprogramadas que formarán agregados clonales con una morfología de adoquín y un núcleo y nucleolos grandes. Marque las colonias probables de IPSC y revíselas regularmente para ver si crecen. Casi cuatro semanas después de la transducción, después de preparar placas MEF de 24 pocillos, prepare la membrana de la matriz alícuota en función del factor de dilución en el certificado de análisis.

Elija de 24 a 48 colonias y transfiérelas a placas de 24 pocillos recubiertas de membrana matriz con mTeSR1. Incubar las placas durante 24 horas y cambiar el medio todos los días. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles adicionales.

Agregue 500 mcL de dispasa para separar las colonias robustas plateadas en la membrana de la matriz. Después de incubar las células durante 20 minutos, vuelva a colocarlas en placas de 12 pocillos recubiertas de membrana de matriz. Ampliar y caracterizar los clones mediante tinción con fosfatasa alcalina, inmunotinción y análisis FACS según el protocolo de texto.

Para transfectar HIPSCs después de sintetizar SGRNAs de acuerdo con el protocolo de texto, prepare la mezcla maestra de nucleofaction para cada muestra combinando 0,5 mcg de proteína Cas9 y 0,5 mcg de cada SGRNA en un volumen de reacción de 22 mcL. Después de aspirar el medio que contiene el inhibidor de rocas, use 2 mL de RTPBS para lavar cada pocillo de ISPC. A continuación, aspire el PBS y añada 1 ml de solución de desprendimiento de células.

Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Vuelva a suspender las células en 3 ml de medio mTeSR1 y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión de una sola célula. Transfiera las células disociadas a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 5 mL de medio mTeSR1.

A la mezcla maestra de nucleofección, agregue 16,4 mcL de suplemento de célula primaria P3 y 3,6 mcL de suplemento uno del kit Nucleofector. Después de contar y girar las celdas, vuelva a suspender cada unidad de 0,5 x 10 a la 6ª celda en 22 mcL de la mezcla maestra de transfección previamente preparada. Transfiera rápidamente las células a la cámara central de un pocillo de una tira de Nucleocuvette.

A continuación, coloque la tira en un dispositivo Nucleofector y nucleofecte las células utilizando el programa CB150. Después de la nucleofección, agregue rápidamente 80 mcL de medio mTeSR1 precalentado que contenga 10 inhibidores de roca micromolar a cada pocillo de las células nucleofectadas. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Transfiera suavemente las células de la tira a los pocillos de la membrana de la matriz, placa de 12 pocillos prerrevestida que contiene medio mTeSR1 con inhibidor de rocas. En el segundo día de incubación, después de preparar las placas MEF, reemplace el medio en las HIPSC de mTeSR1 a mTeSR1 suplementado con 1XSMC4 durante al menos dos horas antes de la clasificación de una sola célula. Aspire el medio de las HIPSC y use PBS para lavar suavemente las células.

A continuación, añada 500 mcL de solución de desprendimiento de células en cada pocillo e incube las células a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Genere una suspensión de una sola célula añadiendo 1 mL de mTeSR1 a cada pocillo y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Clasifique las células individuales en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos previamente preparada.

Cuatro días después de la clasificación, la formación de colonias debería ser evidente. En este punto, reemplace el medio de cultivo con medio HESC complementado con 1X SMC4. Después de extraer y expandir el ADN objetivo de acuerdo con el protocolo de texto, use un kit de análisis de fragmentos para ejecutar la región genómica objetivo amplificada por PCR de todos los clones a través de la mezcla de tinte en gel según las instrucciones del fabricante.

Confirme los clones pluripotentes de IPSC de acuerdo con el protocolo de texto. Antes de la transducción del virus de Sendai, las células pancreáticas mostraban una morfología típica en forma de huso. Hacia el día 12 aparecen colonias pequeñas y apretadas en los MEF, que se asemejan a las colonias de células pluripotentes humanas.

Normalmente, las colonias humanas de IPSC completamente reprogramadas tienen límites muy claros y se pueden recoger entre los días 23 y 30. Aquí se muestra una colonia disociada en el día 23. Aquí se presenta una imagen típica de contraste de fase de una colonia de IPSC después de la recolección y el cultivo en condiciones libres de alimentador después de la reprogramación del virus Sendai de las células pancreáticas.

Las colonias de IPSC rojas teñidas con fosfatasa alcalina están a la derecha. Las IPSC se confirmaron mediante inmunotinción para los marcadores de pluripotencia OCT4 y NANOG como se observa en estos paneles. En este experimento, las IPSC se tiñeron con marcadores de superficie celular y el análisis de FACS se llevó a cabo en una suspensión de una sola célula.

El pico verde representa las IPSC pancreáticas y el pico púrpura contiene células IPSC negativas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener condiciones asépticas o estériles para la clasificación y el cultivo de células. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la selección de genes en IPSC y ESC, y se pueden responder preguntas adicionales mediante la realización de modificaciones genéticas precisas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar de manera confiable IPSC sin huella y sin alimentadores y realizar la edición del genoma de manera bialélica.