Construcción y evaluación de un modelo murino Osteolysis Calvarial por exposición a partículas de CoCrMo en aflojamiento aséptico
17 de febrero de 2018
Este manuscrito describe un modelo murino osteolysis calvarial por exposición a partículas de CoCrMo, que constituye un modelo animal ideal para la evaluación de las interacciones entre las partículas de desgaste y diversas células en aflojamiento aséptico.
El objetivo general de este procedimiento es construir y evaluar el modelo murino de osteólisis del calvario mediante la exposición a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdeno. La osteólisis inducida por partículas de desgaste es una de las principales causas de aflojamiento aséptico en el fracaso de la artroplastia, pero la mecánica subyacente de esto no está clara. Debido al largo tiempo de seguimiento y a la aparición esporádica, es difícil explorar la partogénesis del aflojamiento aséptico en casos clínicos.
Por lo tanto, es necesario un modelo animal de desgaste para un estudio posterior. En nuestro laboratorio, un modelo de osteólisis murial del calvario construido por partícula de aleación de cobalto es un modelo eficaz para estudiar la parthogénesis del aflojamiento aséptico. Esto se logra generando primero partículas de cobalto, cromo y molibdeno a nanoescala a partir de prótesis de aleación de cobalto y resuspendiéndolas en solución salina tampón de fosfato a una concentración de 15 miligramos por mililitro.
El siguiente paso es identificar la posición de la incisión en una línea entre los dos puntos medios entre dos ojos y oídos, respectivamente. A continuación, se extirpa el periostio craneal del cráneo mediante disección de choque. A continuación, tome 50 microlitros de material de nanopartículas de aleación de cobalto e insértelos en la sutura central de la calvaria.
Después de dos semanas de mantenimiento, sacrifique algunos ratones y recoja la pantorrilla para la evaluación de la osteólisis. La osteólisis es obvia en ratones tratados con nanopartículas de aleación de cobalto, tanto en micro-CT como en imágenes de tinción de H y E. Obtenga aleación de cobalto, cromo molibdeno a partir de prótesis de aleación de cobalto, obteniendo partículas de cobalto, cromo molibdeno a partir de aleación de cobalto, cromo molibdeno mediante corriente continua de tres electrodos de alto vacío.
Para cuantificar el diámetro medio de las partículas de cobalto, cromo y molibdeno, tome un miligramo de partículas en etanol anhidro de 1,5 mililitros y suspenda mediante agitación ultrasónica. Aplique una gota, unos 20 microlitros, de la suspensión sobre la mesa de objetivos de la microscopía electrónica de transmisión y adquiera una serie de imágenes. Utilice el software proporcionado para calcular el diámetro medio y la distribución del tamaño de partícula en las imágenes TEM.
Aquí hay imágenes TEM representativas en el panel izquierdo, la derecha muestra la distribución del tamaño de nanopartícula de la aleación de cobalto, cromo molibdeno calculado por nuestro software comercial. El diámetro medio es de unos 50 nanómetros. Esterilizar las partículas en autoclave durante 15 minutos para eliminar las endotoxinas.
Luego, vuelva a suspenderlos en solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 15 miligramos por mililitro como solución madre. A continuación, se procede a la construcción del modelo de osteólisis del calvario. Seleccionar y anestesiar ratones de seis semanas de edad: seis ratones por grupo.
Coloque a los animales en la posición principal. Retire el pelaje y desinfecte la piel del cráneo con etanol al 75 por ciento. Para incisar, identifique los dos puntos medios entre los dos ojos y orejas, respectivamente, e incide la piel a lo largo de la línea que los une.
Retire cuidadosa y completamente el periostio craneal del calvario mediante disección de choque. Una disección clara del periostio intensifica las interacciones entre las partículas en la calvaria. La sutura se realiza cuidadosamente en ambos extremos de la incisión en una sutura interrumpida simple.
Por lo general, se necesitan tres puntos para una sutura completa. Para la última etapa, pase la línea de sutura a través de la incisión sin anudarse, sosteniendo ambos extremos de la línea de sutura. Tome 15 microlitros de nanopartículas de solución madre de aleación de cobalto e insértelas en la sutura central de la calvaria.
Anudar el último punto en sutura interrumpida simple. Mantenga a los ratones durante otras dos semanas. Dos semanas después, sacrifica el animal y cosecha calvario.
Limpie suavemente todo el tejido blando de las muestras de calvaria con pinzas y fije el tejido en paraformaldehído al cuatro por ciento a cuatro grados centígrados. Para la evaluación de la osteólisis en el modelo inducido por nanopartículas de cobalto, cromo molibdeno, realice una micro-TC de alta resolución 24 horas antes de la micro-TC. Transfiera muestras de calvaria en solución salina tamponada con fosfato a partir de paraformaldehído.
El día de la microtomografía computarizada, recoja muestras de calvaria de solución salina tamponada con fosfato y fíjelas en un soporte asociado con un instrumento. Exploración de la calvaria en un instrumento de micro-TC. Lleve a cabo la reconstrucción tridimensional con una variedad de software.
La tinción de H y E es otra herramienta para la evaluación de la osteólisis en un modelo inducido por nanopartículas. Descalcifique las muestras de calvaria en la solución salina tamponada con fosfato, que contiene un 15 por ciento de etilendiaminatetraacético durante tres semanas a cuatro grados Celsius. Incrustar la calvaria descalcificada en parafina y cortarla en dos secciones micrométricas en el área de deposición de partículas.
Tiñe las secciones con hematoxilina y eosina. Observar el paso general a través del morfismo y por microscopía óptica y adquirir micrografías. A continuación, se muestran imágenes representativas de micro-CT.
En el panel izquierdo se muestran imágenes de reconstrucción tridimensional de los datos de micro-CT. En el panel derecho se muestran imágenes de sección transversal de ratones control, operación simulada y tratados con nanopartículas. La osteólisis es obvia en el grupo de tratamiento con nanopartículas.
A continuación se presenta un análisis cuantitativo de las fotografías de micro-TC mediante el software asociado a los instrumentos. Las mediciones incluyen la densidad mineral ósea, el volumen óseo o la relación de volumen total, el porcentaje de porosidad total, el número trabecular, el grosor trabecular y la separación o espaciamiento trabecular. Los ratones tratados con nanopartículas de aleación de cobalto muestran una densidad mineral ósea y un volumen óseo significativamente más bajos, con un mayor porcentaje de porosidad total en comparación con los animales control.
A continuación se muestran imágenes representativas de tinción H y E para muestras de calvaria de ratones control, de operación simulada y tratados con nanopartículas. La osteólisis también es obvia en el grupo de tratamiento con nanopartículas. El modelo de osteólisis varial murina construido por nanopartículas de aleación de cobalto tiene una alta tasa de éxito en el modelado de la osteólisis inducida por partículas de desgaste.
A continuación se presentan varios factores clave. En primer lugar, las nanopartículas de aleación de cobalto mejoran la interacción entre las partículas de desgaste y la calvaria. En segundo lugar, la exposición adecuada de la calvaria y la disección clara del periostio hacen que la interacción entre las partículas y la calvaria sea más intensa.
En tercer lugar, las mediciones cuantitativas de la pérdida ósea mediante micro-TC facilitan el acceso a las diferencias en la pérdida ósea entre los distintos tratamientos, lo que nos proporciona pruebas sólidas de la osteólisis en comparación con la histomorfometría ósea tradicional. El modelo de osteólisis de calvaria de desgaste construido con partículas de aleación de cobalto es un modelo ideal para investigar la interacción entre la partícula de desgaste y diferentes células en el aflojamiento aséptico. Como micrófagos, fibroblastos, osteoclastos y osteoblastos.
Esperamos que nuestro modelo sea útil para el estudio del aflojamiento aséptico en el futuro.
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Resumen
Este manuscrito describe un modelo de osteólisis calvarial murina mediante la exposición a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdeno, que constituye un modelo animal ideal para evaluar las interacciones entre partículas de desgaste y diversas células en el aflojamiento aséptico. Este modelo es fundamental para comprender la patogénesis de la osteólisis relacionada con el fracaso de la artroplastia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Ortopedia
Antecedentes
- La osteólisis inducida por partículas es una causa importante de aflojamiento aséptico en los reemplazos articulares.
- Los mecanismos que subyacen a este proceso permanecen poco claros.
- Los estudios clínicos enfrentan dificultades debido a los largos tiempos de seguimiento y a las ocurrencias esporádicas.
- Un modelo animal confiable es esencial para investigaciones posteriores.
Objetivo del estudio
- Construir y evaluar un modelo de osteolisis calvarial en ratones.
- Estudiar las interacciones entre partículas de cobalto-cromo-molibdeno y diversas células.
- Profundizar en la comprensión de la patogénesis del aflojamiento aséptico.
Métodos Utilizados
- Generación de partículas nanométricas de cobalto-cromo-molibdeno a partir de prótesis de aleación de cobalto.
- Resuspensión de partículas en solución salina tamponada con fosfatos a una concentración de 15 mg/mL.
- Exposición del tejido calvarial murino a las partículas.
- Evaluación de las interacciones celulares y las respuestas osteolíticas.
Resultados principales
- El modelo murino simula eficazmente la osteólisis inducida por partículas de desgaste.
- Se evaluaron con éxito las interacciones entre las partículas y las células.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los mecanismos del aflojamiento aséptico.
- Este modelo puede utilizarse en estudios futuros sobre el fallo de la artroplastia.
Conclusiones
- El modelo de osteólisis calvarial murino es una herramienta valiosa para la investigación.
- Proporciona información sobre la patogénesis de la osteólisis.
- Este modelo puede ayudar a desarrollar estrategias para mitigar el aflojamiento aséptico.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La osteólisis inducida por partículas sigue siendo una causa principal de aflojamiento aséptico en el fracaso de los reemplazos articulares, aunque la comprensión mecanicista está limitada por las restricciones de los estudios clínicos. El modelo murino de calota ofrece un sistema rápido y cuantificable para evaluar las interacciones entre partículas y células, permitiendo la reducción de riesgos en etapa preclínica de biomateriales y diseños de implantes. Esto apoya la validación de dianas terapéuticas y la confianza predictiva en las fases iniciales de las líneas de investigación y desarrollo ortopédico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas respecto a las interacciones de partículas de desgaste con macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la evaluación cuantitativa de la pérdida ósea mediante micro-TC y histomorfometría.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante la modelización de respuestas osteolíticas para orientar la elección de materiales de implantes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera resultados biológicos estandarizados (densidad mineral ósea, parámetros trabeculares) para la evaluación de compuestos o recubrimientos.
- Reproducibilidad: Alta tasa de éxito y baja variabilidad permiten la realización de cribados escalables de modificaciones de partículas.
- Utilidad de la plataforma: Compatible con modelos transgénicos o knockout para desentrañar las vías mecanicistas en la osteolisis.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la patogénesis del aflojamiento aséptico para conectar el descubrimiento con la validación preclínica.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Clarifica las vías celulares y moleculares que impulsan la osteólisis para la priorización de objetivos.
- Continuidad traslacional: Proporciona puntos finales cuantitativos (volumen óseo, porosidad) predictivos del rendimiento del implante in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis en la etapa inicial de descubrimiento, el desarrollo de ensayos para cribado y la evaluación mecanicista antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías inflamatorias y osteolíticas inducidas por partículas.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y estandarizadas (métricas óseas de micro-TC) para la evaluación confiable de compuestos o biomateriales.
- Análisis: Genera resultados medibles (densidad mineral ósea, grosor trabecular, porosidad) para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traslacional: Relaciona la exposición a partículas con resultados osteolíticos, aportando información para decisiones de avance preclínico.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar diversas partículas de desgaste y recubrimientos de implantes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la osteólisis inducida por partículas.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos definidos de exposición a partículas y evaluación cuantitativa.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar/interrumpir al proporcionar una evaluación temprana del riesgo biológico de los materiales de implante.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de biomateriales en función de su potencial osteolítico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía murina, manipulación de partículas e imágenes por micro-TC.
- Depende de instrumentación para la generación de partículas (electrodo de corriente continua de alto vacío), preparación de suspensiones y cuantificación de la osteólisis.
- Necesita estandarización entre equipos para la dosificación de partículas, técnica quirúrgica y flujos de trabajo de análisis.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la idoneidad del modelo para la evaluación de cronicidad y estudios de carga mecánica.
- Limitación práctica: No puede evaluar los efectos de las fuerzas mecánicas ni la exposición crónica prolongada a partículas según el material fuente.
