Construcción y evaluación de un modelo murino Osteolysis Calvarial por exposición a partículas de CoCrMo en aflojamiento aséptico

El objetivo general de este procedimiento es construir y evaluar el modelo de osteólisis calvarial murina mediante la exposición a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdeno. La osteólisis inducida por partículas de desgaste es una causa importante del aflojamiento aséptico en el fracaso de la artroplastia, pero los mecanismos subyacentes a este proceso son poco claros. Debido al largo tiempo de seguimiento y a la aparición esporádica, es difícil explorar la patogénesis del aflojamiento aséptico en casos clínicos.

Por lo tanto, es necesario un modelo animal de desgaste para estudios posteriores. En nuestro laboratorio, un modelo de osteolisis calvarial murino construido con partículas de aleación de cobalto es un modelo eficaz para estudiar la patogénesis del aflojamiento aséptico. Esto se logra primero generando partículas nanométricas de cromo molibdeno cobalto a partir de prótesis de aleación de cobalto y resuspendiéndolas en solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 15 miligramos por mililitro.

El siguiente paso consiste en identificar la posición de la incisión en una línea entre los dos puntos medios entre los dos ojos y orejas, respectivamente. A continuación, retire el periostio craneal del cráneo mediante disección por choque. Luego, tome 50 microlitros del stock de nanopartículas de aleación de cobalto e insérquelas en la sutura media del cráneo.

Después de dos semanas de mantenimiento, sacrificar algunos ratones y recolectar las calvárias para la evaluación de la osteolisis. La osteolisis es evidente en los ratones tratados con nanopartículas de aleación de cobalto, tanto en las imágenes de micro-TC como en las tinciones H y E. Obtener aleación de cromo molibdeno cobalto a partir de una prótesis de aleación de cobalto, obteniendo partículas de cromo molibdeno cobalto a partir de la aleación de cromo molibdeno cobalto mediante corriente continua de tres electrodos en alto vacío fabricado.

Para cuantificar el diámetro medio de las partículas de cromo cobalto molibdeno, tome un miligramo de partículas en 1,5 mililitros de etanol anhidro y suspenda mediante agitación ultrasónica. Aplique una gota, aproximadamente 20 microlitros, de la suspensión sobre la platina del microscopio electrónico de transmisión y obtenga una serie de imágenes. Utilice el software proporcionado para calcular el diámetro medio y la distribución del tamaño de las partículas en las imágenes de MET.

A continuación se muestran imágenes representativas de TEM: en el panel izquierdo y la distribución del tamaño de las nanopartículas de la aleación de cromo, cobalto y molibdeno en el panel derecho, calculada mediante nuestro software comercial. El diámetro medio es de aproximadamente 50 nanómetros. Somete las partículas a autoclave durante 15 minutos para eliminar endotoxinas.

Luego, resuspéndalos en solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 15 miligramos por mililitro como solución stock. A continuación, se lleva a cabo la construcción del modelo de osteolisis calvarial. Seleccione y anestesie ratones de seis semanas de edad: seis ratones por grupo.

Coloque los animales en la posición adecuada. Retire el pelo y desinfecte la piel del cráneo con etanol al 75 por ciento. Para realizar el corte, identifique los dos puntos medios entre los dos ojos y las orejas, respectivamente, y corte la piel a lo largo de la línea que los une.

Retire cuidadosa y completamente el periostio craneal del cráneo mediante disección por choque. Una disección clara del periostio intensifica las interacciones entre las partículas en el cráneo. La sutura se realiza cuidadosamente en ambos extremos de la incisión mediante puntos simples interrumpidos.

Por lo general, se necesitan tres puntos para una sutura completa. En la última etapa, pase la línea de sutura a través de la incisión sin anudar, sosteniendo ambos extremos de la línea de sutura. Tome 15 microlitros de solución stock de nanopartículas de aleación de cobalto e insérquelos en el punto medio de la sutura de la calota craneal.

Anude el último punto en la sutura simple interrumpida. Mantenga los ratones durante otras dos semanas. Dos semanas después, sacrifique el animal y extraiga el cráneo.

Retire cuidadosamente todos los tejidos blandos de las muestras de calvaria con pinzas y fije el tejido en paraformaldehído al cuatro por ciento a cuatro grados Celsius. Para la evaluación de la osteólisis en el modelo inducido por nanopartículas de cromo cobalto molibdeno, realice una micro-TC de alta resolución 24 horas antes del escaneo por micro-TC. Transfiera las muestras de calvaria en solución salina tamponada con fosfato desde el paraformaldehído.

El día del escaneo con micro-TC, recolecte especímenes de calota de la solución salina tamponada con fosfato y fíjelos en un soporte asociado con un instrumento. Escanee la calota con el instrumento de micro-TC. Realice la reconstrucción tridimensional con software diverso.

La tinción con H y E es otra herramienta para la evaluación de la osteólisis en un modelo inducido por nanopartículas. Descalcifique muestras de calvario en solución salina tamponada con fosfato, que contenga 15 por ciento de ácido etilendiaminotetraacético durante tres semanas a cuatro grados Celsius. Incluya el calvario descalcificado en parafina y córtelo en secciones de dos micrómetros en el área de deposición de partículas.

Tiña las secciones con hematoxilina y eosina. Observe el paso general a través del morfismo y mediante microscopía óptica, y obtenga microfotografías. A continuación se muestran imágenes representativas de micro-TC.

Las imágenes de reconstrucción tridimensional de los datos de micro-TC se muestran en el panel izquierdo. Las imágenes de sección transversal de ratones control, con operación simulada y tratados con nanopartículas se muestran en el panel derecho. La osteólisis es evidente en el grupo tratado con nanopartículas.

Aquí se presenta un análisis cuantitativo de fotografías de micro-TC mediante el software asociado al instrumento. Las mediciones incluyen densidad mineral ósea, volumen óseo o relación de volumen total, porcentaje de porosidad total, número de trabéculas, grosor de trabéculas y separación o espaciado de trabéculas. Los ratones tratados con nanopartículas de aleación de cobalto muestran una densidad mineral ósea y un volumen óseo significativamente más bajos, junto con un mayor porcentaje de porosidad total en comparación con los animales control.

A continuación se muestran imágenes representativas de tinción con hematoxilina y eosina (H y E) de muestras de calota craneal de ratones de control, con operación simulada y tratados con nanopartículas. La osteólisis también es evidente en el grupo tratado con nanopartículas. El modelo de osteólisis calvarial murino inducido por nanopartículas de aleación de cobalto presenta una alta tasa de éxito al reproducir la osteólisis inducida por partículas de desgaste.

A continuación se presentan varios factores clave. En primer lugar, las nanopartículas de aleación de cobalto mejoran la interacción entre las partículas de desgaste y el cráneo. En segundo lugar, una exposición adecuada del cráneo y una disección clara del periostio hacen que la interacción entre las partículas y el cráneo sea más intensa.

En tercer lugar, las mediciones cuantitativas de la pérdida ósea mediante micro-TC facilitan el acceso a las diferencias en la pérdida ósea entre diversos tratamientos, proporcionándonos evidencia sólida sobre la osteolisis en comparación con la histomorfometría ósea tradicional. El modelo de osteolisis de calvaria inducida por partículas de aleación de cobalto es un modelo ideal para investigar la interacción entre las partículas de desgaste y diferentes tipos de células en el aflojamiento aséptico, como macrófagos, fibroblastos, osteoclastos y osteoblastos.

Esperamos que nuestro modelo sea útil para el estudio del aflojamiento aséptico en el futuro.