Name: Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a detectar agregados proteicos en tejidos usando tinción con hFTAA y microscopía de fluorescencia hiperespectral. Esta técnica sensible permite visualizar depósitos amiloides en enfermedades por plegamiento proteico.

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Los autores desean agradecer a Mikael Lindgren y Chanan Sluzny asesoramiento en microscopía de fluorescencia y Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, por Westermark y Kurt Zatloukal por su contribución a las secciones de tejido o micrografías mostradas en esta publicación. La colección de datos presentados en este documento ha sido financiada por las contribuciones de la Fundación sueca del cerebro (Hjärnfonden), la Asociación de Alzheimer sueco (Alzheimerfonden), el Consejo de investigación sueco (VR), la Asociación Göran Gustafsson, Georg &#38; Astrid Olsson, proyecto UE FP7 salud LUPAS y Universidad de Linköping.

Nota: síntesis de la OCV se ha realizado en nuestros laboratorios por más de una década. Aplicando esencialmente protocolos de sustitución aromática electrófila, acoplamiento cruzado de Paladio catalizado, acoplamiento de la amida e hidrólisis de éster sintético modificamos sondas para diferentes propósitos 5 , 12. después de síntesis, caracterización y purificación, el producto de la LCO es liofilizado y almacenado a temperatura ambiente. Algunas de las puntas de prueba (entre ellos hFTAA) están ahora disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales).
 1. solución de tinción de LCO Nota: si hFTAA se adquiere de un proveedor comercial, por favor siga el vendedor &#39; instrucciones en lugar de la sección 1.
HFTAA de <ol><li>Resuspender el liofilizado en 2 mM NaOH para preparar una solución stock de 1 mg/mL. Mantener el stock en un frasco de vidrio a 4 ° C. Las acciones pueden almacenarse por un año.</li>
	<li>En el día de la coloración, preparar una solución de trabajo diluyendo la bolsa 1: 10,000 en tampón fosfato salino (PBS).</li>
</ol> 2. Preparación de muestras de tejido Nota: muchos tipos de tejido pueden ser reflejados con hFTAA como un marcador amiloide. Para ejemplos vea la figura 1. hFTAA es sensible a la conformación agregado. La tinción debe por lo tanto preferentemente realizarse en agregados ininterrumpidos sin exposición del epítopo. Calidad espectral óptima se logra si la fijación de tejido se mantiene al mínimo. Por lo tanto se prefiere material congelado fresco, suavemente fijado en etanol en el momento de la coloración. Sin embargo, es posible detectar también depósitos de amiloide en el tejido que se ha solucionado con p. ej., formol. hFTAA generalmente penetra bien el tejido. Seleccione un espesor de muestra que sea compatible con la deseada imagen técnica.
<ol><li>Si formol fija, parafinembedded se utilizan secciones, deparafinize en xileno durante la noche. Inmersión de las secciones de baños consecutivos de etanol al 99%, etanol al 70%, dH 2 O y PBS, 10 minutos en cada uno. Permitir que las secciones de tejido a secar bajo condiciones de ambiente. 
	PRECAUCIÓN: Xileno se maneja siempre en una campana de humos químicos. Xileno y otros solventes orgánicos son perjudiciales.
	<ol><li>Cryosections descongelar a temperatura ambiente. Fijar las secciones de tejido en formalina al 10% durante la noche y rehidratar por inmersión en baños consecutivos de etanol al 99%, etanol al 70%, dH 2 O y PBS, 10 minutos en cada uno. Permitir que las secciones de tejido a secar bajo condiciones de ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Añadir gotas de la solución de trabajo de hFTAA (aproximadamente 200 μL) a las secciones de tejido para cubrirlo. La gota debe permanecer en el lugar por la tensión superficial. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente para la tinción de.</li>
	<li>Enjuague la solución de tinción con 500 de μl PBS, usando una pipeta y luego sumerja el portaobjetos en el baño de PBS durante 10 minutos, permita que la sección de secado bajo condiciones ambientales.</li>
	<li>Monte utilizando el medio de montaje de fluorescencia. Permitir que el medio de montaje colocar durante la noche. 
	Nota: hFTAA de tinción puede realizarse en combinación con otros métodos de tinción como la inmunofluorescencia, marcadores específicos de célula o el orgánulo, etcetera. Para realizar conjuntamente la coloración, ejecutar su Protocolo de tinción completa de la opción y añadir hFTAA coloración al final, a partir del paso 2.2. Para ejemplos vea la figura 2. Inmunofluorescencia, preferir un anticuerpo secundario que es excitado a 640 nm o mayores. En este rango de longitud de onda, hFTAA no absorbe y por lo tanto no puede ser excitado y que no es fluorescente. Esto asegura que no repintado es visto entre hFTAA y el anticuerpo.</li>
</ol> 3. Microscopía Nota: utilice un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de pase largo. A continuación todos los ajustes fueron utilizados para generar las imágenes en la figura 4. Es necesario ajustes pueden hacerse dependiendo de la muestra tipo y tejido amiloide. Aunque hFTAA a amiloide es estable hacia el blanqueo, es recomendable apagar la fuente de luz cuando la muestra no es examinada o imagen.
<ol><li>Su Nota: el experimento se realizó usando un microscopio de epifluorescencia con filtros de emisión de pase largo y una cabeza de cámara para su (véase Tabla de materiales).
	<ol><li>Uso un microscopio estándar de fluorescencia equipado con filtros de paso largo y una cámara hiperespectral. Asegúrese de que está calibrada la cámara espectral.</li>
		<li>En el software, nombre del proyecto, seleccione &#34; imagen espectral &#34; y adquisición.</li>
		<li>Seleccione el objeto de interés a través del ocular con el filtro de excitación de 436 nm y cambio la trayectoria de la luz a la cámara de.</li>
		<li>En el caso de datos Manager (CDM), seleccione el tipo de muestra espectral, etiqueta de la muestra, y adquisición de prensa. Se abrirá la ventana de adquisición.</li>
		<li>En la ventana de adquisición &#34; la proyección de imagen espectral &#34;, abra el menú configuración, seleccione Propiedades de adquisición y definir el rango espectral a 460-700, la calidad de la velocidad a la velocidad máxima y la medición tipo angosto de láser de gas filtros. Cierre el cuadro de diálogo.</li>
		<li>En el menú imagen, seleccione en vivo completo. En la barra de iconos, apague flecos. Seleccione o tamaño de una región a la imagen que tiene el valor de la memoria de pico por debajo de 800 MB. Configurar el tiempo de exposición a un valor que da el brillo de una imagen total entre 1.000 y 3.000. En la barra de iconos, pulsar la cámara color. Adquisición comenzará. Cuando la adquisición de la imagen es completa, pulse guardar en el &#34; adquirir imagen espectral &#34; cuadro de diálogo y &#34; nueva célula &#34; en el cuadro de diálogo de administrador de datos del caso.</li>
		<li>De la CDM, abre la imagen recogida usando el botón Inicio de análisis. Se abrirá la ventana de análisis de datos.</li>
		Información <li>espectrales se puede recoger de cada píxel de la imagen seleccionando ROIs utilizando el cuadro de diálogo visualización espectral. Elegir &#34; definir &#34; y seleccione ROIs en las áreas relevantes de la imagen.</li>
		<li>Guardar los datos espectrales como un archivo de texto mediante el botón Lib. El archivo de .txt guardados puede ser importado a cualquier software de análisis de elección. El archivo .slb puede utilizarse para el análisis dentro del software de análisis de datos. Los datos del cubo hiperespectrales de la imagen también se pueden exportar como un archivo raw, como &#34; capas como tif &#34;, o como &#34; capas en formato de texto &#34; para aplicaciones de análisis de datos e imagen con software externo.</li>
	</ol></li> <li>Microscopía confocal Nota: el microscopio confocal está equipado con un láser sintonizable como la fuente de excitación. Para los experimentos de emisión de fluorescencia, ajustar la intensidad del láser al 0,2% (correspondiente a una potencia media de 3 MW), el agujero de alfiler a 1 unidad aireada, el tamaño de fotograma para 1.024 px x 1,024 px, la velocidad de scan 7 y un promedio de exploraciones de más de 16 y la profundidad de bits de 8 bits (vea < s Trong &gt; tabla de materiales). Estos valores deben ajustarse para cada tipo de muestra, sistema confocal individual y fuente láser.
	<ol><li>Para el espectro de emisión, recoger los datos utilizando el modo de lambda y la excitación utilizando argón láser conjunto a 488 nm. Recoger la emisión entre 503 y 687 nm con 22 canales en el detector de JADEO de 32 canales. Ajustar la ganancia a 755.</li>
		<li>Para lograr imágenes de canal único, utilice el smart configurar opción. Para FITC (filtro verde), el aumento a 750 y para Alexa 535 (filtro rojo) la ganancia a 845.</li>
		<li>Para recoger el espectro de excitación con el láser sintonizable, utilice excitación con pasos de 1 nm entre 490 y 545 nm durante la percepción de emisión entre 551 y 586 nm. Ajustar la intensidad de láser a 2% (correspondiente a una potencia media de 30 MW) y la ganancia a 774.</li>
		<li>Para recoger la Z-pila en el modo espectral, escanear a través de la profundidad de la sección de pasos de 0,96 μm. La misma configuración de excitación y de emisión como en el paso 3.2.1 puede ser utilizada pero establece la ganancia en 730.</li>
	</ol></li> <li>FLIM Nota: el microscopio confocal está equipado con una unidad FLIM (véase Tabla de materiales).
	<ol><li>Configurar los siguientes parámetros para el microscopio confocal: agujero de alfiler, 20, longitud de onda de excitación, 490 nm; intensidad de láser, 0.5% (correspondiente a una potencia media de 7.5 MW). Utilizar láseres pulsados en 40 MHz.</li>
		<li>Software en el FLIM, configurar fotón contando más de 550 nm. En la ventana de parámetros de visualización, siga contando hasta que el conteo máximo es alrededor 4.000 cuentas de fotón fotón.</li>
		<li>Guardar el archivo y exportar como imagen SPC.</li>
		<li>Ajustar los datos a un decaimiento exponencial de 2 componentes en el software FLIM. Un ajuste que da un χ 2 &#60; 2 es buena. El valor en el eje y es el número de cuentas para la vida dada.</li>
		<li>Seleccionar un umbral de cuentas a incluir, por ejemplo, 100. Código por T1 de color y seleccione rango de toda la vida. El decaimiento es dependiente de la estructura amiloidea que está enlazado el hFTAA. Cursos de la vida de la fluorescencia entre 300 y 1.000 ps se han observado. Guarde el archivo.</li>
		<li>Exportar los datos en bruto con las opciones de exportación y guardar los datos deseados en una carpeta nueva.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

PH PN MB SN son accionistas menores de Ebba Biotech que comercializa hFTAA bajo la marca Amytracker545.

Deposición de proteínas aberrantemente dobladas en amiloide es un evento clave de muchos procesos de enfermedad. Placas amiloides extracelulares compuesta de péptidos Aβ y Neurofibrilar intracelular formado por tau hiperfosforilada se encuentra en el cerebro de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer. Una gama de diferentes proteínas, por ejemplo, transthyretin (TTR), componente de suero amiloide A (SAA) y misfold de cadena ligera de la IgG y manifiestan como depósitos de amiloide en los tejidos fuera del SNC. Aunque amiloide los depósitos han sido conocidos y estudiado por más de un siglo, todavía carecen de un conocimiento detallado de cómo amiloide deposición se inicia en el nivel molecular y qué se puede hacer para evitar este proceso. Para la enfermedad de Alzheimer, es necesario corroborar cómo el proceso de amiloidosis está asociado con la neurodegeneración. Una misión clave en la misión para tratar la amiloidosis es desarrollar novela perfeccionado herramientas para el seguimiento de amiloide iniciación, progresión y regresión; por lo tanto objetivo detección de amiloide es clave. A la larga, beneficiará a diagnóstico clínico del aumento de la sensibilidad y la selectividad de7,de métodos de tinción amiloide15. Desafíos actuales a este respecto son enormes y es un área de investigación muy activa. Un tema principal para el desarrollo clínico y ensayos es diagnóstico pronóstico. Estas enfermedades probablemente comienzan mucho antes de que aparezcan los síntomas, pero para comenzar con tratamiento allí debe ser la identificación de la enfermedad. Aquí, la sensibilidad es un aspecto clave para las nuevas metodologías. Además, este problema es más complejo porque algunos agregados de proteína son tóxicos, algunos son protectores, y algunos son neutros. Por lo tanto, la capacidad para monitorear morfotipos agregados específicos es esencial puesto que la existencia de distintas especies agregadas se ha sugerido para explicar el fenotipo heterogéneo para una diversidad de neurodegeneración de agregación de la proteína. Por ejemplo, la proteína del prión es un clásico ejemplo de cómo puede malpliegan una idéntica secuencia primaria de aminoácidos en distintos morfotipos agregados, que dan lugar a cepas priónicas específicos. Polimorfismo similar también se ha divulgado para el péptido Aβ, α-sinucleína y tau. En este sentido, LCOs han demostrado ser herramientas excepcionales para asignación óptica de distintos morfotipos agregados. Proteína del prión-cepa-específica agregados, depósitos de proteína encontrados en varios tipos de amiloidosis sistémica, así como polimórfica Aß y agregados de tau se han distinguido por el fenómeno óptico conformationally inducido desde el LCOs.
Deposición amiloidea es un evento que ocurre en los tejidos que son difíciles de penetrar con métodos bioquímicos o biofísicos de precisión molecular. La posibilidad de eventos ex vivo, en vivoy en vitro con las mismas moléculas LCO la sonda fija la etapa para desenredar los eventos que se producen en vivo con técnicas que solo son posibles de aplicar en ex vivo o en Vitro muestras de11,17. Un modelo estructural de alta resolución reciente muestra que la pentamérica LCO ALCA (pFTAA) se une en una cavidad formada por cadenas laterales alineadas paralelamente con el eje de la fibrilla que abarcan 6 beta-líneas paralelas en el registro18, demostrando que es posible tener un conocimiento de la resolución atómica sobre las entidades de destino OCV. En esencia el modo de la cavidad y enlace de pFTAA es similar al rojo de Congo19, dictado por una ranura alineado con repetitiva positiva cargada Lys-las cadenas laterales. La afinidad de LCOs parecen ser mejor en comparación con rojo Congo probablemente debido a la flexibilidad de la cadena y fuertes interacciones de van der Waals de los átomos de azufre de los anillos de tiofeno hacia la cavidad hidrófoba. La detección de especies prefibrillar (antes ThT responde)5,20 aparece dependiente en hojas β repetitivos, conformadas en el registro de URL beta de filamentos, que para hFTAA dos unidades de tiofeno más de pFTAA período de cruce de hasta 8 hilos de beta.
El protocolo de tinción requiere prestar atención a la resolución de problemas en los siguientes pasos: (i) la fijación: fijación extensa de muestras de tejido puede interrumpir la estructura amiloidea y limitar la posibilidad de detectar variación en espectros de fluorescencia inducidos por distorsión conformacional de la molécula de hFTAA. Fijación suave de cryosections del material congelado es preferida para lograr una óptima resolución espectral. Sin embargo, hFTAA de la mancha y amiloide en tejido fijo pero con menor eficacia y menos variación espectral de fluorescencia. (ii) método exposición: pre-tratamiento del tejido para lograr la exposición del epítopo para Unión de anticuerpos en ocasiones podría reducir la capacidad para hFTAA a enlazar debido interrumpió estructura amiloidea. Si este es un tema y exposición del epítopo es un paso crucial en el anticuerpo protocolo de tinción, secciones consecutivas de anticuerpo y hFTAA, respectivamente puede ser considerado. (iii) overstaining: hFTAA es extremadamente sensible. Soluciones de trabajo deben conservarse en concentración baja nM. Disminuir la concentración de hFTAA si la tinción de fondo es un problema. Si los elementos que se unen hFTAA son escasos en el tejido, un exceso de hFTAA puede Agregar y se acumulan en el medio de montaje. Esto es reconocido como la fluorescencia que no está en el plano de enfoque del propio tejido. Si esto aparece, sumerja el portaobjetos montado en PBS hasta el cubreobjetos se pueden deslizar de la sección, lavar con PBS y vuelva a montar con medio de montaje fresco y un cubreobjetos nuevo. (iv) filtro basado proyección de imagen: este papel describe imágenes de fluorescencia sobre todo espectral resueltas usando filtros de paso largo o varios canales de detección. hFTAA también puede controlarse mediante filtros de pase corto. Tenga en cuenta que esto reducirá el contraste y abolir las posibilidades para la detección de múltiples colores.
En los últimos años se ha hecho evidente que la investigación como herramientas, LCOs fluorescentes y en particular hFTAA muestran propiedades muy prometedoras. Resultados se han demostrado para una gran variedad de proteínas y Estados de la enfermedad, que van desde la detección de hFTAA de los agregados dentro de las células (tau, miositis por cuerpos de inclusión), amiloide sistémico de amiloide del suero A transthyretin, las cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa y lambda) seminogelin 1, prión proteína (incluyendo muestras clínicas)21, polipéptido amiloideo del islote e insulina7,15. Un factor limitante para la aplicación de hFTAA como una herramienta de diagnóstico es que eso microscopia de la fluorescencia no se utiliza ampliamente en los laboratorios de rutina patología amiloidea. Además, no es fácilmente disponible en la clínica. Sin embargo, hFTAA tinción amiloide y microscopía de fluorescencia han sido utilizados en laboratorios clínicos en un microscopio de fluorescencia basada en filtro y debeconsiderarse como un método complementario de diagnóstico. Esto fue demostrado recientemente en biopsias de síndrome del túnel carpiano con el amyloidosis de transthyretin básicos parámetros de fluorescencia en una manera automatizada22.
Además, además de varias proteínas, fluorescencia hFTAA reconoce una gran variedad de tipos de fibrilla y la fibrilares amiloides agregados p. ej., especies fibrilares de vía se han detectado y caracterizado. En esta publicación, hemos demostrado una OCV en distintos tipos de muestra utilizando tres técnicas de microscopía. El uso de la síntesis controlada también ha permitido el desarrollo de LCOs de detección versátil de dianas biomoleculares, por ejemplo, la grabación de interacciones de plasmón superficial (SPR) de resonancia23 y radiolabeling por emisión de positrones tomografía (PET)24.
Hasta la fecha, se han publicado más de 25 diferentes LCOs con. Un mayor uso de LCOs para obtener imágenes de depósitos amiloides aumentará el conocimiento y la comprensión de cómo estos agregados asociados a enfermedad de montan, desmontarán e interfieran con los órganos y personas en que residen.

Depósito de amiloide en el tejido es una patológica en un número de enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, amiloidosis sistémica y enfermedades priónicas. A pesar de la prevalencia de enfermedades relacionadas con el amiloide y el hecho de que cerca de 40 proteínas diferentes hasta la fecha han sido clasificados como precursores de amiloide en humanos1, poco se sabe sobre la relación entre deposición amiloidea y fenotipo de la enfermedad. Histología de muestras de pacientes humanos ha sido utilizada tanto para propósitos de diagnóstico y científicas. Se han establecido un gran número de modelos animales para investigar la correlación entre la carga amiloide y comportamiento, vida útil y un número de otros leer fenotípica salidas de progresión de la enfermedad2,3. También se hacen grandes esfuerzos en el descubrimiento de fármacos y diseño para algunas de nuestras enfermedades más temidas generalizadas. Sin embargo, la evaluación de la relación entre genotipo, fenotipo, carga de placa amiloide y administración de la droga no es sencillo. Las herramientas para la coloración y la proyección de imagen de amiloide en el tejido son a menudo embotadas y proporcionan información de baja resolución sobre estructura y formación de amiloide.
Rojo Congo birrefringencia, ThT y ThS fluorescencia son ejemplos de los métodos clásicos de detección y análisis de carga amiloidea en muestras de tejido de biopsias de pacientes post mortem muestras y modelos animales de enfermedad4. Estas técnicas se han utilizado durante varias décadas (rojo Congo desde la década de 1920 y ThT y derivados desde la década de 1960), y aunque instrumentación ha sido refinada y permite el análisis detallado, los procedimientos de tinción y análisis todavía se están realizando de la misma manera que hace casi un siglo.
En este papel, describimos la utilización de un colorante amiloide novela altamente sensible, hFTAA5, que permite la detección de depósitos de proteína inmadura con alta precisión, así como la detección de amiloide madura. En comparación a los tintes convencionales, hFTAA ha demostrado detectar una amplia gama de enfermedades asociadas proteínas agregados5,6,7. Además, hFTAA puede aplicarse también para asignación óptica de distintos morfotipos agregados8. Adjunto, describimos hFTAA tinción y análisis de tejido establecidos modelos animales de enfermedad priónica y proteína precursora de amiloide-β (APP) ratones transgénicos diseñados para imitar el desarrollo de la placa en la enfermedad de Alzheimer9,10 . También mostramos post mortem muestras y análisis del diagnóstico de pacientes con amiloidosis sistémica. El LCOs tienen propiedades intrínsecas que les permite informar sobre las diferencias conformacionales dentro de una placa; y al combinar dos LCOs con diferentes propiedades en cuanto a encuadernación y fluorescencia, la diferencia es aún más pronunciada11. Un microscopio de epifluorescencia equipado con filtros de paso largo y una cabeza de cámara hiperespectral se utiliza para permitir la clasificación objetiva de las propiedades espectrales y grabación de imágenes para análisis espectral. Microscopía de fluorescencia confocal con un láser sintonizable como la fuente de excitación se utiliza para evaluar las propiedades tridimensionales de una placa amiloidea en mayor detalle. El láser sintonizable permite recopilación de espectro de excitación y un paso menos selección de longitudes de onda de emisión en el microscopio permite la proyección de imagen de fluorescencia LCO e inmunofluorescencia para determinar la localización de amiloide y de proteína diana. FLIM ofrece una sensibilidad sin precedentes a diferencias conformacionales impuestas el LCOs y revela las diferencias que podrían no detectarse en los espectros de emisión de fluorescencia.
Los principales objetivos con el método de tinción descrito son para facilitar la detección sensible de pequeños depósitos de amiloide y caracterizar conformacional del polimorfismo dentro de depósitos de amiloide. Este conocimiento es importante para la comprensión básica de enfermedades de agregación de la proteína.

<table><tbody><tr><td>hFTAA/Amytracker545</td><td>Ebba Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dako medio de montaje fluoresceno</td><td>Agilent technologies</td><td>GM304</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Spectraview</td><td>Imágenes</td><td></td><td></td>espectrales ASI</tr><tr><td>Software Spectraview</td><td>Imágenes</td> <td>espectrales ASI</td><td></td></tr><tr><td>LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2010b v6.0 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLIM system</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar/ML 458/488/514</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láser sintonizable en sintonía</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagen tejidos amiloides manchado con oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteínas que el depósito amiloide en los tejidos en todo el cuerpo pueden ser la causa o la consecuencia de un gran número de enfermedades. Entre estos encontramos enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y enfermedad de Parkinson que afecta principalmente el sistema nervioso central y el amyloidosis sistémico donde amiloide del suero A, transtiretina y IgG de cadenas ligeras de depósito amiloide en el hígado, carpal túnel, bazo, riñón, corazón y otros tejidos periféricos. Amiloide ha sido conocido y estudiado por más de un siglo, a menudo usando tintes específicos amiloides rojo Congo y tioflavina T (ThT) o tioflavina (ThS). En este papel, presentamos heptamer-formyl tiofeno acético (hFTAA) como un ejemplo de complemento recientemente desarrollado para estos tintes llamados oligothiophenes conjugado luminiscente (LCOs). hFTAA es fácil de usar y es compatible con la tinción de inmunofluorescencia Co o con otros marcadores celulares. Amplia investigación ha demostrado que hFTAA detecta una amplia gama de agregados de proteína enfermedad asociada que tintes amiloides convencionales. Además, hFTAA puede aplicarse también para asignación óptica de morfotipos distintos agregados para permitir estudios de polimorfismo de la fibrilla amiloidea. Mientras que la proyección de imagen metodología aplicada es opcional, aquí demostrar la proyección de imagen hyperspectral (HIS), microscopía confocal y vida de fluorescencia (FLIM) la proyección de imagen del laser. Estos ejemplos muestran algunas de las técnicas de imagen donde LCOs pueden utilizarse como instrumentos para obtener un conocimiento más detallado de la formación y propiedades estructurales de amiloides. Es una importante limitación a la técnica, en cuanto a todas las técnicas de microscopía óptica convencional, el requisito de tamaño microscópico de agregados para permitir la detección. Además, el agregado debe incluir una estructura repetitiva de β-hoja para permitir el enlace de hFTAA. Exposición excesiva fijación o epitopo que modifican la estructura agregada o conformación puede hacer vinculante hFTAA pobre y por lo tanto, presentan limitaciones para la proyección de imagen exacta.

Sensible y selectivo manchas de depósitos de amiloide de una gran cantidad de proteínas en muchos tipos diferentes de tejido de pacientes humanos y animales de experimentación es vital para el diagnóstico clínico, así como en investigación científica. En este trabajo demostramos cómo esto puede ser logrado usando LCOs, ejemplificados por hFTAA, para la coloración y la proyección de imagen multimodal de amiloide de una selección de tipos de tejidos. Desde la primera publicación de ligandos amiloides basada en tiofeno hace más de diez años13, amiloide depósitos compuestos de una amplia gama de proteínas en diversos tejidos han sido fotografiados usando LCOs6,7,11, 14,15,16 (figura 1). En combinación con anticuerpos u otros marcadores histológicos, el LCOs proporcionan excelentes herramientas para fines diagnóstico y científicos (Figura 1a, figura 2). Con una selección adecuada de los marcadores fluorescentes, varios fluoróforos pueden ser reflejadas en la misma sección (Figura 1a, hFTAA y DAPI, hFTAA Figura 2a en configuración de inmunofluorescencia). También es posible utilizar secciones consecutivas para la tinción utilizando brightfield y fluorescencia (figura 2b, hFTAA y tinción de anticuerpos DAB). Recientemente, hFTAA ha demostrado para ser un complemento muy prometedor rojo de Congo que manchaba en diagnóstico clínico7,15 (figura 3).
Desarrollo de técnicas de imagen en las últimas décadas ha aumentado la necesidad de tintes amiloides que puede discriminar entre minutos, pero en el mismo tiempo profundas las diferencias en depósitos amiloideos en términos cuantitativos. El sistema conjugado a la OCV le proporciona una capacidad única para informar sobre la variación en el modo de enlace. Torsión de la molécula puede conducir a la distorsión de los ángulos de enlace en el sistema conjugado e impiden el transporte de electrones (figura 4a). Esto a su vez se refleja en las propiedades fluorescentes de la OCV en longitud de onda de excitación y de emisión y en la vida de la emisión. SU usamos un microscopio de fluorescencia vertical equipado con filtros de pase largo para emisión. Excitación y espectros de emisión en microscopia confocal y FLIM, utilizamos un LSM780 con láser pulsado. Para ejemplificar las diferentes técnicas, imágenes de un objeto (la placa beta amiloide (Aß) en un ratón transgénico aplicación) (Figura 4b–e). Espectros de fluorescencia hiperespectral (Figura 4b) permite la evaluación de los cambios espectrales y variación de intensidad en diferentes regiones de la placa. Espectro de excitación en la microscopia confocal (figura 4 c) puede utilizarse para determinar la longitud de onda de excitación óptima para posteriores experimentos, por ejemplo, combinación de tinción con varios fluoróforos. Este método también puede ser útil para la detección de diferencias conformacionales en el modo de la OCV. Espectro de emisión en modo confocal se puede utilizar para determinar las propiedades de emisión de fluorescencia de hFTAA o de una combinación de varios fluoróforos evaluar colocalización en experimentos de combinación con varios LCOs o LCO e inmunofluorescencia combinaciones. La vida de la fluorescencia del hFTAA está altamente influenciada por pequeñas variaciones en el modo de hFTAA. Por lo tanto, FLIM es una poderosa herramienta de discriminación entre las diferencias impuestas a hFTAA por el destino de enlace (figura 4 d). Esto se puede utilizar por ejemplo en la discriminación entre cepas de priones diferentes8. La proyección de imagen confocal y transformación Z-pilas en imágenes tridimensionales es una herramienta útil para explorar la forma general de un agregado amiloide (Figura 4e). Una vez más, el uso de fluoróforos adicional puede ayudar en la comprensión de la composición de un depósito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg"> 
Figura 1: agregados de proteínas y tipos tejido varios mostrando tinción h-ALCA de: (a) Denk Mallory cuerpos consisten en agregados de queratina en un hígado (contratinción con DAPI), (b) las inclusiones p62 positivas r en esporádicos cuerpo de inclusión miositis (s-IBM) tejido muscular, (c) amiloide del polipéptido amiloideo del islote en el páncreas humano, cerebro (d) cadena ligera de amiloide de inmunoglobulina en el intestino humano, (e) ovejas scrapie (priones) en ratón, (f ) Crónica enfermedad (priones) en cerebro de ratón, placas (g) Aβ en el cerebro de ratón APP23, debilitante patología (h) Aβ en el cerebro de ratón APP/PS1 y biopsia () grasa frotis de muestras de diagnóstico de amiloide transtiretina en pacientes humanos clasificados 1 a 4 según puntuación estándar rojo Congo (RC). Áreas amarillas muestran hFTAA manchado depósitos amiloideos y autofluorescencia del tejido adiposo es azul. La longitud de la barra de escala se especifica en cada panel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg"> 
Figura 2: ejemplos de coloración con los anticuerpos Co. (a) Co de tinción con inmunofluorescencia de suero de proteína amiloide A (AA) y hFTAA de amiloide humano de AA en la misma sección. Parte superior izquierda: AA anticuerpo emisión 640 nm; hFTAA superior derecha a 488 nm; panel inferior del recubrimiento colocalización de proyección de imagen en color amarillo. (b) anticuerpo fluorescencia coloración y hFTAA en secciones consecutivas. Panel superior: AA anticuerpo DAB tinción, panel inferior: hFTAA con un filtro longpass de emisión. Barra de escala: 100 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg"> 
Figura 3: Comparando la fluorescencia con los filtros de pase corto en amiloide transtiretina en corazón humano teñido con Mayer hematoxilina Congo rojo (un–d) y hematoxilina/hFTAA de Mayer (e). (un) trasmitida de imagen, (b) Brightfield, fluorescencia, (c) Brightfield + polarizadores cruzados, (d) Brightfield + fluorescencia + polarizadores cruzados, (e) hFTAA fluorescencia en 405nm + excitación nm 480 (secciones consecutivas a un–d). Barra de escala: 100 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg"> 
Figura 4: el mismo objeto manchado con hFTAA y reflejada con diversas técnicas se demuestra mediante una placa Aβ en un ratón de APP23 de. (a) la fluorescencia propiedades hFTAA es dictado por su estado conformacional. Se muestra la estructura de hFTAA en estado plano y trenzado. proyección de imagen (b) hiperespectrales para la evaluación del espectro de emisión continuo. Espectros en la parte inferior son color cifrado según encajonadas regiones de interés en la imagen. (c) (i) Confocal imagen para proyección de imagen de excitación y espectro (ii y iii) y proyección de imagen de emisión en modo espectral (iv) o modo de filtro. proyección de imagen de toda la vida (d) de la fluorescencia para la detección de diferencias conformacionales en el amiloide, que cursos más cortos de la vida se encuentra en la periferia de la placa de Aß y el tiempo de vida es mayor en el centro de la placa. Histograma en la parte inferior muestra la distribución de tiempos de vida para la placa entera. La imagen es de color según la escala debajo del histograma. (e) Z-pila Confocal en modo de filtro para visualizar la estructura tridimensional de los objetos. La longitud de la barra de escala se especifica en cada panel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Deposición amiloidea es una seña de identidad de distintas enfermedades y afecta a muchos órganos diferentes. Este trabajo describe la aplicación de la fluorescencia oligothiophene conjugado luminiscente tinción en combinación con técnicas de microscopía de fluorescencia. Este método de coloración representa una poderosa herramienta para la detección y exploración de agregados proteicos en ajustes clínicos y científicos.

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

El objetivo general de este método es la detección de depósitos de agregados proteicos tanto en entornos clínicos como científicos. Se describe la tinción con ácido heptaformil tiófeno acético y el análisis de tejidos procedentes de modelos animales de enfermedades priónicas y de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los amiloides, como la presencia de pequeñas cantidades de agregados proteicos y sus variaciones conformacionales intrínsecas.La ventaja de esta técnica es que es más selectiva y más sensible que otras técnicas convencionales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de diversas enfermedades por mal plegamiento de proteínas debido a la posibilidad de ajustar las sondas para la técnica de visualización deseada. En general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque hFTAA requiere una concentración de tinción tan baja.HFTAA también presenta una longitud de onda de excitación y emisión más larga en comparación con los colorantes convencionales. Prepare la solución de oligotiofeno conjugado luminiscente resuspendiendo hFTAA liofilizado en hidróxido de sodio dos milimolar para obtener una solución madre de un miligramo por mililitro. Transfiera la solución madre a un vial de vidrio y almacénela a cuatro grados Celsius.Si se utilizan secciones fijadas con formalina e incluidas en parafina, desparafinar en xileno durante la noche. El día de la tinción, sumerja las secciones en baños sucesivos de etanol al 99%, etanol al 70%, H₂O d y PBS durante diez minutos cada vez. Luego, deje secar las secciones de tejido en condiciones ambientales.Mientras el tejido se seca, prepare una solución de trabajo de hFTAA diluyendo el stock uno a 10.000 en PBS. Cuando el tejido esté seco, agregue gotas de la solución de trabajo de hFTAA a cada sección de tejido para cubrirla. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Lave la solución de tinción con 500 microlitros de PBS y luego sumerja el portaobjetos en el baño de PBS durante 10 minutos. Después de dejar secar la sección en condiciones ambientales, monte utilizando un medio de montaje para fluorescencia. Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.La detección de amiloide puede realizarse directamente después del montaje, o incluso sin montaje. Sin embargo, si el objetivo del experimento es obtener información espectral de alta calidad, se prefiere la incubación nocturna. Abra el software del microscopio, asigne un nombre al proyecto, seleccione imagen espectral e inicie la adquisición.Seleccione el objeto de interés a través del ocular utilizando el filtro de excitación de 436 nanómetros y desvíe la trayectoria de la luz hacia la cámara. En el administrador de datos, seleccione el tipo de muestra espectral, etiquete la muestra y presione adquirir. Se abrirá la ventana de adquisición.En la imagen espectral, abra el menú de configuración, seleccione propiedades de adquisición y establezca el rango espectral de 460 a 700, la calidad de velocidad en velocidad máxima y el tipo de medición en filtros estrechos de láser de gas. Cierre el cuadro de diálogo. En el menú de imagen, seleccione vista completa en directo.En la barra de iconos, desactive las franjas. Seleccione una región para obtener la imagen y asegúrese de que el valor máximo de memoria esté por debajo de 800 megabytes. Establezca el tiempo de exposición en un valor que produzca un brillo total de la imagen entre 1.000 y 3.000.En la barra de iconos, presione la cámara de color. Comenzará la adquisición. Cuando la adquisición de la imagen esté completa, presione guardar en el cuadro de diálogo de adquisición de imagen espectral y nueva celda en el cuadro de diálogo del administrador de datos.Desde el administrador de datos del caso, abra la imagen recopilada utilizando el botón iniciar análisis. Se abrirá la ventana de análisis de datos. La información espectral se puede recopilar de cada píxel de la imagen seleccionando áreas de interés (ROIs) mediante el cuadro de diálogo de visualización espectral.Seleccione definir y elija ROI de las áreas relevantes de la imagen. Guarde los datos espectrales como un archivo de texto utilizando el botón Lib. El archivo txt guardado puede importarse a cualquier software de análisis de su elección.Abra el software del microscopio y comience por configurar el microscopio confocal. Establezca la intensidad del láser en 0,2 %, el diafragma en una unidad Airy, el tamaño de cuadro en 1.024 por 1.024 píxeles, la velocidad de escaneo en siete con promediado durante 16 escaneos, y la profundidad de bits en ocho bits. Para recopilar el espectro de emisión, seleccione el modo lambda y el láser de argón ajustado a 488 nanómetros.Recopile la emisión entre 499 y 691 nanómetros utilizando 22 canales en el detector GASP de 32 canales. Establezca la ganancia en 755. Haga clic en el botón de vista previa y cambie la paleta al indicador de rango, luego ajuste la ganancia para permitir píxeles no sobrecargados en rojo.Haga clic en el botón de detener y luego capture la imagen con el botón de instantánea. Para obtener imágenes de un solo canal, seleccione la opción de configuración rápida. Seleccione FITC y Alexa 532.Seleccione desmezcla lineal y aplique. Ajuste la ganancia para permitir píxeles no sobrecargados. Para FITC, establezca la ganancia en 693, y para Alexa 532, establezca la ganancia en 433 durante el modo en vivo.Haga clic en el botón de detener y luego capture la imagen con el botón de instantánea. Cambie el microscopio al modo FLIM. Ajuste el diafragma a 20, la longitud de onda de excitación a 490 nanómetros y la intensidad del láser al 0,5 %. Utilice láseres pulsados a 40 megahercios.En el software de FLIM, configure el recuento de fotones a más de 550 nanómetros. En la ventana de parámetros de visualización, siga el recuento de fotones hasta que el valor máximo sea de aproximadamente 4.000 recuentos de fotones. Guarde el archivo y expórtelo como imagen SPC.Esta imagen muestra cuerpos de Mallory-Denk, que consisten en agregados de queratina en hepatocitos hepáticos, contrasteados con DAPI. Aquí, se observan inclusiones positivas para P62 en el tejido muscular esquelético de miositis por cuerpos de inclusión esporádica. Esta imagen muestra una inclusión amiloide del polipéptido amiloide de los islotes en el páncreas humano.Se muestra aquí un depósito de cadena ligera de inmunoglobulina amiloide en el intestino humano. Esta imagen muestra depósitos de agregados de la proteína priónica del scrapie ovino en el cerebro de ratón. Se muestran aquí agregados de la proteína priónica en el cerebro de un ratón infectado con la enfermedad crónica de desgaste.Esta imagen muestra placas de amiloide A-beta en el cerebro de ratón APP23. Y esta imagen muestra la patología de A-beta en el cerebro de ratón APP-PS1. Estas extensiones de biopsia de grasa de muestras diagnósticas de amiloidosis de transtirretina en pacientes humanos clasificadas del uno al cuatro según la puntuación estándar con rojo Congo.Las áreas amarillas muestran depósitos de amiloide de transtirretina teñidos con hFTAA, y el azul corresponde a la autofluorescencia del tejido adiposo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar teñir a una concentración adecuadamente baja. También recuerde utilizar filtros de paso largo para obtener el máximo contraste y evitar asimismo la autofluorescencia y la fluorescencia de fondo del tinción.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia para identificar la proteína agregada y detectar proteínas coagregadas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la amiloidosis exploraran las estructuras de los agregados proteicos y para que la química orgánica diseñara nuevas sondas dirigidas a estos objetivos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la tinción con LCO e imágenes mediante diferentes técnicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Fuente: Nyström, S., et al., Imágenes de tejidos amiloides teñidos con oligotiofenos conjugados luminiscentes mediante microscopía confocal hiperespectral e imágenes de fluorescencia de por vida. J. Vis. Exp. (2017). Este video demuestra el análisis de estructuras amiloides con microscopía de imágenes de fluorescencia o FLIM, utilizando el tinte hFTAA para revelar núcleos compactos como azul/verde y periferias inestables como rojo/amarillo en imágenes codificadas por colores, lo que refleja la...

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