Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

El objetivo general de este método es la detección de depósitos de agregados proteicos tanto en el ámbito clínico como en el científico. Se describe la tinción con ácido acético de hepta formil tiofeno y el análisis de tejido de modelos animales de enfermedad priónica y enfermedad de Alzheimer. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los amiloides, como la presencia de pequeñas cantidades de agregados de proteínas y sus variaciones conformacionales intrínsecas.

La ventaja de esta técnica es que es más selectiva y más sensible que otras técnicas convencionales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de diversas enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas debido a la posibilidad de adaptar las sondas a la técnica de visualización deseada. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque la hFTAA requiere una concentración de tinción muy baja.

El HFTAA también muestra una longitud de onda de excitación y emisión más larga en comparación con los tintes convencionales. Prepare la solución de oligotiofeno conjugado luminiscente resuspendiendo hFTAA liofilizado en hidróxido de sodio de dos milimolares para preparar una solución madre de un miligramo por mililitro. Transfiera la solución madre a un frasco de vidrio y guárdela a cuatro grados centígrados.

Si se utilizan secciones fijadas en formol e incluidas en parafina, desparafinar en xileno durante la noche. El día de la tinción, sumerja las secciones en baños consecutivos de 99% de etanol, 70% de etanol, dH2O y PBS durante diez minutos cada vez. Luego, deje que las secciones de tejido se sequen en condiciones ambientales.

Mientras se seca el tejido, prepare una solución de trabajo de hFTAA diluyendo el stock uno a 10.000 en PBS. Cuando el tejido esté seco, agregue gotas de la solución de trabajo hFTAA a cada sección de tejido para cubrirlo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Enjuague la solución de tinción con 500 microlitros de PBS y luego sumerja el portaobjetos en el baño de PBS durante 10 minutos. Después de dejar que la sección se seque en condiciones ambientales, móntela utilizando un medio de montaje de fluorescencia. Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.

La detección de amiloide se puede realizar directamente después del montaje, o incluso sin montaje. Sin embargo, si el objetivo del experimento es recopilar información espectral de alta calidad, se prefiere la incubación nocturna. Abra el software del microscopio, asigne un nombre al proyecto, seleccione la imagen espectral e inicie la adquisición.

Seleccione el objeto de interés a través del ocular utilizando el filtro de excitación de 436 nanómetros y cambie la trayectoria de la luz a la cámara. En el administrador de datos de casos, seleccione el tipo de muestra espectral, etiquete la muestra y presione adquirir. Se abrirá la ventana de adquisición.

En Imágenes espectrales, abra el menú de configuración, seleccione las propiedades de adquisición y establezca el rango espectral en 460 a 700, la calidad de la velocidad a la velocidad máxima y el tipo de medición en filtros estrechos de láser de gas. Cierre el cuadro de diálogo. En el menú de la imagen, seleccione live full.

En la barra del icono, desactiva los flecos. Seleccione una región para crear una imagen y asegúrese de que el valor máximo de memoria sea inferior a 800 megabytes. Establezca el tiempo de exposición en un valor que proporcione un brillo total de la imagen entre 1.000 y 3.000.

En la barra del icono, pulsa la cámara en color. Se iniciará la adquisición. Una vez finalizada la adquisición de la imagen, pulse guardar en el cuadro de diálogo de adquisición de imagen espectral y nueva celda en el cuadro de diálogo del administrador de datos de cajas.

Desde el administrador de datos de casos, abra la imagen recopilada usando el botón Iniciar análisis. Se abrirá la ventana de análisis de datos. La información espectral se puede recopilar de cada píxel de la imagen seleccionando ROI mediante el cuadro de diálogo de visualización espectral.

Elija definir y seleccionar ROI de las áreas relevantes de la imagen. Guarde los datos espectrales como un archivo de texto con el botón Lib. El archivo txt guardado se puede importar a cualquier software de análisis de su elección.

Abra el software del microscopio y comience por configurar el microscopio confocal. Establezca la intensidad del láser en 0.2%, el agujero de alfiler en una unidad Airy, el tamaño del marco en 1, 024 por 1, 024 píxeles, la velocidad de escaneo como siete en un promedio de 16 escaneos y la profundidad de bits como ocho bits. Para recopilar el espectro de emisión, seleccione el modo lambda y el láser de argón ajustado a 488 nanómetros.

Recoja la emisión entre 499 y 691 nanómetros utilizando 22 canales en el detector de jadeo de 32 canales. Ajuste la ganancia a 755. Haga clic en el botón en vivo y cambie la paleta a indicador de rango y ajuste la ganancia para permitir píxeles no sobrecargados en rojo.

Haga clic en el botón de detención y luego capture la imagen con el botón de ajuste. Para lograr imágenes de un solo canal, seleccione la opción de configuración inteligente. Selecciona FITC y Alexa 532.

Seleccione la desmezcla lineal y aplique. Ajuste la ganancia para permitir píxeles no sobrecargados. Para FITC, establezca la ganancia en 693, y para Alexa 532, establezca la ganancia en 433 durante el modo en vivo.

Haga clic en el botón de detención y luego capture la imagen con el botón de ajuste. Cambie el microscopio al modo FLIM. Establezca el orificio en 20, la longitud de onda de excitación en 490 nanómetros y la intensidad del láser en 0.5%Utilice láseres pulsados a 40 megahercios.

En el software FLIM, configure el conteo de fotones de más de 550 nanómetros. En la ventana de parámetros de visualización, siga el conteo de fotones hasta que el conteo máximo sea de alrededor de 4, 000 recuentos de fotones. Guarde el archivo y expórtelo como imagen SPC.

Esta imagen muestra cuerpos de Mallory-Denk formados por agregados de queratina en hepatocitos hepáticos contrateñidos con DAPI. Aquí, se muestran inclusiones positivas de P62 en el tejido del músculo esquelético de la miositis corporal de inclusión esporádica. Esta imagen muestra una inclusión amiloide del polipéptido amiloide de los islotes en el páncreas humano.

Aquí se muestra un depósito de amiloide de la cadena ligera de inmunoglobulina en el intestino humano. Esta imagen muestra depósitos de agregados de proteína priónica de la tembladera de oveja en el cerebro de un ratón. Aquí se muestran los agregados de proteínas priónicas en el cerebro de un ratón infectado con la enfermedad de desgaste crónico.

Esta imagen muestra placas A-beta-amiloide en el cerebro de un ratón APP23. Y esta imagen muestra la patología A-beta en el cerebro del ratón APP-PS1. Estos frotis de biopsia de grasa de muestras diagnósticas de transtiretina amiloide en pacientes humanos se clasificaron de uno a cuatro de acuerdo con la puntuación estándar de Congo Red.

Las áreas amarillas muestran depósitos de amiloide de transtiretina teñidos con hFTAA, y el azul es la autofluorescencia del tejido adiposo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar teñir a una concentración suficientemente baja. Recuerde también utilizar filtros de paso largo para obtener el máximo contraste y también evite la autofluorescencia y la fluorescencia de tinción de fondo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia para identificar la proteína agregada y para identificar las proteínas coagregadas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la amiloidosis exploraran las estructuras de los agregados de proteínas y para que la química orgánica diseñara nuevas sondas para estas dianas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer la tinción de LCO para obtener imágenes de cada uno con diferentes técnicas.