Name: Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende microscopía intravital para estudiar el homing de monocitos y la angiogénesis tumoral en modelos murinos de enfermedad arterial periférica. Este método permite visualizar procesos vasculares en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el ELSE-Kröner-Stiftung y el DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de investigación colaborativa). Agradecimiento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Alemania, para el soporte técnico.

nuestro estudio se realizó con el permiso del estado de Sajonia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, según el artículo 8 de la ley alemana de protección de los animales. (§ 8, párrafo 1 de la ley alemana de protección de los animales de 18.05.2016 - BGBI. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV de 13.08.2013).
 Nota: para los experimentos se utilizaron 8 a 12 ratones BALB/c machos de semana vieja, y monocitos humanos de donantes de sangre fueron utilizadas para la visualización de los monocitos a través de microscopia intravital.
 1. preparación de la célula Nota: para el aislamiento de monocitos, por favor ver nuestro video publicado anterior en JoVE para instrucciones: &#34; aislamiento e intravenosa inyección de murino médula ósea obtenidos Monocitos &#34; por Wagner et al. 4 Nota: cuando trabaja con las células de todos los pasos debe ser estéril para evitar la contaminación.
<ol><li>Célula tinción con 3,3 &#39;-perclorato de Dioctadecyloxacarbocyanine <ol><li>resuspender las células en medio de cultivo libre de suero con una densidad de 1 x 10 6 células/mL. 
		Nota: Sólo medio libre de suero permite una coloración eficiente, ya que el tinte lipofílico sería lo contrario ya capturado por componentes lipofílicos del suero.</li>
		<li>Añadir 5 μl de 1 mM 3,3 &#39;-perclorato de Dioctadecyloxacarbocyanine en dimetilformamida a 1 mL de la suspensión de células y resuspender cuidadosamente.</li>
		<li>Incubar la solución de células a 37 ° C por 20 min.</li>
		<li>Centrifugar las células a 37 ° C y 500 x g por 5 min</li>
		<li>Desalojar el sobrenadante y resuspender las células con medio de 37 ° C caliente fetal becerro suero suplido.</li>
		<li>Repetir dos veces los pasos 1.1.4 y 1.1.5.</li>
		<li>Contar las celdas con la fórmula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>resuspender las células con 150 μL estéril 0,9% NaCl solución.</li>
		<li>Inyectar las células en la vena de la cola.</li>
	</ol></li></ol> 2. Anestesia <ol><li>Anestesia de inhalación <ol><li>vaporizar isoflurano con la ayuda de un vaporizador, usando una concentración del 5% en un depósito cerrado bajo una campana de seguridad química.</li>
		<li>Manejar el ratón con cuidado y colocarlo en la papelera de.</li>
		<li>Manejar los animales por la piel del cuello posterior cuando haya detenido.</li>
	</ol></li> <li>Anestesia intraperitoneal Nota: la anestesia isoflurano uso, descrita en el paso 2.1, para realizar una inyección intraperitoneal. Con la rápida recuperación y efecto narcótico de acción corta de la anestesia isoflurano, es más fácil manejar el ratón e inyectar anestesia intraperitoneal.
	<ol><li>Usar una solución de 2,4 mL ketamina (10%), 0.8 mL xilacina (2%) y 6,8 mL de NaCl (0,9%) para la inyección intraperitoneal.</li>
		<li>Pesar al animal antes de aplicar el anestésico. 
		Nota: La fórmula de la anestesia es: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>utilizar una jeringa de insulina 1 mL con una aguja de 30 G para inyectar la solución en el bajo vientre izquierdo.</li>
		<li>Colocar el ratón en su jaula y esperar efecto narcótico. 
		Nota: El efecto narcótico normalmente aparece dentro de 5 min si la inyección fue exitosa. La correcta profundidad de la anestesia se puede determinar por la ausencia del reflejo de la tapa o reacción a la presión del dedo del pie, así como una tasa regular y controlada de la respiración.</li>
	</ol></li></ol> 3. Implantación de la matriz de la membrana del sótano-como Nota: este método se utiliza por nuestro grupo para el estudio de angiogénesis tumoral después de la inyección de monocitos. Según los experimentos, factores de crecimiento pueden agregarse a la matriz de la membrana basal-like. Se realizó ligadura de la arteria femoral antes de inyectar el tumor en el flanco del ratón. La matriz debe tener una temperatura de 4 ° C para la inyección. A esta temperatura, la matriz es líquido; el gel se endurece a un sólido a la temperatura corporal (37 ° C). Para una mejor visibilidad de la matriz subcutánea enchufe, afeitarse la piel del ratón en el sitio de inyección.
 Nota: opcional: Añadir 100 ng del factor de crecimiento básico del fibroblasto, 300 ng factor endothelial vascular del crecimiento y 26 U.I. heparina bajo condiciones estériles a la matriz de la membrana del sótano como.
<ol><li>Cargue 1 mL de matriz en una jeringa de insulina 30 G y tienda en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Poner el animal sobre la mesa y mantener la piel del ratón al lado del sitio de inyección en el flanco.</li>
	<li>Inyectar 500 μl de la matriz de la membrana del sótano-como por vía subcutánea. 
	Nota: Por razones prácticas, es necesario inyectar la matriz de la membrana del sótano-como compacto en un solo lugar para evitar la dispersión subcutánea. Será más fácil sacar el tumor artificial del tejido después de sacrificar el ratón al final del experimento.</li>
</ol> 4. Inyección de la vena de la cola Nota: practicar la inyección en la cola vena con solución de NaCl en animales antes de experimentación. Si los monocitos no pueden ser adecuadamente inyectados en la vena de la cola, no habrá ningún efecto sistémico en la colateralización. En este protocolo, inyectamos monocitos 2,5 millones. Tratar de inyectar no más de 5 μl/g de peso corporal.
<ol><li>Utilizar la solución de monocito preparada bajo paso 1.1.8 que contienen monocitos 2,5 millones.</li>
	<li>Utilizar una aguja de 30 G y una jeringa de insulina 1 mL para la inyección.</li>
	<li>Cuidadosamente y manejar el ratón, refrenar el animal en el limitador y asegúrese de que el ratón no está dañado y tiene un espacio adecuado para la respiración.</li>
	<li>Poner el limitador en la almohada para que la cola puede contactar con la placa de.</li>
	<li>Identificar las venas de la cola, que se encuentran en el lado lateral de la cola.</li>
	<li>Gire la cola 90 °, para que la vena de la cola aparece en la parte superior de la cola.</li>
	<li>Desinfectar el lado de inyección antes de inyectar los monocitos.</li>
	<li>Tratar de inyectar la solución de monocitos en un ángulo de plano con el bisel de la aguja hacia arriba 
	Nota: Detener la inyección si aparece una ampolla, ya que es un signo de una inyección de fallido. Intente el procedimiento otra vez más proximally.</li>
	<li>Detener el sangrado en el sitio de inyección, aplicando presión suave en la cola de unos 60 años.</li>
	<li>Observar el animal durante 30 min supervisar efectos secundarios sistémicos y colocar el ratón en su jaula después de que el animal se ha recuperado completamente.</li>
</ol> 5. La microscopia intravital <ol><li>preparación <ol><li>Coloque el ratón anestesiado en la almohada (37 ° C) para mantener una temperatura constante y fijar las patas en su lugar con cinta adhesiva.</li>
		<li>Desinfectar la piel en el sitio de la pierna o el flanco que se usa para microscopía.</li>
		<li>Afeitado de la región de interés para un mejor manejo y para evitar interferencias con el cabello.</li>
		<li>Suprimir la piel con un bisturí estéril y pinzas finas en un área cuadrada de 0,5 x 0,5 cm. 
		Nota: Es importante mantener la región de interés húmedas; de lo contrario, podría deteriorarse la calidad de las imágenes y tejido. Solución de NaCl se puede utilizar para humedecer la zona.</li>
		<li>Colocar la pierna entre dos sellos ajustables y colocar un cristal encima de las estampillas.</li>
		<li>Asegurar el tejido es húmedo y está en contacto con el cristal.</li>
		<li>Injretrobulbar de dextrano de rodamina ect 50 μL en el sistema venoso para una mejor visibilidad de los vasos.</li>
		<li>Iniciar la microscopia y ajuste la posición de la pierna si es necesario.</li>
	</ol></li> <li>Ajustes de microscopia intravital <ol><li>encender el microscopio, computadoras, interfaces electrónicas y láseres.</li>
		<li>Encender la unidad de calentamiento de la cámara de incubación o fase (placa/almohadilla) y ajustar la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Inicie el software de adquisición. Si el microscopio está equipado con un escáner de resonancia, seleccione este modo de escaneo rápido.</li>
		<li>Espere hasta que la temperatura alcanza un nivel constante (35-37 ° C) 
		Nota: Una temperatura estable es importante para: (a) el ratón, que bajo anestesia no puede controlar su temperatura corporal y (b) evitar o al menos minimiza deriva focal. Esto podría tomar 1 hora a varias horas, dependiendo de las condiciones circundantes (p. ej., sistema de aire acondicionado y el número de fuentes de calor en la habitación, incluidas las personas). Si se utilizan objetivos de inmersión, la zona de contacto entre la lente y cubierta de vidrio (o tejido) es una típica fuente de inestabilidad. La lente de la calefacción con un calentador objetivo puede ayudar; Alternativamente, un microscopio con un sistema de enfoque automático es muy recomendable.</li>
		<li>Seleccionar una lente con una abertura numérica alta que cumple con los requisitos de la resolución del experimento (ver nota al final de esta sección).</li>
		<li>Optimizar la configuración del microscopio con respecto a la ganancia, ajustes del canal, velocidad de escaneo, píxeles de resolución, profundidad volumen, tamaño de paso y promedio antes de colocar el animal experimental en el escenario.</li>
		<li>Escaneo bidireccional para reducir el tiempo de la adquisición.</li>
		<li>Colocar el ratón anestesiado en la platina del microscopio precalentado después de que el microscopio ha alcanzado condiciones estables y los ajustes han sido probados con la ayuda de un muñeco.</li>
		<li>La región de interés dentro de la matriz de la membrana del sótano-como al enfoque mediante el uso de iluminación de luz brillante y examinar brevemente los capilares por la luz ultravioleta con la configuración de filtro adecuada para los fluoróforos aplicada.</li>
		<li>Cambiar a modo; de exploración iniciar la exploración en modo de baja resolución 256 x 256 y mejorar la ganancia de energía del laser hasta que una señal se observa en el monitor.</li>
		<li>Foco en la estructura de interés. Zoom hasta que todos los datos visibles.</li>
		<li>Define &#34; Inicio &#34; y &#34; final &#34; cargos en la dirección axial.</li>
		<li>Detener la exploración.</li>
		<li>Definir paso a paso (p. ej., 0,5 μm) y planos focales (e.g., 10-20).</li>
		<li>Interruptor para el píxel final de resolución (512 x 512 o 1.024 x 1.024) dependiendo de la velocidad del movimiento de estructuras subcelulares o células y seleccionar la exploración velocidad (frecuencia de exploración) que se adapta mejor a los movimientos. Escaneo bidireccional se recomienda sujetar la adquisición de pilas a. 
		Nota: Seleccione la tasa más alta de la exploración de exploración que da suficiente calidad de imagen. Típico punto escáneres proporcionan velocidades entre 400 Hz y kHz 1,4. Resonantes escáneres proporcionan un adicional de 8 kHz o 12 kHz. Reduciendo el número de líneas en la dirección y la frecuencia de barrido puede ser incrementada (los valores típicos son 512 x 512, 512 x 256 o 512 x 200 píxeles de resolución). Dependiendo de la relación de señal a ruido, se puede intentar mejorar la calidad de imagen mediante la adición de línea con un promedio de entre 2 y 4. Por lo general, un ajuste de 512 x 200 sin resultados promedio en un tiempo de adquisición de 18 ms en el modo bidireccional con un escáner de resonancia de 8 KHz; con 512 x 200 y 4 x promedio, retrasa hasta 56 ms por marco.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
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<li>Woodman, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+knockout+mice+show+an+impaired+angiogenic+response+to+exogenous+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli.</a> The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El método aquí descrito arroja luz sobre el desarrollo de arterias colaterales, el comportamiento de los monocitos en estos vasos y el proceso de la Arteriogénesis. Los pasos para la aplicación de este protocolo son fáciles de aprender y puede ser utilizado en otros campos de la ciencia. A pesar de estas ventajas, existen algunas desventajas. Por ejemplo, equipo microscópico es necesario para ejecutar las técnicas descritas. Obtener equipos para un experimento es insostenible, por lo que es importante colaborar con otras...

Las enfermedades cardiovasculares, como cardiopatía coronaria o enfermedad arterial periférica, son las causas más comunes de muerte a nivel mundial1. La terapia celular es un enfoque prometedor para tratar la enfermedad cardiovascular, especialmente para las personas que no son capaces de someterse a intervenciones quirúrgicas. Existen varios enfoques para utilizar células o sus sustancias secretadas como una herramienta terapéutica2,3, con el objetivo general de mejorar la perfusión y mantener la función del tejido isquémico y underperfused. Un intento de lograr este objetivo es mejorar la Arteriogénesis, que mejora el desarrollo de arterias colaterales. Los monocitos son un tipo de célula importante asociado con colateralización. Nuestro grupo se ha centrado en investigar los efectos de monocitos en las áreas de inflamación4,5, en particular utilizando el modelo de isquemia del miembro posterior para inducir isquemia y subsecuente inflamación6. Monocitos hogar de áreas de la inflamación y causan respuestas sistémicas complejas que conducen al desarrollo de colateralización7.
Con el uso de la microscopia intravital, podemos estudiar el comportamiento de estas células en vivo y observar el homing de monocitos inyectados a las áreas de inflamación. Mayoría de los estudios anterior sólo describe análisis de post mortem , que desventajas incluyendo una introducción de artefactos histológicos y gran número de animales necesarios para las preparaciones. Con nuestro enfoque, podemos investigar procesos inmunológicos y formación de colaterales a través de viva imagen en múltiples puntos del tiempo.
Además el desarrollo de arterias colaterales en áreas isquémicas, monocitos también influyen en el crecimiento del tumor. Para investigar estos procesos, inyectar una matriz de la membrana del sótano-como extraída el sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm, un tumor rico en matriz extracelular proteínas8y analizar mediante microscopía intravital. Esta matriz se utiliza para las moléculas de la pantalla de prueba para la formación de redes de células endoteliales o terapias contra el cáncer mediante la inhibición de angiogénicos; en este caso, evaluamos el potencial angiogénico de tumor de monocitos para celular terapia9,10,11.
El objetivo de este protocolo es demostrar de una manera fácil y eficiente para estudiar procesos inmunológicos causados por isquemia en un modelo en vivo . Podemos generar un entorno de prueba más realista en comparación con el workup histológico de tejido post mortem del músculo.

<table><tbody><tr><td>Suero fetal de ternera al 10% (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina Omnifix -F de 1 ml</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 50 ml&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Alemania</td><td></td><td>Inyectomat- jeringa de 50 ml con cánula</td></tr><tr><td>6 pocillos-placas de fijación ultra baja</td><td>Corning Incorporated, NY, EE.UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. 8-12 semanas de edad, macho, C57BL/6, ratones BalbC&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>TESA SE, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adquisición de software</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania&nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Versión: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular</td><td>Fabricado por nuestro grupo con componentes</td><td></td> individuales <td>Medium199, 10% Suero fetal de ternero, 1% Antibiótico (penicilina/estreptomicina)</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania</td><td></td><td>Centrífuga Allegra X-15R</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet, Mannheim, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregón, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr>.<td>Agente de desinfección</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable No.10&nbsp;</td><td>Maquinilla de afeitar de seguridad de plumas Co.Ltd, Osaka, Japón &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer</td><td>GVB, Herzogenrath, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Rubis, Stabio, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Alemania &nbsp;</td><td></td><td>Placa caliente 062</td></tr><tr><td>Factor estimulante de colonias de macrófagos humanos</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtros humanizados para leucocitos</td><td>Incubadora de preservación</td><td></td><td></td>de sangre</tr><tr><td></td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlín, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de separación de leucocitos (tubos con filtro)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemania</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson y compañía, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio M199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco de trabajo microbiológico</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemania</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Portaobjetos para microscopio</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de microscopio con incubadora y unidad de calentamiento</td><td>&nbsp; Leica DMI 6000, Pecon, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado de monocitos</td><td>Fabricado por nuestro grupo con componentes</td><td></td> individuales <td>PBS, 0,5% BSA, 2mM</td></tr><tr><td>EDTA Restricción de ratón</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania &nbsp;</td><td></td><td>Microscopio confocal Leica SP5, Cameleon,</td></tr><tr><td>NaCl coherente (0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlín, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Neubauer&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania &nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>ph 7,4</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td> estéril <td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fabricado por nuestro grupo con componentes</td><td></td> individuales <td>90 % Percoll, 10 % NaCl 1,5M, &rho;= 1.064 g cm-3</td></tr><tr><td>solución Percoll</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Suecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td>10&micro; L/100 y micro; L/200 y micro; L/1000 y micro; </td></tr><tr><td>L Pipetas serológicas</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>&nbsp; Cellstar2 ml, 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>Cabezales de pipeteo</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. Escala</td><td>Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gie&szlig; es, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad de aspiración</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Alemania</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos con tapón</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>15 ml, 50 ml Cellstar</td></tr><tr><td>xilacina (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&uuml; sseldorf, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad arterial periférica

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

La meta terapéutica para la enfermedad arterial periférica y enfermedad isquémica del corazón es incrementar el flujo sanguíneo a áreas isquémicas causada por estenosis hemodinámica. Cirugía vascular es una opción viable en casos seleccionados, pero para los pacientes sin indicaciones para la cirugía como progresión para descanso dolor, isquemia crítica de miembros o importantes trastornos a la vida y de trabajo, hay pocas posibilidades para mitigar su enfermedad. Terapia celular mediante perfusión mejorada de monocitos a través de la estimulación de la formación de colaterales es uno de unas opciones no invasivas.
Nuestro grupo estudia Arteriogénesis después del trasplante del monocito en ratones utilizando el modelo de isquemia del miembro posterior. Previamente, hemos demostrado mejora en la perfusión de miembro posterior mediante trasplante de monocito syngeneic estimulado por el tétanos. Además de los efectos en la formación de colaterales, el crecimiento del tumor puede verse afectado por esta terapia así. Para investigar estos efectos, utilizamos un modelo de ratón de la matriz de la membrana del sótano-como mediante la inyección de la matriz extracelular del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm en el flanco del ratón, después de la obstrucción de la arteria femoral.
Después de los estudios del tumor artificial, utilizamos microscopía intravital en vivo tumor angiogénesis y monocitos autoguiado hacia el blanco dentro de arterias colaterales. Estudios previos han descrito la examinación histológica de los modelos animales, que presupone el análisis subsecuente post mortem los artefactos. Nuestro enfoque visualiza homing de monocitos a las áreas de colateralización en secuencias de tiempo real, es fácil de realizar e investiga el proceso de la Arteriogénesis y tumor angiogénesis in vivo.

La microscopia intravital de la examinación del tumor y crecimiento de vasos colaterales provocados por monocitos puede ayudar a revelar nuevos aspectos en los mecanismos moleculares del tumor angiogénesis y Arteriogénesis. Las células deben estar preparadas e inyección cuidadosamente siguiendo los pasos del protocolo. Las diferencias pueden conducir a variaciones entre experimentos individuales. Los monocitos se deben inyectar en el sistema venoso (figura 1)...

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Hola, mi nombre es Christian Deffge. Soy médico en el hospital universitario de Magdeburgo y trabajo en el grupo de investigación cardiovascular del Dr. Herold y el Profesor Braun-Dullaeus. Investigamos la potenciación del crecimiento colateral.Por lo tanto, utilizamos imágenes. En este video, queremos explicar nuestros métodos. Re-suspender las células en medio de cultivo libre de suero con una densidad de 1 × 10⁶ células por mililitro.Añada cinco microlitros de DIO unimolar y dimetilformamida a un mililitro de la suspensión celular y resuspenda cuidadosamente. Incube la solución celular a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Centrifugue las células a 500 g durante cinco minutos.Elimine el sobrenadante y resuspenda las células con medio suplementado con FCS tibio a 37 grados centígrados. Repita este paso dos veces. Cuente las células con la ayuda de una cámara de recuento de Neubauer y microscopía óptica.ReSuspender las células con solución de cloruro de sodio. Inyectar las células en la vena de la cola. La matriz Matrigel es una preparación de membrana basal reconstituida extraída del sarcoma escamoso.Analiza moléculas de prueba para la formación de redes en células endoteliales o para terapias anticancerígenas mediante la inhibición angiogénica. Volver a evaluar el potencial angiogénico tumoral de los monocitos que buscamos utilizar para terapia celular. Añadir 100 nanogramos de BFGF, 300 nanogramos de VEGFA y 26 unidades internacionales de heparina en condiciones estériles al Matrigel.Después de agitar la solución en vórtex, llénelo con una jeringa de insulina de un mililitro y guárdela en hielo hasta su uso. Para una mejor visualización de la placa subcutánea de Matrigel, afeite la piel del ratón en el sitio de inyección. Puede utilizar un escalpelo afilado o crema depilatoria.Coloque el animal sobre la mesa y sostenga la piel del ratón junto al sitio de inyección en el flanco. Inyecte 500 microlitros de Matrigel por vía subcutánea. Por razones prácticas, es necesario inyectar el Matrigel de forma compacta en un solo lugar para evitar la dispersión subcutánea.Será más fácil desalojar la matriz de Matrigel del tejido después de sacrificar el ratón al final del experimento. Practique la inyección de monocitos con solución de cloruro de sodio antes de realizar el experimento. Si los monocitos no pueden administrarse de forma sistémica, no habrá ningún efecto sistémico.Dentro de este protocolo, inyectamos 2,5 millones de monocitos. Intente inyectar no más de cinco microlitros por gramo. Asegúrese de que el ratón esté calentado con la ayuda de una almohadilla calefactora durante todo el procedimiento.Para la aplicación sistémica de las células, necesitará un sujetador, una jeringa de insulina de un mililitro, una aguja de 30 g y la solución de monocitos resuspendidos y cloruro de sodio. Manipule cuidadosamente al ratón y sujételo en el sujetador. Asegúrese de que el ratón no sufra daño y tenga espacio adecuado para respirar.Coloque el sujetador sobre la almohadilla calefactora de modo que la cola pueda entrar en contacto con la placa. Asegúrese de desinfectar el sitio de inyección para evitar una infección. Identifique las venas de la cola, que se encuentran en la cara lateral de la misma.Gire la cola 90 grados para que la vena caudal quede en la parte superior de la cola. Intente inyectar la solución de monocitos en un ángulo plano. Observe al animal durante 30 minutos para buscar efectos secundarios sistémicos.Coloque al ratón en su jaula después de que el animal se haya recuperado completamente. Coloque al ratón anestesiado sobre la platina del microscopio precalentada después de que el microscopio haya alcanzado condiciones estables y los ajustes hayan sido probados mediante un simulacro. Fije las patas con cinta adhesiva.Desinfecte la piel en el sitio de la pata o flanco que se utilizará para la microscopía. Afeite la región de interés para un mejor manejo y para evitar interferencias con el vello. Mantenga la región de interés húmeda.De lo contrario, se verá comprometida la calidad de las imágenes y del tejido. Coloque la pata entre dos tallos ajustables. Coloque un cubreobjetos encima de los tallos.Inicie la microscopía y ajuste la posición de la pata si es necesario. La configuración del microscopio depende del software que se utilice. Consulte el protocolo para obtener más información.Nuestros datos demuestran que la microscopía intravital representa una herramienta potente para la visualización de monocitos trasplantados dentro del flujo sanguíneo en modelos animales pequeños. Los monocitos deben inyectarse en el sistema venoso para mantener efectos sistémicos y evitar émbolos que pueden ocurrir si la inyección se realiza en el sistema arterial. Si se utiliza Matrigel, inyectar lentamente para evitar la dispersión ayudará en la extracción del injerto para un examen histológico posterior.Dentro de la placa de Matrigel, es posible medir la vascularización contando los capilares en diferentes condiciones experimentales. Los hallazgos de la microscopía intravital pueden verificarse mediante examen histológico. Es posible encontrar monocitos detectados por microscopía intravital en todas las secciones de tejido.Si se requiere mucho tiempo para la adquisición de imágenes, la cantidad de dextrano rodamina dentro del vaso disminuye. Para una mejor visibilidad de los vasos, debe repetirse la aplicación del dextrano rodamina. El uso de sondas positivas para células sobre Matrigel puede ayudar a obtener ajustes óptimos.El objetivo de los tratamientos para la enfermedad arterial periférica o la enfermedad cardíaca isquémica consiste en aumentar el flujo sanguíneo hacia otras áreas perfundidas causado por estenosis hemodinámica. La terapia celular mediante la perfusión potenciada por monocitos, a través de la estimulación de la formación de colaterales, es una opción no invasiva para pacientes sin indicaciones quirúrgicas. Además del desarrollo de arterias colaterales en áreas isquémicas, los monocitos también pueden influir en el crecimiento de tumores.Para investigar estos procesos, utilizamos la inyección de Matrigel en combinación con microscopía intravital. Nuestro objetivo con este protocolo es demostrar una manera sencilla y eficiente de estudiar los procesos inmunológicos provocados por la isquemia en un modelo in vivo. Con este nuevo método, somos capaces de generar un entorno de prueba más realista en comparación con el análisis histológico del tejido muscular post mortem.

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Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

En este video, demostramos la visualización en tiempo real de las interacciones entre las células sanguíneas y el endotelio en las venas mesentéricas de un modelo de ratón inyectado intraperitonealmente con lipopolisacárido.

Microscopía intravital para analizar las interacciones entre células sanguíneas y endoteliales en un modelo de ratón con inflamación

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Mediante el uso de ratones reporteros transgénicos y marcadores fluorescentes inyectables, la microscopía confocal de disco giratorio intravital a largo plazo permite la visualización directa del comportamiento de las células mieloides en el adenoma intestinal en el modelo de cáncer colorrectal ApcMin/+.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica Apc Min / + Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Este protocolo describe la imagen intravital de ratones transgénicos que expresaban marcadores fluorescentes específicos de la célula. La proyección de imagen intravital proporciona un método no invasivo para observaciones de alta resolución en animales vivos utilizando windows implantables a través del cual es posible la visualización microscópica de los procesos. Este método es especialmente útil para estudiar procesos longitudinales.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Este manuscrito describe el uso de ratones transgénicos reportero y vías de administración diferentes de colorantes fluorescentes en angiotensina II-hipertensión inducida por usando microscopia intravital video de vasos sanguíneos para evaluar la activación de células inmunes y sus capacidad de rollo y se adhieren al endotelio.

Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

Describimos dos métodos para evaluar la permeabilidad vascular transitoria asociada con el microambiente tumoral de la función de la puerta de metástasis (TMEM) y la intravasación de células cancerosas mediante inyección intravenosa de dextran de alto peso molecular (155 kDa) en ratones. Los métodos incluyen imágenes intravitales en animales vivos y análisis de tejido fijo utilizando inmunofluorescencia.

Evaluación del microambiente tumoral de la permeabilidad vascular mediada por la puerta de la puerta asociada con la diseminación de células cancerosas mediante imágenes intravitales y análisis de tejido fijo

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

Aprende microscopía intravital para estudiar el homing de monocitos y la angiogénesis tumoral en modelos murinos de enfermedad arterial periférica. Este método permite visualizar procesos vasculares en tiempo real.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica (Video) | JoVE Journal

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

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