Ingeniería del tejido fino córneo: Un In Vitro modelo de las interacciones estroma-nervio de la córnea humana
24 de enero de 2018
Este protocolo describe un novela tridimensional en vitro modelo, donde las células del estroma corneales y las células neuronales diferenciadas se cultivan juntos para ayudar en el examen y la comprensión de las interacciones de los dos tipos celulares.
El objetivo general de este protocolo es investigar las interacciones celulares entre las células del estroma corneal humano y las células neuronales en su matriz extracelular natural. El protocolo puede ampliarse para estudiar enfermedades y distrofias de la córnea, como el queratocono, la queratopatía diabética y la distrofia de Fuchs. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la córnea humana, mediante la identificación de los mecanismos subyacentes y los defectos en las interacciones nerviosas del estroma durante una enfermedad o distrofia corneal específica.
La principal ventaja de esta técnica es que las células pueden segregar su propia matriz extracelular in vitro que proporciona un modelo mejor y más preciso del tejido corneal humano real in vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las enfermedades de la córnea, ya que la evaluación de las interacciones célula-célula y de la matriz extracelular celular garantizará una representación precisa del tejido corneal y permitirá el desarrollo de fármacos más específicos. Ahora, este método puede proporcionar información sobre el daño y la regeneración del nervio corneal.
También se puede aplicar a otros sistemas, como el cribado y el desarrollo de fármacos. Al recibir muestras de tejido de córnea humana, transfiera los tejidos a un plato de 21,5 centímetros cuadrados que contenga dos mililitros de solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco. Coloque la cúpula de la córnea boca arriba y use una hoja de afeitar en un ángulo de 45 grados para raspar la capa epitelial.
A continuación, voltee la cúpula de la córnea boca abajo y raspe completamente el endotelio del estroma. Lave el tejido estromal con DPBS. Mantenga las piezas del estroma húmedas con DPBS y use una cuchilla quirúrgica número 10 para cortar los tejidos del estroma en pedazos pequeños.
Utilice pinzas estériles para transferir las piezas del estroma a un matraz de cultivo T25 sin medios. Deje que los explantes se adhieran al fondo del matraz a 37 grados centígrados durante unos 30 a 40 minutos. Después de cortar con precisión el tejido estromal, transfiera con cuidado el matraz a la incubadora.
Es importante dejar pasar de 30 a 40 minutos y luego agregar los medios lentamente. Este paso es crítico para permitir la adherencia completa de los explantes y evitar su desprendimiento. Una vez adherido, añadir lentamente al matraz el Medio Esencial Mínimo de Eagle, que contiene un 10% de suero fetal bovino y un 1% antibiótico-antimicótico, sin alterar los explantes.
Coloque suavemente el matraz en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Deje los explantes intactos hasta que las células comiencen a aislarse y migrar en el matraz. Después de aproximadamente dos a cuatro semanas, las células deben alcanzar el 100% de confluencia.
Tras la confluencia del 100%, pase las células retirando el medio de cultivo de tejidos y lavando las células con DPBS. Agregue tripsina a las células y luego incube a 37 grados centígrados. Después de aproximadamente cinco minutos, observe las células bajo un microscopio óptico para confirmar que se han desprendido.
Detenga la proteólisis agregando medio fresco y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar los tubos a 1000 x g para pellet las células. Retire el sobrenadante con cuidado sin alterar el pellet y suspenda las células en medio fresco.
Después de realizar un recuento de células, siembre aproximadamente una vez 10 a las seis celdas en el matraz de cultivo T75 con medio fresco para una mayor expansión. Para ensamblar la construcción 3D, primero pase y cuente los fibroblastos de la córnea humana, luego siembre aproximadamente una vez 10 por los seis HCF en un inserto de membrana de policarbonato con poros de 0,4 micras. Añade 1,5 mililitros de medio fresco en la parte superior de la construcción.
A continuación, pipetea otros 1,5 mililitros del mismo medio en la parte inferior de cada construcción. Después de 24 horas, agregue 1,5 mililitros de medio, suplementado con 0,5 milimolares de vitamina C en la parte superior e inferior de cada construcción. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres semanas, añadiendo medios frescos que contengan vitamina C cada dos días.
Esto estimulará a las células a segregar y ensamblar su propia matriz extracelular. Después de tres semanas, agregue ocho veces 10 a las terceras células de neuroblastoma humano SH-SY5Y en la parte superior de las construcciones 3D ensambladas previamente. Es fundamental calcular el número exacto de células en este paso y dejar pasar 24 horas antes de iniciar la diferenciación celular.
Después de 24 horas de incubación, inicie la diferenciación celular SH-SY5Y estimulando las células con 1,5 mililitros de EMEM con 10% de FBS y 10 micromolares de ácido retinoico. A continuación, añade 1,5 mililitros del medio que contiene vitamina C en la parte inferior del constructo. El ácido retinoico es sensible a la luz, por lo que este paso debe realizarse en la oscuridad.
Después de cinco días, cuando las células alcancen la fase de diferenciación, agregue 1,5 mililitros de medio libre de suero que contenga dos nanomolares de BDNF y un 1% de antibiótico-antimicótico en la parte superior de la construcción. Agregue medio fresco suplementado con vitamina C en la parte inferior del constructo. Cultive las células durante dos días adicionales antes de procesarlas para su posterior análisis.
Esta es una imagen de microscopía electrónica de transmisión de alto aumento de la construcción autoensamblada en 3D que muestra la membrana de policarbonato y las células estromales corneales asentadas en la parte superior. Esta imagen muestra las células neuronales diferenciadas asentadas en la parte superior, que exhiben una disposición de células estromal-neuronales. Las flechas de la imagen muestran las células neuronales.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el tejido corneal húmedo en todo momento, al cortar explantes, y mantener estériles los instrumentos quirúrgicos y las cuchillas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y usar este modelo in vitro para investigar las interacciones celulares entre las células estromales de la córnea humana y las células neuronales en su matriz extracelular natural. No olvide que trabajar con BDNF, ácido retinoico y cuchillas quirúrgicas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar ropa protectora adecuada, al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este protocolo describe un nuevo modelo tridimensional in vitro, en el cual se cultivan conjuntamente células del estroma corneal y células neuronales diferenciadas para facilitar el examen y la comprensión de las interacciones entre los dos tipos celulares. Este método puede proporcionar información sobre el daño y la regeneración de los nervios corneales.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación corneal
Antecedentes
- El estudio se centra en las interacciones celulares en la córnea humana.
- Las enfermedades y distrofias corneales, como el queratocono y la queratopatía diabética, son de especial interés.
- Comprender las interacciones entre el estroma y los nervios es fundamental para abordar las afecciones corneales.
- La matriz extracelular desempeña un papel importante en el comportamiento celular.
Objetivo del estudio
- Investigar las interacciones entre las células estromales corneales y las células neuronales.
- Identificar los mecanismos y defectos en las interacciones nerviosas durante las enfermedades corneales.
- Mejorar la comprensión de la biología corneal.
Métodos Utilizados
- Modelo de cultivo in vitro tridimensional.
- Cocultivo de células estromales corneales y neuronales.
- Evaluación de las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular.
- Evaluación de las respuestas celulares en un entorno natural de matriz extracelular.
Resultados Principales
- El modelo permite la secreción de una matriz extracelular auténtica.
- Se obtuvieron conocimientos sobre el daño y la regeneración de los nervios corneales.
- La técnica contribuye al desarrollo dirigido de fármacos para enfermedades corneales.
- Mediante este método se abordaron preguntas clave en la biología corneal.
Conclusiones
- Este modelo novedoso proporciona una representación más precisa del tejido corneal humano.
- Tiene implicaciones para la terapia en enfermedades corneales.
- Investigaciones futuras pueden ampliar el entendimiento de las interacciones de los nervios corneales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo 3D in vitro responde a la necesidad de sistemas corneales humanos fisiológicamente relevantes en las fases iniciales del descubrimiento, permitiendo la interrogación mecanicista de las interacciones estroma-nervio en enfermedades corneales. Al reproducir la deposición nativa de la matriz extracelular y el co-cultivo de células estromales y neuronales, el modelo apoya la validación de dianas terapéuticas y la reducción de riesgos en hipótesis terapéuticas antes de las pruebas en animales. Proporciona una plataforma escalable y reproducible para evaluar los efectos de compuestos sobre la integridad y regeneración del nervio corneal, alineándose con los esfuerzos de la industria por reducir la dependencia de modelos in vivo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la comunicación estroma-nervio en tejido corneal humano, aclarando los mecanismos patógenos en enfermedades como el queratocono y la queratopatía diabética.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para humanos para validar dianas implicadas en vías de daño y regeneración nerviosa.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la modelización de interacciones celulares relevantes para la enfermedad en un contexto definido de matriz extracelular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas sobre la diferenciación neuronal, la morfología de las células estromáticas y el ensamblaje de la matriz extracelular tras la exposición a compuestos de prueba.
- Valor operativo: El formato estandarizado del constructo 3D permite un plaqueado, dosificación y lectura reproducibles en campañas de cribado.
- Preparación del ensayo: Permite la evaluación de medio rendimiento de agentes neuroprotectores, neuroregenerativos o antifibróticos en un microentorno corneal humano.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Translacional: Une las etapas de descubrimiento y preclínica al mantener fenotipos celulares humanos y composición de la matriz relevantes para las distrofias corneales.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite la evaluación temprana de los efectos de compuestos sobre la integridad estromal-nerviosa, orientando decisiones de continuidad o interrupción antes de estudios de eficacia in vivo.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la correlación entre lecturas funcionales (por ejemplo, crecimiento de neuritas, deposición de matriz) y el potencial modificador de la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, proporcionando un sistema de cultivo conjunto estromal-nervioso relevante para el ser humano antes de la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre vías de señalización estroma-nervio en modelos de enfermedades corneales.
- Cribado: Permite construcciones tridimensionales listas para ensayos en el cribado de compuestos con lecturas dependientes de la matriz extracelular.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos de imágenes y análisis bioquímicos (por ejemplo, alineación celular, marcadores de diferenciación, deposición de matriz) para comparar condiciones de tratamiento.
- Investigación Traducional: Mantiene fenotipos humanos de fibroblastos corneales y neuronas diferenciadas, favoreciendo la continuidad hacia pruebas preclínicas de eficacia.
- Reutilización Empresarial: La plataforma puede adaptarse a diversos modelos de enfermedades corneales y clases de compuestos, reduciendo los esfuerzos de redesarrollo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción mecanicista de riesgos en hipótesis sobre interacciones estroma-nervio en la fisiopatología corneal.
- Valor operativo: Protocolo estandarizado para ensamblaje de tejidos en 3D, co-cultivo y diferenciación que favorece la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Orienta decisiones tempranas de avance o interrupción al predecir los efectos de compuestos sobre la integridad del nervio corneal humano.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos corneales basada en datos relevantes para el ser humano sobre interacciones nerviosas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo primario de células, ingeniería de tejidos tridimensional y diferenciación neuronal.
- Depende de infraestructura estéril para cultivo celular, incubadoras y microscopía para la evaluación de los constructos.
- Necesita estandarización en el aislamiento de explantes estromales, la expansión de fibroblastos y el momento de la diferenciación de SH-SY5Y.
- La adaptación a otros tipos celulares neuronales o gliales puede requerir optimización de los factores de diferenciación.
- La cronología de maduración del constructo (5 o más semanas) requiere planificación para ventanas de ensayo a largo plazo.
