MicroARN basado biopsia líquida: La experiencia de lo miRNA de Plasma firma clasificador (MSC) para la detección de cáncer de pulmón

El objetivo general de este procedimiento es medir los niveles de 24 microRNAs circulantes en plasma con el fin de determinar el riesgo de desarrollar cáncer de pulmón en fumadores empedernidos mayores de 50 años. Estos métodos pueden aumentar la rentabilidad de los programas de cribado por tomografía computarizada de baja dosis para la detección temprana del cáncer de pulmón al reducir el número de ganglios falsos positivos y, posiblemente, el sobrediagnóstico. La principal ventaja de esta técnica es que los microARN secretores son fáciles de medir con equipos estándar que adoptan laboratorios moleculares comunes.

La idea de este método fue cuando empezamos a estudiar el papel del microambiente tumoral en el desarrollo del cáncer de pulmón. Los microARN reflejan la respuesta del huésped y la interacción dinámica entre el tumor y su microambiente. La demostración visual de este método es fundamental para comprender mejor el procedimiento operativo estándar a seguir para este tipo de análisis molecular.

Para iniciar este protocolo, utilice tubos Vacutainer para recoger 10 mililitros de muestra de sangre completa. Almacene a temperatura ambiente. No almacene la sangre entera a baja temperatura, como a cuatro grados centígrados, para evitar el choque térmico y la lisis celular.

Eso nos lleva a una liberación específica de microARN. Centrifugar el plasma en el plazo de una hora para separarlo. Asegurándose de evitar el contacto con el anillo linfocítico.

Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros. A continuación, centrifugar el sobrenadante en las mismas condiciones. Alícuota un mililitro de este sobrenadante de plasma en viales criogénicos de 1,5 mililitros, teniendo cuidado de evitar recoger la fracción plasmática del fondo del tubo.

Para iniciar el aislamiento del ARN, agregue 200 microlitros de solución OMG preenfriada a 200 microlitros de plasma para cada muestra. Para asegurar un vórtice de homogeneización completo durante 15 a 30 segundos. Para homogeneizar la muestra, añadir 200 microlitros de tampón de lisis y 25 microlitros de proteína ASK por muestra, y vórtice durante 20 segundos.

Luego, incube las muestras a 37 grados centígrados en un termomezclador durante 15 minutos. A continuación, seleccione el método RSC mi-RNA Tissue y cargue un cartucho para cada muestra en una bandeja de cubierta de un extractor automático de ácidos nucleicos, colocando correctamente el émbolo. Transfiera el lisado y agregue cinco microlitros de solución de DNasa a sus posiciones apropiadas en el cartucho del instrumento.

A la base de cada tubo de elución añadir 60 microlitros de agua libre de nucleasas. Para comenzar la purificación automatizada, inicie la ejecución. Almacene el total de muestras de ARN a 80 grados centígrados.

Para convertir el ARN en CDNA utilizando el kit de transcripción inversa de miroARN Taq, utilice la herramienta de cebado Taq RT con los mi-ARN de interés. En un tubo de 1,5 mililitros colocado sobre hielo, prepare la mezcla de reacción RT de acuerdo con las instrucciones del kit. A continuación, añada 3 microlitros de ARN total por muestra, hasta un volumen final de 15 microlitros.

Incubar en hielo, durante cinco minutos. Finalmente, cargue las muestras en un termociclador y ejecute la reacción RT. A continuación, mezcle 2,5 microlitros de cada producto de reacción RT con Taq Master Mix 2X y Custom Taq pool.

Agregue agua sin nucleasas hasta un volumen final de 25 microlitros. Realice la reacción de preamplificación en un termociclador utilizando un perfil térmico específico. A continuación, diluye cada producto añadiendo 175 microlitros de 0,1 XTE PH 8,0.

En primer lugar, mezcle 1,13 microlitros de la muestra preamplificada diluida con 2X Taq Universal Master Mix en un tubo de 0,5 mililitros. Y luego agregue agua sin nucleasas. Para medir los niveles plasmáticos de 24 miARN específicos en ocho muestras simultáneamente, utilice una tarjeta de microARN Taq personalizada y microfluídica de 384 pocillos.

Cargue hasta ocho reacciones con la mezcla de reacción PCR en la tarjeta. Centrifugar la tarjeta personalizada a 311 veces G, durante dos minutos y séllela con un sellador de tarjetas de matriz. Finalmente, coloque la tarjeta en un sistema de PCR en tiempo real y ejecute la reacción de PCR en tiempo real.

Para extrapolar y analizar los datos, utilice el software adecuado y obtenga los valores brutos de TC. Establezca una línea de base automática para eliminar las señales de fondo y un umbral fijo de 0,15 para todos los ensayos y muestras. Se debe realizar una etapa de control de calidad preanalítico para identificar muestras de plasma hemolizado no analizables en las que podrían producirse resultados falsos de liberación inespecífica de miARN por parte de las células sanguíneas.

Un análisis espectrofotométrico de muestras de plasma que mide la relación de absorbancia entre las longitudes de onda A414 y A375 muestra la diferencia entre las muestras hemolizadas no analizables y las muestras no hemolizadas. Para identificar cualquier problema técnico, se evalúa el rendimiento de la RT-QPCR. Cuatro tarjetas microfluídicas de calidad dan como resultado RT-QPCR con bajo rendimiento y, en este caso, el producto de preamplificación debe recargarse en una nueva tarjeta microfluídica.

tarjetas microfluídicas de buena calidad dan como resultado un buen rendimiento, y luego se someten a dos pasos de control de calidad postanalíticos. Después de realizar los pasos de control de calidad, se aplica el clasificador de firmas de microARN. Se generan las cuatro firmas de las proporciones de miRNA que componen el MSC.

Riesgo de enfermedad, riesgo de enfermedad agresiva, presencia de enfermedad y presencia de enfermedad agresiva. Al combinar las cuatro firmas, el nivel de riesgo se define finalmente como bajo, intermedio o alto. Una vez dominada, excluyendo una semana de almacenamiento de plasma a 80 grados centígrados, esta técnica se puede realizar en diez horas.

Análisis simultáneo de ocho muestras. El clasificador de firmas de microARN se ha probado hasta ahora en más de 10.000 muestras recogidas de más de 4.000 voluntarios inscritos en el ensayo de cribado de BioMed Lancaster. Potencialmente, estas pruebas podrían permitir una mayor consistencia del algoritmo de diagnóstico.

También disminuyen los costos de detección. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión, permitir medir los niveles de miARN circulante para usarlos como biomarcador para el diagnóstico de cáncer y otras enfermedades graves.