Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

El objetivo general de la fabricación de este dispositivo de imagen es crear una plataforma modificable para el análisis microscópico de la cicatrización de heridas en larvas vivas de pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, como cuál es la contribución de la reorganización de las fibras de colágeno y las respuestas celulares al posterior recrecimiento del tejido después de una lesión. La principal ventaja de esta técnica es que las heridas y las imágenes se producen dentro de un solo dispositivo, mientras que el dispositivo no impide el recrecimiento de la cola.

Además, los múltiples compartimentos funcionales del zWEDGI podrían modificarse de forma independiente para adaptarse a diferentes estadios larvarios y a una serie de protocolos experimentales. Para comenzar, modele el componente PDMS del dispositivo con las geometrías y atributos deseados de acuerdo con el protocolo de texto. Después de imprimir los moldes con una impresora 3D de fotopolímero, limpie los moldes con un cepillo fino, alcohol desnaturalizado en una botella de spray y aire comprimido.

Frote suavemente y elimine la resina sin curar, particularmente cualquier material de las regiones de microcanales. Luego, cura los moldes en un aparato de postcurado UV durante 60 minutos en cada lado, ya que la resina sin curar es tóxica para las larvas de pez cebra. Con papel de lija de grano 200, lije el lado de la cavidad del molde sobre una superficie plana hasta que todas las superficies del techo estén en contacto con el papel de lija.

Con papel de lija de grano 400 y 600, lije ligeramente progresivamente para producir superficies lisas y enrasadas en todas las orientaciones geométricas del molde. Luego, use un indicador de cuadrante para medir la profundidad de la cavidad después del lijado para verificar que esté cerca de la profundidad de diseño. Limpie los moldes y los discos de cubierta de vidrio colocándolos en un limpiador ultrasónico lleno de agua durante 30 minutos o enjuagándolos con agua corriente.

Utilice alcohol isopropílico y aire comprimido filtrado para limpiar y secar los moldes y las cubiertas. Prepare un banco limpio como lugar para fabricar los dispositivos y minimizar la contaminación de los desechos en el aire. Haga el PDMS vertiendo la base y el activador en una proporción de 5:1 en un vaso de plástico.

Con un palo de madera mezclar bien durante dos minutos, revolviendo el gel sobre sí mismo como si fuera pan amasado. Desgasifique la mezcla en un desecador al vacío durante 25 a 45 minutos hasta que desaparezcan todas las burbujas. Luego, usando una jeringa de 10 mililitros, llene la cavidad de cada molde impreso en 3D con aproximadamente 0,75 mililitros de PDMS hasta que el molde se desborde ligeramente con un menisco.

Desgasifique los moldes llenos durante 45 minutos para eliminar las burbujas adicionales que puedan haberse formado durante el llenado. Aplique un disco de cubierta de vidrio en la parte superior del molde lleno de PDMS, presionando el disco hacia abajo en ángulo para evitar que las burbujas queden atrapadas. Permita que el exceso de PDMS sea expulsado a medida que se aplica la cubierta del disco de vidrio.

Luego, use una pequeña abrazadera de trinquete para sujetar el disco de cubierta firmemente al molde. Para mayor eficiencia, se puede utilizar un dispositivo de abrazadera múltiple. Cura el dispositivo PDMS y los moldes sujetados a 100 grados centígrados en un horno durante al menos 90 minutos.

Luego, retira los moldes del horno y déjalos enfriar hasta que se puedan manipular fácilmente. Sujete el molde que contiene el dispositivo PDMS curado en un tornillo de banco de modo que las geometrías del molde queden hacia arriba, paralelas al banco de la estación de trabajo. Comience a quitar el dispositivo PDMS usando pinzas de punta plana para liberar el grifo de tracción del PDMS del molde.

Luego, trabaja alrededor del perímetro del molde con las pinzas. El PDMS debe curarse durante al menos 90 minutos a 100 grados centígrados o, de lo contrario, permanecerá pegajoso y se adherirá al molde. Una buena indicación de que ha curado el dispositivo el tiempo suficiente es que en realidad verá una burbuja de aire en la interfaz entre el molde y el dispositivo PDMS, lo que indica que se eliminará fácilmente.

Utilice aire comprimido filtrado y pinzas para levantar suavemente el dispositivo fuera del molde sujetando la lengüeta y soplando aire debajo del dispositivo. A continuación, coloque el dispositivo PDMS boca abajo en el interior de la tapa de un plato con fondo de vidrio para que las cuñas del túnel de restricción toquen el plástico. A continuación, coloque la tapa del plato con zWEDGI al revés y el plato con fondo de vidrio correspondiente en un limpiador de plasma con el vaso interior hacia arriba.

Evacuar la cámara de limpieza por plasma hasta que la presión alcance los 500 militorr. Configure la frecuencia de radio, o la potencia de RF, en alta y exponga el dispositivo y el plato a la frecuencia de RF durante aproximadamente dos minutos. Luego, despresurice lentamente la cámara y vuelva a colocar el dispositivo y el plato en una campana de sala limpia.

Retire el dispositivo PDMS de la tapa del plato. A continuación, dé la vuelta al PDMS zWEDGI a la orientación correcta en el vaso colocándolo con cuidado en el hueco central del plato con fondo de cristal. Para garantizar la adherencia del PDMS al vidrio, utilice el extremo posterior de las pinzas para aplicar presión alrededor de las diminutas geometrías de los microcanales, alisando el PDMS hacia los bordes.

Presione ligeramente el dispositivo PDMS para asegurarse de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo del dispositivo. Agregue un 70% de etanol al plato y, con una micropipeta, enjuague los canales, incluso a través del túnel de restricción. Luego, retire el etanol y use agua destilada doble para enjuagar el dispositivo dos o tres veces antes de dejar que se seque al aire.

Llene los canales con leche descremada e incube el dispositivo durante 10 minutos a temperatura ambiente para minimizar la adherencia de las larvas al cubreobjetos de vidrio del plato. Luego, sumerja suavemente el dispositivo varias veces en agua destilada doble para enjuagar y deje que se seque al aire boca abajo. Después de anestesiar las larvas de acuerdo con el protocolo de texto, use unos microlitros de tricaína E3 para humedecer previamente los canales del dispositivo.

Con una punta de pipeta de orificio ancho, recoja una sola larva y deposítela en el canal de carga. Luego, con una punta de pipeta o una herramienta similar, oriente la larva en la cámara de carga con el lado dorsal hacia el borde más recto de la cámara de carga y la cola hacia el túnel de restricción. Extraiga con cuidado el líquido de la cámara de herida, permitiendo que la larva fluya hacia el túnel de restricción.

Retire la mayor parte del líquido mientras mantiene la humedad alrededor de la larva. La larva debe estar correctamente orientada en el túnel de contención, ya que se elimina la mayor parte del líquido. Pero debe quedar suficiente líquido alrededor de las larvas.

La orientación se puede ajustar después de la adición de agarosa, pero debe lograrse antes de que la agarosa se solidifique. Pipetear agarosa al 1%LMP en tricaína E3 sobre la cabeza de la larva, llenando la cámara de carga, y dejar que la agarosa se solidifique con la larva en la posición adecuada. Agregue tricaína E3 a la cámara de heridas según sea necesario para mantener la hidratación.

A continuación, repita este proceso de carga para los dos canales restantes. Con una aguja de jeringa, retire con cuidado cualquier agarosa que se haya filtrado a través del túnel de restricción hacia la cámara de heridas. Para heridas, imágenes a corto plazo o aislamiento del tratamiento de heridas, agregue más tricaína E3 sobre la agarosa.

Para herir las larvas en la cámara de herida, use una hoja de bisturí estéril para seccionar la aleta caudal posterior a la notocorda. Agregue tricaine E3 adicional si es necesario y vuelva a colocar la tapa de la placa de cultivo. Instale el dispositivo zWEDGI con larvas anestesiadas en un microscopio invertido en un inserto de platina que acomodará el plato con fondo de vidrio de 60 milímetros.

Ubique la cola de las larvas en el canal superior, girando el plato según sea necesario para colocar la cola en la posición deseada. Visualice la larva según sea necesario para el experimento específico. Al final del experimento, retire la placa zWEDGI del microscopio.

Después de retirar las larvas y el agar de acuerdo con el protocolo de texto, use etanol y agua destilada para limpiar el zWEDGI como se demostró anteriormente, y colóquelo boca abajo para que se seque al aire. Guarde el dispositivo cubierto en un lugar fresco y seco. Aquí se muestran imágenes que utilizan microscopía multifotónica para el segundo armónico, o imágenes SHG de fibras de colágeno en la aleta caudal para ilustrar las capacidades de imagen del zWEDGI.

Antes de herir, el SHG detectó fibras de colágeno que se irradian hacia afuera desde la notocorda hasta la punta de la aleta. Poco después de la herida, la distancia entre la punta de la aleta contraída y el centro de la aleta aumenta con la relajación de la herida. El zWEDGI permite la recopilación de datos tridimensionales a lo largo del tiempo, proporcionando una visión más completa de los cambios dinámicos que se producen en la estructura de la matriz extracelular.

La naturaleza 3D de la recopilación de datos permite la reconstrucción espacial mediante software de renderizado. Estas reconstrucciones y las opciones de rotación posteriores ilustran que la contracción y relajación de la aleta ocurre no solo en el plano XY de la colección de imágenes, sino también en el eje Z, ya que la cola se aplana desde el rizo ascendente del estado contraído. Una vez impresos los moldes reutilizables, la técnica de fabricación se puede realizar en tres o cuatro horas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no hay burbujas de aire atrapadas en el PDMS antes de curar y curar los dispositivos el tiempo suficiente antes de intentar sacarlos de los moldes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la aplicación localizada de fármacos, el marcaje de anticuerpos o la purificación de ARN y proteínas, para responder a preguntas adicionales, como cómo afecta la presencia de fármacos o inhibidores a la cicatrización de heridas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cicatrización de heridas exploraran la dinámica del colágeno, la respuesta de las células inmunitarias y el recrecimiento del tejido en las larvas de pez cebra.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un zWEDGI y usarlo para heridas e imágenes en vivo de larvas de pez cebra. No olvide que las resinas de impresión 3D de fotopolímeros son peligrosas para los humanos y tóxicas para el pez cebra. Se deben tomar precauciones, como usar guantes y una mascarilla mientras se manipulan piezas impresas en 3D sin curar, y asegurarse de que toda la resina que queda en las impresiones esté curada antes de intentar llenar los moldes con PDMS.