Basado en el dendrímero nanopatrones desigual para adherencia de superficie de Control local: un método para dirigir la diferenciación condrogénica

El objetivo general de este protocolo es obtener nanopatrones desiguales basados en dendrímeros a gran escala que permitan el control a nanoescala de la adhesividad de la superficie local. El método descrito se aplica para el estudio de la adhesión celular y la diferenciación condrogénica. Los nanopatrones en relieve de dendrímeros permiten controlar localmente la adhesividad de la superficie a nanoescala.

Los polinanómeros de primera generación modificados con el péptido adhesivo celular RGD se utilizan para crear nanopatrones. Se caracterizan por técnicas de barrido por microscopía y se utilizan en estudios de adhesión y diferenciación celular. A continuación, analizamos los resultados de las técnicas de microscopía e inmunotinción.

El primer paso es preparar los sustratos de trabajo. Los portaobjetos de vidrio cuadrados personalizados se producen cortando portaobjetos de microscopía con un cortador con punta de diamante. Haz diapositivas de 1,25 por 1,25 centímetros de tamaño.

Lave los portaobjetos con agua desionizada, seguido de etanol al 96% y déjelos secar al aire. Prepare la solución de PLLA al 2% añadiendo 200 miligramos de PLLA a un tubo de presión y añada 10 mililitros de dioxano. Agregue una barra agitadora y cierre el tubo herméticamente.

Calentar la mezcla en un baño de glicerina a 60 grados centígrados durante 24 horas bajo una agitación suave. Coloque los portaobjetos de vidrio en un vial de vidrio que contenga la solución de PLLA en una placa caliente limpia a 60 grados centígrados. Espere al menos 10 minutos para alcanzar la temperatura necesaria.

Recubra los sustratos de vidrio con la solución PLLA colocando el portaobjetos de vidrio en la etapa del recubrimiento por centrifugación y ejecutando el programa seleccionado. Seleccionamos 3.000 rpm durante 30 segundos con una aceleración de 1.500 rpm por segundo con un paso previo de 500 rpm a cinco segundos a 300 rpm por segundo para garantizar un recubrimiento homogéneo. Los vasos con recubrimiento giratorio se pueden guardar en la nevera.

Prepare y sonique durante 10 minutos la solución A, una solución de 0,77 miligramos por mililitro de dendrímero RGD-Cys-D1 en agua desionizada. A continuación, prepare soluciones de dendrímeros de 10 a la solución B y C al 2% y de 10 a la 5% respectivamente en agua desionizada. Sonicar la solución C durante 10 minutos y preparar las siguientes soluciones de dendrímeros, D, E y F también en agua desionizada.

Solución D, 2,5x10 al 8%solución E, 10 al 8%y solución F, 4 10 al 9%Conserve estas soluciones en la nevera hasta su uso. Se gradúa con una lámpara UV de la cabina de cultivo celular 18 vidrios recubiertos de PLLA durante 13 minutos para hacerlos estériles. Sonicar cada una de las soluciones de dendrímeros durante 10 minutos.

Filtre las soluciones de dendrímeros a través de filtros de 0,22 micrómetros de diámetro en los portaobjetos de vidrio recubiertos de PLLA en una placa de 12 pocillos bajo el flujo laminar de la cabina de cultivo celular. Déjelos dentro de la cabina a temperatura ambiente durante 16 horas y lávelos con agua estéril desionizada. Para las muestras de control positivas, prepare una solución estéril de fibronectina en PBS e incube las réplicas con la solución durante una hora a temperatura ambiente en la cabina de cultivo celular.

Lávalos con PBS. Los tres sustratos recubiertos de PLLA restantes servirán como réplicas para el control negativo. La topografía de nanopatrones se analiza con AFM operado en modo de golpeteo en el aire.

Monte un voladizo de silicio con una constante de resorte de 40 newtons por metro y una frecuencia de resonancia de 300 kilohercios en el soporte de punta AFM. Con el sustrato de nanopatrones en la etapa AFM, acérquese a la superficie hasta el contacto y elija un punto de ajuste de amplitud que permita obtener imágenes de la configuración del dendrímero sin ejercer una presión excesiva sobre la superficie. Registre al menos tres imágenes representativas de 5x5 micrómetros por sustrato de tres sustratos independientes por condición.

Trate las imágenes adquiridas con el software de procesamiento AFM. Seleccione dendrímeros en las imágenes de altura AFM procesadas y obtenga los umbrales de imagen correspondientes. Obtenga las precisiones de las partículas y utilícelas para obtener las distancias mínimas entre partículas.

Sea las distancias mínimas entre partículas en Z a las precisiones de partículas correspondientes para obtener los tapones de control de probabilidad para las distancias mínimas entre partículas. Ajuste la escala de colores de la gráfica para visualizar las regiones en las que la densidad de superficie RGD local es inferior a 70 nanómetros. Cuantifique el área de estas regiones seleccionándolas en la imagen y generando un umbral.

Utilice tejido adiposo humano comercial derivado de células madre mesenquimales de los primeros pasajes, preferiblemente por debajo de cinco. Cultivarlas a 37 grados y 4,6% de CO2 en el medio de crecimiento de células madre hasta alcanzar un 70 u 80% de confluencia. Siembre las células a una densidad celular de 3.000 células por centímetro cuadrado en los sustratos en un medio inductor de condrogénesis.

Cambie el medio cada tres días. La etapa de condensación se puede observar desde el primer día de cultivo, y su evolución se puede seguir con un microscopio óptico de contraste de fase durante todos los laboratorios de cultivo. Fije las celdas con una solución de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego lávelas con PBS.

Bloquee los grupos de furaldehído agregando una solución de 50 milimolares de cloruro de amonio en PBS. Dejar actuar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lavar con PBS.

Permeabilizar las células con una solución de saponina al 0,1% en la solución bloqueante de albúmina al 1% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Incubar con anticuerpos primarios en la solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. Lavar con PBS.

Incubar con anticuerpos secundarios en la solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente, evitando la exposición a la luz. Lavar con PBS y secar. Aplique el medio de montaje de la microscopía sobre las muestras y cúbralas suavemente con cubreobjetos.

Obtener imágenes de las muestras inmunoteñidas para la proteína de adhesión focal paxilina después de un día de inducción condrogénica, y para el marcador condrogénico temprano, colágeno II alfa I después de cinco días de inducción condrogénica utilizando un microscopio confocal vertical. Recoja secciones a un intervalo representativo, por ejemplo, 0,5 o 1 micrómetros. Filtre las imágenes teñidas con paxilina de la zona basal de los condensados celulares.

Elimine el fondo, alise y conviértalo en archivos de ocho bits. Hágalos binarios estableciendo un umbral seleccionado empíricamente. Trate un mínimo de tres condensados de celda por condición de tres muestras independientes.

Cuantifique las áreas seleccionadas y expréselas como el porcentaje correspondiente del área dividido por el número de núcleos celulares en la imagen. Para cuantificar la tinción de colágeno II alfa I, cree proyecciones Z confocales. Filtre las imágenes resultantes, elimine el fondo, suavice y establezca un umbral.

Cuantifique la suma del área proyectada, el área máxima de colágeno II alfa I por muestra frente al área del condensado de celda correspondiente. Se pueden obtener diferentes configuraciones de nanopatrones modificando la concentración inicial de dendrímeros en solución. Los nanopatrones se pueden visualizar mediante análisis AFM y diagramas de contorno de probabilidad para la distancia mínima entre partículas construida.

Resaltan las regiones de la superficie con la mayor densidad de superficie RGD local. Los nanopatrones de dendrímeros se utilizan en estudios de adhesión celular. La adherencia aumenta con la densidad superficial local de RGD.

Para el control positivo y las superficies que contienen agregados de dendrímeros, esta correlación se pierde. La influencia de la densidad superficial local de RGD se probó en la condrogénesis, tanto la condensación como la diferenciación celular se ven favorecidas por nanopatrones que presentan una adhesividad intermedia. En conclusión, el nanopatrón basado en dendrímeros en un método de tres tablas para abordar el efecto de la densidad local de RGD en la respuesta celular.

Los nanopatrones mantienen la adhesión celular de manera más eficiente en la superficie homogénea correspondiente comúnmente utilizada en el cultivo celular. En los experimentos de diferenciación, la adhesividad intermedia de las células al sustrato favoreció la condensación celular mesenquimal y la diferenciación cronogénica temprana. Debido a la fácil modificación del crecimiento periférico del dendrímero, el método aquí descrito puede extenderse aún más a todas las capas reumáticas excesivas que tienen efectos de densidad en las células.