En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

El objetivo general de este protocolo para el ensayo de conversión inducida por terremotos en tiempo real es permitir la detección sensible de priones de la enfermedad de desgaste crónico en muestras fecales de cérvidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de investigación de la CWD, como cuándo se infectan los priones de CWD en las heces. La principal ventaja de esta técnica es que es específica, sensible y permite un alto rendimiento de las muestras.

demostración del procedimiento estará a cargo de Ginny Cheng, una técnica de laboratorio de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue un gramo de material fecal a un tubo que contenga 10 mililitros de tampón de extracto de heces. Utilizando un disociador con un programa preestablecido para proteínas, homogeneice los gránulos fecales durante un minuto a temperatura ambiente.

Repita esto dos o tres veces hasta que las muestras fecales estén completamente homogeneizadas. A continuación, utilice parafilm para sellar los tubos y colóquelos en una plataforma oscilante o en un agitador giratorio para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Después de esto, centrifugar a 18.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Recoja los sobrenadantes y alículos en tubos de 1,5 mililitros. Almacene a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar. Para comenzar el método de precipitación de ácido fosfotúngstico sódico, agregue 250 microlitros de sarkosyl a un mililitro de extracto de proteína fecal.

Con parafilm, selle el tubo. Coloque el tubo en un mezclador térmico e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos con agitación constante a 1.400 rpm. Después de esto, agregue una solución madre que contenga 10% de ácido fosfotúngstico de sodio y cloruro de magnesio 170 milimolares de modo que la concentración final de ácido fosfotúngstico de sodio en las muestras sea del 3%Transfiera las muestras al mezclador térmico e incube a 37 grados centígrados durante dos horas con agitación constante a 400 rpm.

A continuación, centrifugar a 15.800 g durante 30 minutos a 14 grados centígrados. Retire con cuidado los sobrenadantes y lave los gránulos volviéndolos a suspender en el tampón de lavado. A continuación, centrifugar a 15.800 g durante 15 minutos a 14 grados centígrados.

Retire con cuidado los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tampón de dilución RT-QuIC. Almacene las muestras tratadas a menos 20 grados centígrados hasta que estén listas para realizar el ensayo RT-QuIC. Para comenzar, agregue 0,032 gramos de tioflavina T a 10 mililitros de agua bidestilada para preparar una solución madre fresca de tioflavina T de 10 milimolares.

A continuación, use agua destilada doble para hacer una dilución de uno a 10 de la solución madre, lo que da como resultado una concentración final de un milimolar de tioflavina T. Usando una jeringa equipada con un filtro de disco Acro de 0,2 micrómetros, filtre la solución de un milimolar de tioflavina T. A continuación, descongele el sustrato de proteína priónica más recombinante. Cargue 500 microlitros de sustrato de proteína priónica recombinante a la vez en microtubos de filtro de exclusión de tamaño Dalton de 100 kilos.

Centrifugar a 14.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de esto, transfiera el sustrato eluido a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Almacene a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar.

A continuación, descongele el tampón de dilución RT-QuIC almacenado. Diluya la semilla y prepare las soluciones madre y la mezcla de reacción RT-QuIC como se describe en el protocolo de texto. Con una pipeta con una punta de filtro, mezcle la mezcla de reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Vierta la mezcla en un depósito de pipeteo de eliminación de 50 mililitros. Con una pipeta multicanal, cargue 98 microlitros de mezcla de reacción RT-QuIC en cada pocillo de una placa inferior óptica de 96 pocillos. A cada reacción, agregue dos microlitros de extracto de proteína fecal sin diluir o diluido en serie 10 veces.

Luego use cinta de sellar para sellar la placa. Incubar en un lector de placas a 42 grados centígrados durante 25 horas con ciclos repetidos de un minuto de doble agitación orbital a 700 rpm y un minuto de reposo durante toda la incubación. Mientras tanto, defina la configuración de medición de fluorescencia como se describe en el protocolo de texto.

Después de 25 horas, retire la placa del lector de placas. Gire la placa a 3.000 g durante tres minutos para evitar una posible contaminación entre los pocillos. A continuación, retire el sello de la placa.

Prepare una nueva placa agregando 90 microlitros de mezcla de reacción RT-QuIC que contenga sustrato fresco y colorante de fluorescencia de tioflavina T fresco. Transfiera 10 microlitros de cada pocillo de la primera placa a la placa de 96 pocillos recién preparada. Use cinta de sellado para sellar la nueva placa.

Después de definir los ajustes de medición de fluorescencia, continúe el ensayo durante 50 horas adicionales. Lea y documente la señal de fluorescencia de tioflavina T para cada pocillo cada 15 minutos. A continuación, recopile y trace los datos como se describe en el protocolo de texto.

En este estudio, el material fecal de alce o ciervo bura no infectado se homogeneiza en tampón de extracto de heces para obtener una concentración final de muestra del 10%Algunos homogeneizados se procesan y se concentran 10 veces por precipitación de ácido fosfotúngstico sódico. Si bien se observa una reducción de las conversiones espontáneas en las muestras purificadas, todas las muestras mostraron señales de fluorescencia bajas en las muestras fecales positivas para CWD. Para mejorar la amplificación de priones y mejorar la sensibilidad de detección, se incorpora un paso de reemplazo de sustrato.

Las muestras que se sometieron a reemplazo de sustrato como parte del protocolo RT-QuIC muestran un aumento en la sensibilidad y especificidad de la detección, con 14 de las 18 muestras positivas y ninguno de los controles negativos registrado como falso positivo. Una vez dominado, la preparación del extracto fecal y la concentración de PRP/SCRP se pueden realizar en unas cuatro horas y el ensayo RT-QuIC se puede configurar en aproximadamente 1/1-2 horas si se realiza correctamente. Al intentar el procedimiento, es importante recordar filtrar el sustrato, pero nunca vórtice.

Después del procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el Western blot, para responder a preguntas adicionales, como la resistencia de las proteasas a los productos resultantes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los científicos en el campo de la investigación de priones exploraran la presencia de priones en animales vivos mediante el análisis de muestras fecales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y concentrar PRP/SCRP a partir de extractos fecales y cómo realizar un ensayo RT-QuIC modificado para obtener una detección de priones sensible y específica.

No olvide que trabajar con priones puede ser extremadamente peligroso y que es importante usar EPP adecuados y trabajar debajo de una cabina de bioseguridad mientras se realiza el procedimiento.