Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

El objetivo general de este método es purificar el ADN del virus del herpes simple tipo uno de las células infectadas para el análisis proteómico de las proteínas asociadas al genoma viral. Este método proporciona información clave sobre la participación de los factores celulares y la infección por el virus del herpes. La principal ventaja de esta técnica es que se puede adaptar para purificar directamente diferentes poblaciones de ADN viral de células infectadas, lo que permite analizar múltiples aspectos de la infección.

Comience este procedimiento con el cultivo de cinco células MRC como se describe en el protocolo de texto. A continuación, diluya el HSV-1 en solución salina fría tamponada con tris o TBS. Para los siguientes pasos, es importante apagar el soplador y la campana de cultivo de tejidos para evitar que las células se sequen.

Utilice una pipeta para transferir el medio de crecimiento de las células MRC 5 a un frasco estéril para volver a añadirlo a las células después de la infección. Infecta las células añadiendo siete mililitros de virus diluido a las células. Meca las células cada 10 minutos durante una hora a temperatura ambiente.

Después de la absorción, aspire el inóculo, enjuague las células con 50 mililitros de TBS a temperatura ambiente y reemplace el medio de crecimiento original. Luego, incube las células a 37 grados centígrados en presencia de un 5% de dióxido de carbono. Después del inicio de la replicación del ADN viral, alrededor de cuatro horas después de la infección, la etiqueta replica el ADN viral.

Para ello, diluya EdC en un mililitro de medio de crecimiento y añádalo al medio de cultivo celular de las células infectadas durante dos a cuatro horas. Para cosechar núcleos, reemplace el medio de crecimiento con 20 mililitros de tampón de extracción de núcleos e incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados con balanceo ocasional. Después de la incubación, raspe los núcleos de la placa con un raspador de células y transfiéralos a un tubo cónico de 50 mililitros con hielo.

Centrifugar durante 10 minutos a 2,500 x g y cuatro grados centígrados para pellet los núcleos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Desaloje suavemente el pellet nuclear en 10 mililitros de solución salina tampón de fosfato o PBS y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, centrifuga la muestra como antes. Después de retirar completamente el PBS, vuelva a suspender el pellet nuclear en 10 mililitros de mezcla de reacción de clic, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con una pipeta de 10 mililitros. Gire la muestra durante una hora a cuatro grados centígrados, antes de peletizar los núcleos como antes.

Retire completamente la mezcla de reacción rápida, luego lave el pellet volviéndolo a suspender suavemente en 10 mililitros de PBS y centrifugando nuevamente. Ahora, vuelva a suspender con cuidado el pellet nuclear en un mililitro de PBS y transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de la centrifugación, retire completamente el PBS y congele rápidamente el pellet en nitrógeno líquido.

En este punto, el pellet se puede almacenar a 80 grados centígrados o se puede continuar con el procedimiento. Para lisar los núcleos y fragmentar el ADN, vuelva a suspender los núcleos descongelados en 500 microlitros de tampón B1 pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la suspensión en hielo durante 45 minutos.

A continuación, sonique las muestras seis veces durante 30 segundos cada una con una amplitud del 40%, utilizando una sonda de micropunta de tres milímetros. Coloque las muestras en hielo durante al menos 30 segundos entre pulsos. Después de la sonicación, las muestras deben aparecer claras, no turbias.

Granular los restos de la célula centrifugando a 14.000 x G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. El tamaño del pellet debe disminuir sustancialmente, filtrar el sobrenadante a través de un filtro de células de 100 micras y retener el flujo. A continuación, añada 500 microlitros de tampón B2 al sobrenadante filtrado.

Para unir el ADN biotinilado a las perlas recubiertas de estreptavidina, prepare las perlas magnéticas de estreptavidina transfiriendo 300 microlitros de lodo de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Prepare un tubo de cuentas por muestra. Lave las perlas tres veces con un mililitro de tampón B2 mediante vórtice para volver a suspender, aplicándolo a un imán para separar las perlas y aspirando el tampón de lavado.

A continuación, añada 900 microlitros de la muestra a las perlas lavadas. El resto de la muestra se utilizará para el aislamiento de ADN y proteínas de entrada. Gire la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, coloque las muestras en una rejilla de tubos de microfuga magnética y retire el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente las perlas en un mililitro de tampón B2, antes de girar a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante de nuevo con la rejilla de tubos de microfuga magnética.

Esta vez, vuelva a suspender suavemente las cuentas en un mililitro de Buffer B3 y gírelas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante de la mezcla de perlas con el imán, vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de muestra Laemmli 2x para aludir a complejos de proteínas de ADN. A continuación, hierva las muestras a 95 grados centígrados durante 15 minutos.

Agite una mezcla antes de girar rápidamente las muestras en un microfuge. Aplique las muestras al imán y transfiera el lote a un nuevo tubo. Finalmente, congele rápidamente las muestras y guárdelas a 80 grados centígrados.

Realice el análisis de proteínas como se describe en el protocolo de texto. El marcaje de EdC se llevó a cabo durante cero, 20, 40 o 60 minutos, seguido de la purificación del ADN viral y las proteínas asociadas. Las proteínas eluidas se sometieron a tinción con azul de Coomassie y Western blot con el anticuerpo específico para las proteínas de unión al ADN viral, ICP4 y UL42.

La flecha indica la estreptavidina que se eliminó de las perlas durante la elución, que está presente en todas las condiciones. Las proteínas aisladas por este método se someten a espectrometría de masas. El gráfico circular ilustra el número de proteínas en cada categoría funcional que se encontraron asociadas con el tipo de virus del herpes simple en los genomas seis horas después de la infección.

Se llevó a cabo una observación más detallada de las interacciones proteína-proteína entre las proteínas identificadas utilizando la base de datos de la red de asociación de proteínas funcionales de cadena. Los resultados revelan subcomplejos de proteínas que funcionan juntas en el mismo proceso biológico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar el ADN viral de las células infectadas para la investigación proteómica de las proteínas asociadas al genoma viral.

Esta técnica se puede completar en tres o cuatro días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar precauciones para evitar la contaminación de las muestras por ADN o proteasa. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia para verificar la naturaleza del ADN viral marcado con EdC.

Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la virología del herpes exploren las funciones de las proteínas del huésped y la infección viral.