Name: Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a purificar ADN viral de Herpes Simplex virus tipo 1 en células infectadas para análisis proteómico. Este método identifica proteínas asociadas al genoma viral y factores celulares implicados en la infección.

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Reconocemos Hannah Fox para ayuda en la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant R01AI030612.

1. cultivo celular, infección Viral y etiquetado de EdC ( figura 1) el siguiente protocolo implica trabajar con virus. Por favor, consulte a su institución &#39; protocolos de bio-seguridad de s sobre manejo seguro de virus y otros agentes biológicos. Este protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh.
<ol><li>Trypsinize un frasco de cultivo de tejidos 2 150 cm confluentes de células MRC-5 y las células se transfieren a una placa de cultivo de tejidos de 600 cm 2 que contiene 100 mL DMEM y 10% FBS. Incubar a 37 ° C en presencia de 5% CO 2 para 3-4 días llegar a la fase estacionaria y confluency. Un plato de 2 cm 600 confluente contiene ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condición y 1 placa para cada control negativo correspondiente. 
	Nota: Las células deben llegar a la fase estacionaria para inhibir la replicación del ADN celular para asegurar que sólo vDNA es etiquetado y purificado en los pasos posteriores. 
	Nota: Cada muestra requiere una conexión sin etiqueta de control negativo preparado con las mismas condiciones de infección y momento sin la adición de EdC. 
	Nota: A escala versión de este experimento debe llevarse a paralelamente a la prueba para el etiquetado de la DNA celular por proyección de imagen usando el crecimiento de la célula comparable, infección, EdC etiquetado condiciones y puntos de tiempo (ver paso 2).</li>
	<li>Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 en 7 mL frío Tris-Buffered salino (TBS). Retire el medio de crecimiento y mantenga a 37 ° C. Para infectar, añadir 7 mL diluido virus células MRC-5 y por 1 h a temperatura ambiente. Después de adsorción, retirar el inóculo, lave con 50 mL temperatura TBS y reemplazar el original medio de crecimiento. Incubar a 37 ° C en presencia de 5% CO 2. Este paso debe realizarse para cada condición experimental y el control negativo. 
	Nota: EdC mayor etiquetado puede lograrse utilizando a HSV-1 mutantes defectuosos para la expresión del dUTPase viral (gen UL50) o uracil glicosilasa (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tiene especificidad de substrato baja y pueden disminuir la activación de varios análogos de los nucleósidos análogos 25 , 27.</li>
	Genomas virales de la etiqueta de <li>con EdC. Siga las instrucciones de etiqueta entrantes genomas (1.3.1.), replicación de genomas (1.3.2.), u horquillas de replicación viral (1.3.3).. 
	Nota: Único paso 1.3.1, 1.3.2 y 1.3.3 debe realizarse según genomas entrantes, genomas duplicados o las horquillas de replicación que se analizará en los pasos posteriores, respectivamente. 
	Nota: Puede sustituirse por EdC EdU o f ara EdU. La toxicidad de los análogos de nucleósidos debe supervisar y minimiza.
	<ol><li>Uso prelabeled las acciones a llevar a cabo la infección en el paso 1.2 y proceda al paso 2 o 3 a 4 horas post infección (hpi) para investigar sin replicar vDNA ( figura 1A). 
		Nota: Preparar virus prelabeled las existencias utilizando el protocolo descrito previamente 25. Las poblaciones de virus deben pasarse a través de una columna G-25 para quitar cualquier EdC residual.</li>
		<li>Etiqueta vDNA replicación mediante la adición de 5-25 μm EdC al medio de cultivo celular de las células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de agregar, diluir EdC en 1 mL de medio de cultivo.</li>
		<li>Para etiquetar las horquillas de replicación viral, después del inicio de la replicación vDNA (&#8805; 4 hpi), etiqueta de pulso replicar vDNA con 5-25 μm EdC durante 5-20 min. A perseguir, lavar 3 x con medio de chase que contiene 25-100 μm 2´deoxycytidine (deoxyC) y luego se incuban en presencia de medio de chase para un adicional 20-40 min ( figura 1). 
		Nota: Medio pulso y chase debe equilibrarse a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de su uso. 
		Nota: Para los experimentos de la persecución del pulso, es importante considerar la cantidad de tiempo que toma para que nucleósidos entrar en la célula y ser phosphorylated antes que pueden ser incorporados en la replicación de ADN. Esto debe determinarse empíricamente. 
		Nota: Para determinar la resolución de los experimentos de pulso chase, calcular la tasa de replicación viral bajo las condiciones experimentales utilizados. Esto puede ser determinado por PCR cuantitativa de genomas virales durante un solo paso crecimiento tiempo curso 26. 
		Nota: Para imágenes genomas virales proceda al paso 2 y para la purificación de los genomas virales, vaya al paso 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Proyección de imagen de EdC etiquetado ADN ( figura 2A) Nota: es útil para llevar a cabo la proyección de imagen junto con el método de purificación del genoma viral para verificar que el ADN celular no está etiquetado en experimentos. La proyección de imagen también puede utilizarse para visualizar la naturaleza del etiquetado vDNA y validar datos de proteómica. Ejemplos de ADN viral y celular, patrones de tinción se muestran en la figura 3.
<ol><li>Realizar infecciones y EdC etiquetado como se indica en el paso 1 excepto usando escala las condiciones sobre cubreobjetos en un plato de cultivo de tejidos de 12 pozos que contienen 1 mL de medio de cultivo.</li>
	<li>Fijar las células con 1 mL 3.7% paraformaldehido en PBS 1 x durante 15 min a TA. Después de la fijación, enjuague las células 2 x con 1 mL 3% BSA en PBS. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido puede causar lesiones graves o permanentes. Precauciones de seguridad. 
	Nota: El protocolo se puede detener aquí y cubreobjetos pueden conservarse a 4 ° C en el segundo lavado hasta 3 días.</li>
	<li>Permeabilizar las células con 1 mL de tampón de permeabilización [véase Tabla de materiales] por 20 min a temperatura ambiente mientras balanceo.</li>
	<li>Enjuague con 1 mL de 3% de BSA y luego cuadra con 1 mL 3% BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente mientras balanceo.</li>
	<li>Agregar 1 mL de la reacción de clic cóctel [véase Tabla de materiales] a cubreobjetos Conjugación covalente Alexa Fluor 488 azida a EdC etiquetado ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras la mecedora. Aspirar y lavar dos veces con 1 mL de PBS.</li>
	<li>Tinción de ADN celular con 1 mL de la dilución de 1:2,000 de Hoechst en PBS durante 30 min a temperatura ambiente mientras balanceo. Aspirar y lavar dos veces con 1 mL de PBS.</li>
	Protocolos de inmunofluorescencia indirecta de <li>tinción con los anticuerpos primarios y secundarios según el estándar 25. 
	Nota: Etiqueta vDNA colocalizes con ICP8, ICP4 o UL42 y etiquetada celulares ADN colocalizes con tinción de Hoechst.</li>
	<li>Montaje de cubreobjetos en portaobjetos y las células mediante un microscopio de fluorescencia de imagen. 
	Nota: Diapositivas pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas.</li>
</ol> 3. Purificación de proteínas asociadas y vDNA Nota: varios aspectos de este protocolo han sido adaptados de la Leung et al. 22 Nota: todos los buffers y reactivos deben ser enfriados en hielo antes de su uso y todas las medidas deben realizarse en hielo a menos que se indique lo contrario.
<ol><li>Núcleos de cosecha. 
	Nota: Antes de aislamiento de los núcleos, formaldehído puede utilizarse para la reticulación proteínas al ADN. Condiciones más estrictas de lavado pueden utilizarse durante la purificación de ADN en bolas recubiertas de estreptavidina. Para crcondiciones de osslinking y lavado ver Sirbu et al. 21. <ol><li>reemplazar el medio de cultivo con 20 mL de tampón de extracción de núcleos (NEB) e incubar por 20 min a 4 ° C con oscilación ocasional. Los núcleos serán visibles en el microscopio.</li>
		<li>Raspar el núcleo de la placa usando un raspador celular y transferir a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar durante 10 min a 2.500 x g a 4 ° C a núcleos de la pelotilla, descartar el sobrenadante. 
		Nota: Trypan coloración azul se puede utilizar para verificar el aislamiento de los núcleos de las células.</li>
		<li>Suavemente desalojar el pellet nuclear en 10 mL de PBS, transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL y de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente quitar PBS. 
		Nota: Los núcleos pueden ser congelados y el protocolo se puede detener en este punto. Para ello, con cuidado Resuspender el precipitado nuclear en 500 μl de congelación de búfer e incubar el tubo en un baño de hielo seco/etanol. Almacenar los núcleos congelados a-80 ° C. Antes de usar, descongelar núcleos a temperatura ambiente, transferir rápidamente al hielo, añadir 10 mL de PBS, roca suavemente a la mezcla, de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C y eliminar completamente PBS. Núcleos de congelación puede resultar en rendimiento reducido.</li>
	</ol></li> <li>Covalentemente conjugada biotina-azida a EdC etiquetado vDNA.
	<ol><li>Resuspender el pellet nuclear en reacción de click 10 mL de la mezcla [véase Tabla de materiales] transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 10 mL. 
		Nota: Es importante que los reactivos incluidos en la mezcla de reacción de clic se agregan en el orden indicado.</li>
		<li>Gire durante 1h a 4 ° C. Mientras gira preparar y enfriar búferes de B1, B2 y B3 [véase Tabla de materiales].</li>
		<li>Núcleos de sedimento por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente eliminar haga clic en la opción de mezcla de reacción y lavar el precipitado resuspender en 10 mL de PBS suavemente y centrifugar 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Suavemente Resuspender el pellet nuclear en 1 mL de PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con una pipeta de gran diámetro. Núcleos de pellets por centrifugación 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente quitar PBS y flash congelación en nitrógeno líquido. 
		Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto y núcleos congelados pueden almacenarse a-80 ° C. congelación deshielo ayuda con posterior lisis, lo que se recomienda que los núcleos sean flash congelado incluso cuando procediendo a paso 3.3 en el mismo día.</li>
	</ol></li> <li>Lyse núcleos y fragmento de la DNA.
	<ol><li>Descongelar los núcleos de hielo y resuspender en 500 μl tampón B1 mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar en hielo durante 45 minutos</li>
		<li>Muestras de someter a ultrasonido 6 veces para 30 s cada en amplitud 40% utilizando una sonda de microtip de 3 mm. Coloque las muestras en hielo por 30 s entre pulsos. Después de la sonicación, muestras deben aparecer clara, turbia no. 
		Nota: Condiciones de sonicación deben optimizarse para cada sonicators. Para obtener instrucciones detalladas sobre cómo optimizar las condiciones de la sonicación se refieren a Leung et al. 22.</li> <li>de la pelotilla de restos celulares por centrifugación a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C. El tamaño de la pelotilla debe disminuir sustancialmente. Filtrar el sobrenadante a través de filtro de la célula de 100 μm y mantener el flujo a través de.</li>
		<li>Añadir 500 μl tampón B2 para el sobrenadante filtrado. 900 μl de esta muestra se utilizará en paso 3.4.2.</li>
		<li>Tomar una alícuota de cada condición para aislamiento de DNA (volumen de 1/20 o 50 μL) y añadir 50 μl de 2 x solución SDS-bicarb [véase Tabla de materiales]. Continúe con el protocolo de aislamiento de ADN (paso 3.6).</li>
		<li>Tomar una alícuota de cada condición de entrada proteína (volumen de 1/20 o 50 μL) y añadir 50 μl de 2 x Tampón Laemmli, congelar en nitrógeno líquido y guardar a -80 ° C. uso de paso 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Enlace biotinilado ADN a estreptavidina cubierto cuentas.
	<ol><li>T1 de estreptavidina preparar granos magnéticos al transferir 300 μL de la mezcla de grano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Preparar un tubo de granos por muestra. Perlas de lavado 3 veces con 1 mL de tampón B2 Vortex para suspender de nuevo, aplicando un imán para separar los granos, y aspirando el tampón de lavado. 
		Nota: Optimizado vinculante el resultado de las condiciones en producción maximizada y Unión de fondo mínimo. Se determinó experimentalmente que granos magnéticos Streptavidin T1 tienen una capacidad significativamente mayor de perlas de agarosa, así como otros granos de estreptavidina y menos fondo obligatorio de Streptavidin C1 granos ( Figura 4A ).</li>
		<li>Agregar 900 μl de la muestra del paso 3.3.4. los granos lavados y girar durante la noche a 4 ° C. 
		Nota: No no granos de vortex, una vez que la muestra se agrega a ellos. 
		Nota: Si cantidades significativas de ADN o de proteína están aisladas en el control negativo sin etiqueta, este paso se puede reducir de la noche a la mañana a 4 h para reducir el atascamiento de fondo.</li>
	</ol></li> <li>Lavar granos y eluir proteínas asociadas y vDNA. 
	Nota: Se recomienda usar puntas de filtro para los pasos restantes.
	<ol><li>Muestras de lugar en un bastidor de tubo de microcentrífuga magnético, eliminar sobrenadante, resuspender suavemente en 1 mL de tampón B2, gira a 4 ° C por 5 min</li>
		<li>Tres veces Repita el paso 3.5.1.</li>
		<li>Coloque las muestras en un bastidor de tubo de microcentrífuga magnético, eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 mL de tampón B3 y mueva levemente a 4 ° C por 5 min</li>
		<li>Transferir 100 μl del grano mezcla (volumen del th del 1/10) a un nuevo tubo para aislamiento de DNA dependiente. Este tubo se aplica al imán, eliminar sobrenadante, resuspender granos en 100 μL 1 x solución de SDS bicarb y continúe con el protocolo de aislamiento de ADN (paso 3.6).</li>
		<li>Aplicar el tubo que contiene la mezcla restante del grano de 900 μl de paso 3.5.3. al imán, eliminar el sobrenadante y resuspender granos en 50 μl de 2 x Laemmli sample buffer eluir proteínas y complejos ADN-proteína.</li>
		<li>Hervir las muestras a 95 ° C por 15 min, vortex, rápidamente gira en la microcentrífuga y aplicar el imán. Transferencia de eluato a un nuevo tubo flash congelar y conservar a -80 ° C. 
		Nota: Abren cerraduras de casquillo de uso para asegurar que los tubos no haga al hervir. 
		Nota: El protocolo se puede detener en este punto y las muestras pueden almacenarse a-80 ° C durante varias semanas.</li>
		<li>Analizar las muestras de proteína por tinción de Coomassie Blue, western blot o espectrometría de masas por procedimientos estándar 25. Resultados representativos se muestran en la figura 4 y figura 5. 
		Nota: Para determinar si el rendimiento de proteína es suficiente para espectrometría de masas, 7.5 μl de cada muestra se utiliza para el análisis por azul de Coomassie tinción y 7.5 μL para borrar occidental de un genoma viral representante asociado proteína (ICP4, ICP8 o UL42). El mismo volumen de lisados de paso 3.3.6. se ejecutan junto al control de niveles de entrada de la proteína. Luego se analiza la muestra restante (35 μL) por masa espectrometría como se describió anteriormente 25.</li>
	</ol></li> <li>De ADN <ol><li>incubar las muestras de pasos 3.3.5. y 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h. Quite de la muestra de granos magnéticos, si es necesario.</li>
		<li>Extraer muestras con alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico de 150 μL (PCI) y transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.</li>
		<li>La restante PCI con 100 μl del extracto Tris-EDTA (TE) y añadir la fase acuosa a un tubo nuevo.</li>
		<li>Extraer muestras con alcohol de cloroformo: isoamílico de 200 μl (24:1).</li>
		<li>Purificar la fase acuosa utilizando la PCR Purification Kit según el fabricante &#39; Protocolo s. 
		Nota: El indicador de pH en PB de búfer se volverá púrpura cuando se añade a la muestra. Añadir 10 & #181; L 3M de NaOAc pH 5.0 para disminuir el pH de la muestra.</li>
		<li>Concentración de ADN determinar usando un fluorómetro. 
		Nota: Este protocolo da típicamente 100-400 ng ADN de límite de grano. Ninguna DNA debe ser detectada en el efluente del control negativo en el que EdC no fue agregada en el paso 1.3.</li>
		<li>ADN puede almacenarse en un enlace de ADN bajo tubo a 4 ó - 20 ° C y puede ser utilizado para PCR en tiempo real o el análisis de secuenciación de alto rendimiento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo incluye varios pasos que, si no siguen cuidadosamente, pueden resultar en rendimiento de proteína redujo significativamente o contaminación con el ADN celular. Es esencial que las células fijas se utilizan para todos los experimentos para asegurar que el ADN celular no es etiquetado y purificada. Esto puede confirmarse por la ausencia de polimerasas de la DNA celulares en la muestra de proteína debido a HSV-1 no utilizar celular polimerasa de la DNA para la síntesis del genoma. EdC etiquetado y núcleos rec...

Virus tienen una capacidad limitada para realizar las funciones esenciales y por lo tanto depende de factores del anfitrión para facilitar los aspectos más importantes de infección que incluye transporte, replicación, reparación, recombinación y expresión génica viral. Las actividades de estos factores de host están a menudo aumentadas por proteínas virally codificadas. Además, el virus deben evitar detección e interferencia por respuestas celulares a la infección viral. Por lo tanto, las interacciones host de virus determinan el resultado de la infección. De primordial importancia es entender cómo virus alteran el ambiente celular para adaptar la maquinaria celular para facilitar procesos virales. De particular interés es identificar qué factores y procesos que actúan sobre genomas virales durante todo el ciclo infeccioso.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es que un doble trenzado DNA virus que infecta una parte sustancial de la población humana. En la primera hora de la infección, el genoma viral entra en el núcleo, donde una cascada de pedidos de la expresión génica viral sobreviene en coordinación con el viral de replicación de ADN (vDNA)1. En el núcleo, genomas están sujetas a regulación epigenética, se someten a reparación y recombinación y se empaquetan en la cápsida, que los primeros viriones de progenie se producen en menos de seis horas. La evaluación integral de las proteínas del genoma viral asociado a través del curso de la infección será sentar las bases para investigar los detalles moleculares de los procesos que actúan en genomas virales y se proporcionan la penetración en qué factores virales y celulares participan en distintas etapas de la infección.
Los métodos anteriores para la investigación de factores de huésped implicados en la infección viral incluyen la purificación de la afinidad de las proteínas virales para el análisis de las proteínas celulares asociadas2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estos ensayos han sido instrumentales para la identificación de los factores celulares implicados en las respuestas antivirales host, así como modificación de la cromatina viral, la expresión génica, y reparación del ADN. Sin embargo, es difícil determinar si las interacciones dependen de la asociación con vDNA y proteómica sólo proporciona la penetración en las interacciones que se producen en función de un factor viral específico. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se ha utilizado para identificar donde se unen las proteínas virales y celulares específicas a genomas virales10,11,12,13,14 , 15 y la hibridación in situ fluorescente (FISH) combinado con inmunocitoquímica ha permitido la visualización de los factores celulares que colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. estos ensayos permiten análisis espacial y temporal. Sin embargo, limitaciones incluyen la necesidad de anticuerpos altamente específicos, sensibilidad limitada y la necesidad de la visión anterior de las interacciones host de virus. Por lo tanto hemos desarrollado un método basado en iPOND (aislamiento de proteínas de ADN naciente)21 y aniPOND (acelerada nativa iPOND)22 selectivamente etiqueta y purificar vDNA de infectado las células para la identificación objetiva de genoma viral proteínas asociadas por espectrometría de masas. iPOND ha sido fundamental para la investigación de la dinámica de la bifurcación de replicación celular.
Para la purificación selectiva de los genomas virales de las células infectadas, replicar vDNA está etiquetado con nucleósidos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) o 5-ethynyl-2´-desoxicitidina (EdC) (figura 1), seguido de covalente verbal a azida de biotina a través, haga clic en química para facilitar la purificación del solo paso de genomas virales y las proteínas asociadas en bolas recubiertas de estreptavidina (figura 2B). Lo importante, las infecciones se llevan a cabo en las células fijas, que no participan en la replicación del ADN celular para permitir el etiquetado específico de vDNA. Además, la infección HSV-1 causa la detención del ciclo celular e inhibe celular ADN replicación23,24. Virus puede ser prelabeled antes de la infección para el análisis de proteínas relacionadas con genomas virales entrantes (figura 1A) o marcado durante la replicación del ADN para el análisis de proteínas relacionadas con vDNA recién sintetizada (figura 1B) 25. Además, los análisis de chase de pulso pueden utilizarse para investigar la naturaleza de las proteínas asociadas con la replicación viral las horquillas (figura 1)26. Además, vDNA ethynyl-modificado puede ser covalentemente conjugado con un fluoróforo de investigación espacial de la dinámica de la proteína (figura 2A y figura 3). La proyección de imagen permite la visualización directa de vDNA es un método gratuito para la validación de las interacciones vDNA-proteína y puede ser adaptada para rastrear genomas virales a lo largo de la infección. Esperamos que estos enfoques podrían modificarse aún más para el estudio de cualquier aspecto de la infección herpética, incluyendo latencia y reactivación y para el estudio de otros virus ADN. Por otra parte, etiquetado con uridina 5-ethynyl (UE) podría permitir el análisis de genomas virales de RNA.

<table><tbody><tr><td>Células MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Sustituido con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM&nbsp; (para el crecimiento en matraces) o 30 mM (para el crecimiento en placas) bicarbinato de sodio</td></tr><tr><td>600 cm2 plato de cultivo de tejidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Solución salina tamponada (TBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine</td></tr><tr><td>Culata</td><td></td><td></td> HSV-1 <td>Las culatas con títulos superiores a 1x109 PFU/mL funcionan mejor</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&nbsp; columna (PD-10 Columna de desalinización)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&agudo;-Etinil-2--desoxicitidina (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Disolver en DMSO para preparar 40 mM de caldo, alícuota y almacenar a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2&agudo;-desoxicitidina (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Disolver en agua para preparar 40 mM de caldo, alícuota, y almacenar a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón de extracción nuclear (NEB)</td><td></td><td></td><td>Preparar en fresco (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM de sacarosa, 0,5% Igepal)</td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr>Solución azul de<td>tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (diluir a 1x en agua estéril antes de usar)</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM de caldo y almacene a 4 & grados; C hasta por 1 mes</td></tr><tr><td>(+) L-ascorbato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Preparar 100 mM de caldo y almacenar en hielo hasta su uso</td></tr><tr><td>Biotina azida</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM de caldo en DMSO, alícuota, y almacene a -20 &deg; C hasta por 1 año&nbsp;</td></tr><tr><td>Haga clic en Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Prepare inmediatamente antes de usar agregando reactivos en el orden indicado (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM de Biotina Azide, 1 mL 100 mM de ascorbato de sodio)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Cóctel Completo Inhibidor de Proteasa Roche</td><td>11697498001</td><td></td><td>Disolver en 1 mL de agua para preparar 50x caldo, puede almacenar a 4 & grados; C hasta por 1 semana, o agregue directamente 1 pastilla a 50 mL de tampón</td></tr><tr><td>de congelación Tampón</td><td></td><td></td> de congelación <td>Prepare fresco (7 mL de glicerol al 100%, 3 mL de NEB, 200 &mu; L 50x inhibidor de la proteasa)</td></tr><tr><td>Tampón B1</td><td></td><td></td><td>Preparar en fresco (25 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inhibidor de la proteasa)</td></tr><tr><td>Tampón B2</td><td></td><td></td><td>Preparar en fresco (150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5% de Igepal, 1x inhibidor de la proteasa)</td></tr><tr><td>Tampón B3</td><td></td><td></td><td>Preparar en fresco (150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1x inhibidor de proteasa)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipado con una sonda de micropunta de 3 mm</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón</td><td></td><td></td> de muestra Laemmli <td>Mezcle 400 mg de SDS, 2 mL de glicerol al 100%, 1,25 mL de 1 M de Tris (pH 6,8) y 10 mg de azul de bromofenol en 8 mL de agua. Tienda en 4&nbsp; &deg; C hasta por 6 meses. Antes de usar, agregue 1 M de DTT hasta una concentración final de 200 mM.</td></tr><tr><td>Cierres de tapa para tubo de 1,5 ml</td><td>Reactivos</td><td></td> de Western Blot estándar NC9679153 <td></td></tr> Fisher <tr><td>Scientific Kit de tinción azul coloidal NOVEX</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Cubrecubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% de paraformaldehído</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Diluir al 3,7% en 1x PBS antes de usar</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Preparar 3% en 1x PBS</td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización (0,5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Preparar 0,5% Triton-X 100 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Cóctel de reacción de clic - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenes</td><td>Sondas moleculares</td><td>C10337</td><td>Preparar según el protocolo del fabricante</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Preparar 10 mg/mL en agua, puede almacenar a 4 & grados; C durante un máximo de 1 año</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-ICP8 de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Utilizar una dilución 1:200 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-UL42 de ratón (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Utilizar una dilución 1:200 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat Anticuerpo secundario conjugado con 594</td> ratones <td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Utilice una dilución 1:500 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific 9990402</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-solución de bicarbonato</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Fenol:cloroformo:alcohol</td><td></td><td></td> isoamílico <td>Mezclar 25:24:1 al menos 1 día antes de usar, almacenar a 4 & grados; C en la oscuridad</td></tr><tr><td>cloroformo:alcohol</td><td></td><td></td> isoamílico <td>Mezclar 24:1 al menos 1 día antes de usar, almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluir a 1x antes de usar)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato de sodio pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia equipado con software</td><td></td><td></td><td></td>de imagen</tr><tr><td>Microcentrífuga para tubos de</td><td></td><td></td><td></td>1,5 mL</tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa para tubos de</td><td></td><td></td><td></td>15 y 50</tr><tr><td>mL Célula incubadora de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cultivo Biosafety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &deg; C y 95 &deg; C</td></tr></tbody></table>

purificación de adn viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

El objetivo de este protocolo es para aislar el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) DNA de las células infectadas para la identificación de asociado viral y celulares proteínas por espectrometría de masas. Aunque proteínas que interaccionan con genomas virales desempeñan un papel importante en determinar el resultado de la infección, un análisis exhaustivo de las proteínas del genoma viral asociado no era previamente posible. Aquí nos muestran un método que permite la purificación directa de los genomas de HSV-1 de las células infectadas. Replicación de ADN viral selectivamente se etiqueta con nucleótidos modificados que contienen un grupo funcional de alquino. Etiquetado ADN es entonces irreversible y específicamente etiquetada vía el accesorio covalente de la azida de biotina través de cobre (I)-catalizado reacción de cicloadición o clic de azida-alquino. DNA etiquetados biotina es purificado en bolas recubiertas de estreptavidina y las proteínas asociadas son eluidas identificadas por espectrometría de masas. Este método permite la focalización selectiva y el aislamiento de las horquillas de replicación de HSV-1 o genomas enteros de entornos biológicos complejos. Además, la adaptación de este enfoque permitirá la investigación de diversos aspectos de la infección herpética, así como el examen de los genomas de otros virus ADN.

El uso de la química del tecleo para la purificación de la DNA de las células primero fue logrado por el método de iPOND21. El propósito de iPOND es purificar las horquillas de replicación celular para la identificación de las proteínas asociadas. Hemos adaptado esta técnica para estudiar específicamente las interacciones proteína vDNA durante la infección. Manipulación del acercamiento a la etiqueta de genomas virales con EdC (figura 1</strong...

El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

El objetivo general de este método es purificar el ADN del virus del herpes simple tipo uno de las células infectadas para el análisis proteómico de las proteínas asociadas al genoma viral. Este método proporciona información clave sobre la participación de los factores celulares y la infección por el virus del herpes. La principal ventaja de esta técnica es que se puede adaptar para purificar directamente diferentes poblaciones de ADN viral de células infectadas, lo que permite analizar múltiples aspectos de la infección.Comience este procedimiento con el cultivo de cinco células MRC como se describe en el protocolo de texto. A continuación, diluya el HSV-1 en solución salina fría tamponada con tris o TBS. Para los siguientes pasos, es importante apagar el soplador y la campana de cultivo de tejidos para evitar que las células se sequen.Utilice una pipeta para transferir el medio de crecimiento de las células MRC 5 a un frasco estéril para volver a añadirlo a las células después de la infección. Infecta las células añadiendo siete mililitros de virus diluido a las células. Meca las células cada 10 minutos durante una hora a temperatura ambiente.Después de la absorción, aspire el inóculo, enjuague las células con 50 mililitros de TBS a temperatura ambiente y reemplace el medio de crecimiento original. Luego, incube las células a 37 grados centígrados en presencia de un 5% de dióxido de carbono. Después del inicio de la replicación del ADN viral, alrededor de cuatro horas después de la infección, la etiqueta replica el ADN viral.Para ello, diluya EdC en un mililitro de medio de crecimiento y añádalo al medio de cultivo celular de las células infectadas durante dos a cuatro horas. Para cosechar núcleos, reemplace el medio de crecimiento con 20 mililitros de tampón de extracción de núcleos e incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados con balanceo ocasional. Después de la incubación, raspe los núcleos de la placa con un raspador de células y transfiéralos a un tubo cónico de 50 mililitros con hielo.Centrifugar durante 10 minutos a 2,500 x g y cuatro grados centígrados para pellet los núcleos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Desaloje suavemente el pellet nuclear en 10 mililitros de solución salina tampón de fosfato o PBS y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros.A continuación, centrifuga la muestra como antes. Después de retirar completamente el PBS, vuelva a suspender el pellet nuclear en 10 mililitros de mezcla de reacción de clic, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con una pipeta de 10 mililitros. Gire la muestra durante una hora a cuatro grados centígrados, antes de peletizar los núcleos como antes.Retire completamente la mezcla de reacción rápida, luego lave el pellet volviéndolo a suspender suavemente en 10 mililitros de PBS y centrifugando nuevamente. Ahora, vuelva a suspender con cuidado el pellet nuclear en un mililitro de PBS y transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de la centrifugación, retire completamente el PBS y congele rápidamente el pellet en nitrógeno líquido.En este punto, el pellet se puede almacenar a 80 grados centígrados o se puede continuar con el procedimiento. Para lisar los núcleos y fragmentar el ADN, vuelva a suspender los núcleos descongelados en 500 microlitros de tampón B1 pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la suspensión en hielo durante 45 minutos.A continuación, sonique las muestras seis veces durante 30 segundos cada una con una amplitud del 40%, utilizando una sonda de micropunta de tres milímetros. Coloque las muestras en hielo durante al menos 30 segundos entre pulsos. Después de la sonicación, las muestras deben aparecer claras, no turbias.Granular los restos de la célula centrifugando a 14.000 x G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. El tamaño del pellet debe disminuir sustancialmente, filtrar el sobrenadante a través de un filtro de células de 100 micras y retener el flujo. A continuación, añada 500 microlitros de tampón B2 al sobrenadante filtrado.Para unir el ADN biotinilado a las perlas recubiertas de estreptavidina, prepare las perlas magnéticas de estreptavidina transfiriendo 300 microlitros de lodo de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Prepare un tubo de cuentas por muestra. Lave las perlas tres veces con un mililitro de tampón B2 mediante vórtice para volver a suspender, aplicándolo a un imán para separar las perlas y aspirando el tampón de lavado.A continuación, añada 900 microlitros de la muestra a las perlas lavadas. El resto de la muestra se utilizará para el aislamiento de ADN y proteínas de entrada. Gire la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, coloque las muestras en una rejilla de tubos de microfuga magnética y retire el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente las perlas en un mililitro de tampón B2, antes de girar a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante de nuevo con la rejilla de tubos de microfuga magnética.Esta vez, vuelva a suspender suavemente las cuentas en un mililitro de Buffer B3 y gírelas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante de la mezcla de perlas con el imán, vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de muestra Laemmli 2x para aludir a complejos de proteínas de ADN. A continuación, hierva las muestras a 95 grados centígrados durante 15 minutos.Agite una mezcla antes de girar rápidamente las muestras en un microfuge. Aplique las muestras al imán y transfiera el lote a un nuevo tubo. Finalmente, congele rápidamente las muestras y guárdelas a 80 grados centígrados.Realice el análisis de proteínas como se describe en el protocolo de texto. El marcaje de EdC se llevó a cabo durante cero, 20, 40 o 60 minutos, seguido de la purificación del ADN viral y las proteínas asociadas. Las proteínas eluidas se sometieron a tinción con azul de Coomassie y Western blot con el anticuerpo específico para las proteínas de unión al ADN viral, ICP4 y UL42.La flecha indica la estreptavidina que se eliminó de las perlas durante la elución, que está presente en todas las condiciones. Las proteínas aisladas por este método se someten a espectrometría de masas. El gráfico circular ilustra el número de proteínas en cada categoría funcional que se encontraron asociadas con el tipo de virus del herpes simple en los genomas seis horas después de la infección.Se llevó a cabo una observación más detallada de las interacciones proteína-proteína entre las proteínas identificadas utilizando la base de datos de la red de asociación de proteínas funcionales de cadena. Los resultados revelan subcomplejos de proteínas que funcionan juntas en el mismo proceso biológico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar el ADN viral de las células infectadas para la investigación proteómica de las proteínas asociadas al genoma viral.Esta técnica se puede completar en tres o cuatro días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar precauciones para evitar la contaminación de las muestras por ADN o proteasa. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia para verificar la naturaleza del ADN viral marcado con EdC.Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la virología del herpes exploren las funciones de las proteínas del huésped y la infección viral.

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El genoma del virus de influenza A se compone de ocho complejos separados de ARN y proteínas, denominadas complejos de ribonucleoproteína viral (vRNPs). Este trabajo describe la purificación gradiente de glicerol y de microscopía electrónica de transmisión de visualización de la gripe A vRNPs.

Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el...

Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando &quot;Genómica solo virus &#39;

Los virus de influenza replicar su genoma de ARN, en asociación con la cromatina de la célula huésped. A continuación, presentamos un método para purificar intactas ribonucleoprotein complejos virales de la cromatina de las células infectadas. Purificada complejos virales pueden ser analizados por tanto Western blot y extensión del cebador de contenido de proteínas y ARN, respectivamente.

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

Proporcionamos una estrategia novedosa para aislar compartimentos de replicación viral (RC) de células humanas infectadas con adenovirus (Ad). Este enfoque representa un sistema libre de células que puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la replicación y expresión del genoma viral, así como la regulación de las interacciones viral-huésped establecidas en el RC.

Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

Aquí presentamos un nuevo enfoque para identificar virus con genomas de ADN de doble cadena. Usamos métodos estándar para extraer el ADN y el ARN de hojas infectadas y llevar a cabo la secuenciación de próxima generación. Herramientas bioinformáticas montan secuencias en contigs, identifican contigs representación de genomas del virus y asignan genomas a grupos taxonómicos.

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de...

Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

Aquí, describimos un inmunoensayo fluorescente multiplex recientemente desarrollado que utiliza un sistema citométrico de flujo de doble reportero para detectar simultáneamente dos epítopos únicos de proteína de pico en partículas virales intactas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que habían sido capturadas por microesferas magnéticas acopladas a la enzima convertidora de angiotensina-2.

Perfil de epítopos de proteínas de superficie en partículas virales mediante la estrategia Multiplex Dual-Reporter

Aprende a purificar ADN viral de Herpes Simplex virus tipo 1 en células infectadas para análisis proteómico. Este método identifica proteínas asociadas al genoma viral y factores celulares implicados en la infección.

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

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