Segunda generación armónica las señales en esclera de conejo como una herramienta para la evaluación del tejido terapéutico Cross-linking (TXL) para la miopía

El objetivo general de este protocolo es demostrar el uso de la microscopía de segunda generación de armónicos para visualizar y medir el efecto de reticulación del colágeno en el tejido escleral inducido por la inyección de agente liberador de formaldehído de sub-tenon, y confirmado con calorimetría diferencial de barrido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reticulación de tejidos terapéuticos al proporcionar un método no invasivo para evaluar los efectos de reticulación inducidos. La principal ventaja de esta técnica es que las señales generadas por el segundo armónico son muy específicas de las fibrillas del collage y, como tal, no se requiere una preparación especial del tejido, como la tinción de anticuerpos.

La primera vez que tuvimos esa idea de este método fue cuando leímos sobre el procedimiento que se aplicaba a la reticulación terapéutica del tejido corneal. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el éxito de la microscopía de generación de segundos armónicos requiere una colocación cuidadosa del tejido y el establecimiento de las condiciones de imagen correctas para evitar daños en el tejido y artefactos en la medición de señales. Comience el tratamiento con la inyección de sub-tenon en los globos oculares del conejo como se describe en el protocolo de texto.

Aquí se muestra una representación esquemática del sitio de inyección del sub-tenón. Seleccione un espéculo de tamaño óptimo de acuerdo con el tamaño del ojo. Después de tres horas y media de incubación, retraiga los párpados con el espéculo palpebral para optimizar el acceso al globo.

Separe la conjuntiva que rodea el limbo y corte los músculos oculares adicionales en sus sitios de inserción escleral. Corte la parte superior de la esclerótica con unas tijeras o una cuchilla para crear un área de un centímetro con el sitio de inyección ubicado en el centro. Raspe las capas restantes de retina y coroides y lave dos veces con PBS fresco, dejando cada vez las piezas en solución durante aproximadamente 10 segundos.

Coloque el tejido en tubos de un mililitro llenos de solución de PBS para transportarlo al centro de diagnóstico por imágenes. Para maximizar la señal y la resolución al realizar microscopía SHG, utilice una lente objetivo optimizada para transmitir luz infrarroja y con una alta apertura numérica. Ajuste el collar de corrección de la lente para que coincida con la profundidad de la muestra.

En este caso, 0,17 milímetros. Monta la lente del objetivo de 25 veces en el microscopio y añade una cantidad generosa de gel de inmersión a base de agua para cubrir la superficie de la lente. Es importante realizar la obtención de imágenes de tejido dentro de los 30 minutos posteriores al montaje de la muestra en el microscopio para mantener el tejido hidratado y evitar que el gel de inmersión se seque entre el objetivo de la lente y el portaobjetos, ya que daría lugar a cambios en la señal SHG.

Ensamble la cámara de la celda colocando un cubreobjetos redondo de 25 milímetros en la parte inferior de la cámara. Coloque el trozo de tejido esclerótico en el cubreobjetos y agregue de 50 a 100 microlitros de tampón. Cubra el pañuelo con un segundo cubreobjetos redondo y atornille la parte superior de la cámara sin presionar ni aplanar el tejido.

A continuación, monte la cámara celular con la muestra de tejido en la platina del microscopio. Coloque la platina y ajuste la altura del objetivo de modo que la superficie inferior de la muestra esté enfocada, según lo determinado por la inspección de campo claro a través del ocular. Apague todas las luces, excepto el monitor de la computadora, y bloquee la mayor cantidad posible de luz del monitor con láminas de papel de aluminio colocadas sobre la platina del microscopio.

En el software, desactive el modo Eye Port. En el panel TI Pad, compruebe que la definición de la lente sea correcta. En el panel de la interfaz gráfica de usuario compacta A1, elija el láser infrarrojo para la obtención de imágenes, seleccione los detectores no desescaneados y elija el canal DAPI que esté equipado con un filtro de paso de banda de 400 a 450 nanómetros.

En el panel de la interfaz gráfica de usuario A1 Multi Photon, ajuste la longitud de onda del láser infrarrojo a 860 nanómetros y abra el obturador. Espere hasta que se cambie la longitud de onda de emisión como lo indica la luz verde fija. Para establecer las condiciones de escaneo láser en el panel de la interfaz gráfica de usuario compacta A1, seleccione el escáner Galvano, el escaneo direccional unitario, un tamaño de fotograma de 1024 por 1024 píxeles, un tiempo de permanencia de píxeles de 6,2 microsegundos y un promedio de línea de 2X.

A continuación, active la imagen en directo con el modo de búsqueda y establezca las condiciones de imagen en el panel de la interfaz gráfica de usuario compacta de IA ajustando la potencia del láser y la ganancia del detector. Establezca la potencia del láser entre 50 milivatios y 150 milivatios, es decir, entre el dos y el seis por ciento para un láser de 860 nanómetros. Por encima de este rango, puede producirse daño tisular.

Abra el panel de la tabla de búsqueda, que muestra un histograma de los valores de intensidad de píxeles en la imagen actual, y ajuste aún más la ganancia del detector en la barra etiquetada HV para maximizar el rango de valores de píxeles y evitar la saturación. Utilice la muestra con la señal SHG más alta para encontrar los ajustes óptimos de láser y ganancia. Mantenga una configuración idéntica para todas las muestras que se van a comparar en un experimento.

Esta práctica garantiza que ninguna muestra del experimento sature el detector. Para escanear el tejido que está en modo de vista previa, abra la herramienta de descripción general XYZ. Ajuste la imagen a una resolución más baja para acelerar la adquisición de imágenes en este modo.

En el panel de descripción general XYZ, haga clic con el botón derecho en la posición actual y seleccione escanear cinco por cinco, tres por tres o captura de vista única. Una vez finalizado el escaneo, desplácese a una nueva ubicación haciendo doble clic en un área fuera del área de vista previa actual. Active el modo de escaneo en vivo y, a continuación, enfoque el tejido, ya que las diferentes regiones del tejido pueden tener posiciones ligeramente diferentes en la dirección axial.

Capture un nuevo campo de visión de cinco por cinco, tres por tres o uno solo. Repita este proceso hasta que se haya obtenido una vista previa de un área grande del tejido. En la herramienta de vista general XYZ, haga doble clic en una posición en la que se vean las fibras de colágeno en todo el campo de visión para mover la etapa a esa ubicación en particular.

Establezca la imagen en alta resolución, 1024 por 1024 píxeles y promedio de línea 2X. Active el modo Live Find, ajuste la posición del objetivo de modo que el plano inferior esté enfocado y, en el TI Pad, use la unidad Z para mover el plano óptico 10 micrómetros por encima de esta capa inferior. Adquiera una imagen usando el botón de captura, guarde la ubicación con el botón más en la herramienta de revisión XYZ.

Haga doble clic en una nueva ubicación y repita el ajuste de profundidad y el proceso de captura de imagen. Para cada pedazo de pañuelo, captura 10 imágenes. Los campos de visión no deben superponerse como se muestra en las ubicaciones guardadas en la herramienta de vista general XYZ.

Finalmente, coloque las piezas esclerales en un tubo de un mililitro con PBS inmediatamente después de completar la microscopía en preparación para el análisis de calorimetría diferencial de barrido posterior. Para empezar, corte la parte central del control y trate la esclerótica con unas tijeras. Seque cada cuadrado escleral con un pañuelo absorbente y colóquelo plano en el fondo de una bandeja DSC con pinzas dentadas.

Con el pañuelo en el interior y el labio engarzado y cubierto, pesa la sartén para obtener el peso húmedo del tejido. A continuación, coloque la muestra pesada en su ubicación designada en la bandeja del muestreador automático DSC. Cree un método utilizando software de gestión de instrumentos, especificando el peso del tejido y ejecute el análisis térmico utilizando los perímetros enumerados en el protocolo de texto.

Una vez completado, analice los datos de cada muestra extrayendo el pico de temperatura de transición en el que se produce la desnaturalización térmica utilizando el software de imágenes del instrumento. Las imágenes SHG de la esclerótica se analizaron en Fiji para determinar el brillo medio de los píxeles. Cuando se abre una imagen y se selecciona el menú de análisis seguido de la medición, se abre una tabla con resultados que contiene el brillo medio de la señal.

Como alternativa, en el menú Analizar, se selecciona Histograma para crear un histograma de valores de intensidad de píxeles que contenga información sobre el brillo medio y la variación de la señal en la imagen. Esta medición se repitió para todas las imágenes de las muestras de control y reticuladas. Aquí se muestran imágenes SHG representativas de la esclerótica con el análisis de histograma adjunto, incluido el brillo medio.

La muestra de control se caracteriza por una disposición ondulada de fibrillas. Aquí se muestra una muestra reticulada con 400 milimolares SMG con mayor intensidad de píxeles que revela fibras de colágeno que parecen más rectas. Los resultados del análisis térmico muestran el pico más alto de temperatura de desnaturalización y confirman el efecto de reticulación.

Se muestra la muestra de control y una curva de desnaturalización de la muestra reticulada de 400 milimolares. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar una muestra reticulada y cómo realizar la microscopía SHG en muestras esclerales. Por lo general, las personas nuevas en este método luchan con la inyección precisa en el espacio subespiga, extrayendo quirúrgicamente el cuadrado alrededor del sitio de inyección y configurando las condiciones de las imágenes para escanear el tejido en el modo de vista previa.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la autoluorescencia, para responder preguntas adicionales, como el análisis de elastina, incluida la cuantificación y la morfología. Las implicaciones de esta técnica de administración de agentes de reticulación se extienden hacia el tratamiento de la miopía alta y el estafiloma posterior, ya que proporciona un acceso más fácil al polo posterior con el fin de estabilizar el escleral. Las implicaciones de esta técnica de microscopía se extienden hacia el diagnóstico de miopía alta y las complicaciones causadas por el debilitamiento del colágeno mediante la medición del estado de reticulación del colágeno en la esclerótica enferma, o mediante la medición del resultado después de que se complete el procedimiento de reticulación deseado.

Por lo tanto, este método de reticulación y microscopía de segunda generación de armónicos puede proporcionar información sobre la reticulación escleral, también se puede aplicar a otros tejidos como la córnea, la piel, el cartílago, el tendón, la válvula cardíaca y los vasos sanguíneos.