Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Hola, soy Eric Gottwald y soy científico investigador en el Instituto para Interfaces Biológicas del Instituto de Tecnología Ware. Y hoy me gustaría presentarles nuestro sistema microbiactivo perfundido basado en un chip. Antes de poder utilizar el chip en aplicaciones de cultivo celular, debemos hidrolizar el polímero y desbloquear el área microestructurada.

Esto se logra simplemente sumergiendo el chip en diferentes concentraciones de isopropanol, comenzando con 100%. Sumerjo el chip solo unos segundos en cada concentración y el paso final es solo agua. Posteriormente, el chip se seca y finalmente debemos recubrirlo con una solución de colágeno tipo I para facilitar la adhesión de las células al polímero. Esto se realiza goteando solo unas pocas gotas de una solución de colágeno tipo I sobre el área microestructurada, y en este estado, el chip se incuba a cuatro grados Celsius durante la noche.

Después de la incubación nocturna con la solución de colágeno tipo I, se elimina la solución y el chip se lava con PBS estéril. Posteriormente, también se elimina el PBS y el chip ya está listo para la inoculación de las células. Ahora inocularemos el chip celular con una suspensión de células individuales, lo cual se realiza simplemente colocando 150 microlitros de la suspensión celular sobre el área microestructurada. Después de la deposición de las células, el chip se incuba durante tres horas a 37 grados en un incubador.

Después del período de incubación de tres horas, se retira el chip del incubador y ya está listo para su inserción en el ector. Para ello, se saca el ector de su envase estéril, y la esterilidad se logra mediante irradiación gamma de esta lámina transparente. Por lo tanto, solo tenemos que abrir el envase y retirar el ector.

Lo que haremos a continuación es insertar la parte superior de la botella en este depósito de medio para poder desarmar la carcasa del biorreactor y así introducir el chip. Después de haber abierto la carcasa del biorreactor, ya podemos insertar el chip, lo cual se logra simplemente colocando el chip en la ranura de la carcasa del biorreactor, y luego el biorreactor puede volver a ensamblarse. Lo que finalmente debemos hacer es conectar dos filtros estériles al depósito de medio y un puerto estéril de muestreo.

Para la medición de la tensión real de oxígeno en el circuito cerrado, insertaremos dos sensores de oxígeno simplemente colocándolos entre estos dos conectores. El bactor ya está listo para ser llenado con medio de cultivo. El sistema bactor ya está preparado para llenarse con medio de cultivo celular, lo cual se logra conectando simplemente el circuito cerrado a la bomba de rodillos.

De este modo, despresurizaremos simultáneamente todo el circuito del bactor. Como puede observarse aquí en la ventana de Ector, se puede ver el medio ascendiendo desde abajo cada vez más, y saliendo del bactor por la parte superior. Antes de colocar el sistema Bactor en el incubador, verificamos que el llenado del circuito esté libre de burbujas.

Ahora el sistema está completamente lleno de medio de cultivo celular y podemos transferir el biorreactor al incubador. Ahora colocaremos el biorreactor en la cámara de incubación. Para ello, primero se conecta el biorreactor a la bomba peristáltica, como ya han visto brevemente antes, y ahora el biorreactor es perfundido activamente con este medio procedente del frasco.

Y para mantener la concentración ambiental de oxígeno, conectamos el depósito de medio al suministro de gas. Finalmente, conectaremos dos sensores de oxígeno al circuito para monitorear en línea la tensión de oxígeno en el sistema. Ahora el montaje está completo y puede funcionar todo el tiempo que dure el experimento diseñado.

Una de las herramientas más potentes durante el análisis de las funciones organotípicas de las células dentro de los contenedores MicroCon es el microscopio de barrido láser, que puede ver aquí. El microscopio de barrido láser nos brinda la oportunidad de observar cada contenedor MicroCon individual sin destruirlo. Y dado que los contenedores MicroCon o el chip pueden utilizarse con métodos convencionales de tinción inmunológica e inmunofluorescencia, somos capaces de detectar todo tipo de marcadores y funciones organotípicas dentro de los microcontenedores.

Como puede verse aquí en la animación de este chip, la parte inferior está completamente llena de células, así como las paredes del contenedor MicroCon. Tenemos una gran cantidad de células que se encuentran bastante viables, y muy, muy pocas células muertas. La siguiente imagen muestra que podemos detectar todo tipo de funciones organotípicas dentro del contenedor MicroCon.

Por ejemplo, en el caso de los hepatocitos, la producción de albúmina o la expresión de E podría observarse en las células, lo cual se aprecia claramente aquí en la superposición. Los núcleos están teñidos en azul. El eco aquí se tiñe en verde, y la albúmina se expresa o tiñe en rojo.

Y como puede verse aquí claramente, todas las funciones organotípicas que se esperan de los hepatocitos se expresan adecuadamente en este tipo de cultivo tridimensional. Además, hemos analizado otro marcador de hepatocitos, la citoqueratina 18, y esta imagen muestra que la citoqueratina 18 también se expresa adecuadamente en este tipo de cultivos. Y esto esperamos que les convenza de que este tipo de funciones organotípicas podría ser útil también para otros cultivos organotípicos.

Después del final del experimento Biore, el chip puede utilizarse para el aislamiento de todo tipo de componentes celulares, como por ejemplo, ARN total. Como puede ver aquí, en este caso le mostramos ARN total extraído del sistema de biorreactor. Este ARN total puede utilizarse posteriormente en aplicaciones de análisis posteriores, como por ejemplo, PCR en tiempo real, o como puede ver aquí, análisis de microarreglos.

Además, se pueden aislar células intactas del sistema y luego utilizar esas células para análisis convencionales mediante citometría de flujo. Como puede ver aquí, espero haber podido demostrarle que el sistema podría ser útil para todo tipo de aplicaciones en las que se requieran reacciones organotípicas y que el sistema podría ser útil para todos aquellos tipos de aplicaciones que hasta ahora no hemos considerado, como por ejemplo, aplicaciones con células madre.