Biblioteca de péptido superpuestas a epitopos Qa-1 en una proteína

El objetivo general de este procedimiento es identificar los epítopos de Qa-1 en las proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación inmunitaria y la inmunoterapia. Las principales ventajas de esta técnica son que se sabe que los péptidos mapeados estimulan las células T CD8 restringidas a Qa-1, y el procedimiento es fácil de realizar.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diseño terapéutico de enfermedades inmunomediadas, como la esclerosis múltiple. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación inmunitaria mediada por Qa-1 en animales, también puede aplicarse a la regulación inmunitaria mediada por HLA-E en humanos. Para comenzar el procedimiento, diseñe una biblioteca de péptidos de 15 meros, en la que los péptidos adyacentes se superponen en 11 aminoácidos.

Obtener y reconstituir los péptidos en condiciones estériles. Para cada péptido, combine cinco miligramos del péptido con 100 microlitros de dimetilsulfóxido. Combine 10 microlitros de cada caldo de péptidos en un tubo criogénico limpio de 1 mililitro para preparar el caldo de la piscina OLP.

A continuación, cargue 20 microlitros de cada cepo peptídico en una placa de 96 pocillos con fondo en V y diluya cada cepo con 80 microlitros de agua estéril. Almacene las existencias de péptidos de 50 miligramos por mililitro restantes y la placa de 10 miligramos por mililitro de péptidos a 20 grados centígrados. A continuación, agregue 10 microlitros de la solución madre de piscina OLP a un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de células dendríticas irradiadas en un medio libre de suero, diluyendo así el DMSO doscientas veces.

Almacene el stock restante de la piscina OLP a 20 grados centígrados. Incube los CD con la piscina OLP a temperatura ambiente durante tres horas. Agite suavemente las células cada 15 minutos con la mano.

Durante la incubación, use un kit para purificar las células T CD8+ de un bazo o ganglios linfáticos de ratón extraídos. Prepare cinco mililitros de una solución con 10 millones de células T por mililitro de medio libre de suero con 50 unidades por mililitro de interleucina 2 y 100 unidades por mililitro de interleucina 7. Las células T CD8 purificadas deben estar libres de perlas o intactas.

Coloque 0,5 mililitros de la solución de células T en cada uno de los 10 pocillos de una placa de 48 pocillos. Una vez completada la incubación de la solución de CC pulsada por piscina OLP, agregue 10 mililitros de medio libre de suero a las CC. Centrifugar las celdas a 300 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, reconstituya las células en cinco mililitros de medio libre de suero. Añade 0,5 mililitros de la suspensión celular a cada uno de los 10 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante cuatro días.

Luego, retire 400 microlitros del medio de cultivo de cada pocillo. Agregue 500 microlitros de medio fresco sin suero que contenga 100 unidades por mililitro de IL-2 e IL-7 a cada pocillo. Incube las células durante otros dos o tres días antes de volver a estimular las células preparadas para el grupo OLP.

Antes de la reestimulación, obtener e irradiar macrófagos peritoneales de ratón. Ajuste la concentración de macrófagos a cinco millones de células por mililitro de medio libre de suero. Combine 10 microlitros de la calda de la piscina OLP con dos mililitros de los macrófagos peritoneales irradiados para obtener una concentración final de DMSO del 0,5% en volumen.

Complemente esta solución con 100 unidades por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos murinos. Llene una placa de 48 pocillos con 200 microlitros de la solución de macrófagos OLP-pool en cada pocillo. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante cuatro horas.

A continuación, lave suavemente cada pocillo con 200 microlitros de medio RPMI-0 precalentado. La solución de macrófagos contendrá muchas perlas. Antes de agregar las células T CD8 cebadas en grupo de OLP, se debe revisar la placa bajo un microscopio para asegurarse de que todos los pocillos estén libres de perlas.

A continuación, recoja y agrupe las células CD8+T preparadas para el grupo de OLP que están listas para la reestimulación. Ajuste la concentración de células T a un millón de células por mililitro en un medio libre de suero que contenga 25 unidades por mililitro de IL-2 y 50 unidades por mililitro de IL-7. Agregue un mililitro de la solución de células T agrupadas a cada pocillo que contenga macrófagos pulsados en grupo OLP.

Cultive las células a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante cuatro días. A continuación, retira unos 400 microlitros del medio de cada pocillo. Añadir a cada pocillo 500 microlitros de medio fresco sin suero, conteniendo 100 unidades por mililitro de IL-2 e IL-7.

Reanudar la incubación en las mismas condiciones. Después de tres o cuatro días, examine las células reestimuladas para ver si hay una respuesta restringida de Qa-1 específica del grupo OLP con un ensayo de inmunolocalización ligado a la enzima interferón gamma. Refresque el medio de células T CD8 + cada tres o cuatro días mientras espera los resultados.

Realice un ensayo ELISPOT con las existencias de péptidos diluidos para determinar qué péptidos producen la secreción de interferón gamma restringido Qa-1 específica del grupo OLP. Por último, evalúe una serie de péptidos truncados con ELISPOT para identificar el epítopo óptimo de Qa-1. Un ensayo ELISPOT de interferón gamma mostró un aumento significativo en las células formadoras de manchas cuando las células T CD8+ estimuladas por la biblioteca de péptidos superpuestos de MOG agrupada se combinaron con C1R.

Células Qa-1b. Esto sugería que las células T respondían a los péptidos de unión a Qa-1 y que el MOG_pool contenía uno o más epítopos de unión a Qa-1. Se realizó otro ensayo para examinar los péptidos individuales en la piscina.

Tres péptidos mostraron respuestas que fueron al menos tres veces mayores que la respuesta en presencia de C1R. Células Qa-1b sin péptidos. De estos, se seleccionó el péptido con la mayor respuesta para una evaluación adicional.

Se evaluó una biblioteca de péptidos truncados basados en el péptido de 15 meros de interés para identificar el epítopo óptimo de Qa-1. Lo ideal sería que el epítopo fuera de ocho a 10 mer, siendo preferible el de nueve mer. Además, el epítopo óptimo mostraría una respuesta de interferón-gamma similar o más fuerte que el péptido de 15 meros.

El péptido truncado N-terminal de nueve meres es el que mejor se ajusta a estos criterios, lo que lo convierte en el epítopo óptimo de Qa-1. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la regulación inmunitaria descubrieran nuevos epítopos de Qa-1 para el estudio de la regulación inmunitaria en otros tejidos, como el páncreas. No olvide que trabajar con radiación puede ser extremadamente peligroso.

Los investigadores deben seguir estrictamente la política institucional y recibir la formación adecuada.