Estudio de la señal de insulina hipotalámica a la intolerancia de la glucosa periférica con un sistema de infusión continua de medicamentos en el cerebro de ratón

El objetivo general de este experimento es investigar el papel de la señalización hipotalámica de C-C-L-5 en la función de la insulina en el sistema periférico y el metabolismo de la glucosa mediante la manipulación de la señalización de C-C-L-5 mediante la administración del antagonista Met-C-C-L-5 a través de un sistema de administración ventricular intercerebral, la bomba microosmótica. Este medicamento puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de la fisiología bioquímica, como la quimiocina C-C-L-5 en el control del metabolismo de la glucosa en el cuerpo y la respuesta a la insulina en el cerebro. La principal ventaja de esta medida es que el experimentador puede manipular fácilmente ciertas señales en el cerebro durante un período de tiempo, como el C-C-L-5 aquí, sin efecto compensatorio ni desarrollar un trastorno, lo que suele suceder cuando hacemos manipulación genética en roedores.

La demostración visual de este procedimiento es importante, ya que la inserción de una bomba microosmótica y la medición precisa del nivel de insulina y glucosa en sangre requieren habilidad y precisión. Un día antes de la cirugía, prepare bombas microosmóticas cerebrales usando una jeringa de un mililitro y una aguja de punta roma para llenar las bombas con líquido cefalorraquídeo artificial, o A-C-S-F. Luego, sumerja la bomba en A-C-S-F y colóquela en una coctelera para agitarla suavemente durante la noche.

Al día siguiente, retire el A-C-S-F de la bomba y llénelo completamente con una solución de medicamento previamente preparada y diluida en A-C-S-F hasta que el exceso se escape. Luego, use unas tijeras quirúrgicas para cortar los tubos del catéter a la longitud deseada. Con una aguja de infusión cerebral de punta roma, conecte los tubos al kit de infusión cerebral.

A continuación, llene los tubos del kit de infusión con la solución del fármaco. Después de ensamblar el kit, conéctelo a la bomba microosmótica. Finalmente, para evitar que la bomba se seque, sumerja la configuración de infusión cerebral de la bomba osmótica en A-C-S-F dentro de un tubo esterilizado de 50 mililitros.

Para iniciar la cirugía, monte y fije la cabeza de un ratón anestesiado en un aparato estereotáctico. Con un par de tijeras quirúrgicas y pinzas, corte la piel exterior que cubre el cráneo. Luego, use yodo para limpiar el cráneo periférico.

A continuación, utilice un par de tijeras de punta roma cerca de la región del cuello para separar la capa más externa de la piel subcutánea para la implantación del equipo de fusión cerebral con bomba osmótica. Utilice el aparato estereotáctico para marcar el punto de infusión con referencia al mapa cerebral. Use un taladro de clavos para perforar un agujero alrededor del área marcada en el cráneo, teniendo cuidado de no romper las meninges y los vasos sanguíneos del ratón.

Luego, coloque el equipo de fusión cerebral con bomba microosmótica que contiene el medicamento de interés, o A-C-S-F como control, debajo de la piel detrás de la región del cuello. Para infundir el medicamento en el cerebro, inserte la aguja de infusión cerebral en el orificio perforado. Use un gel desensibilizante de superficie para fijar la aguja en su lugar en el cráneo y espere hasta que el pegamento se seque.

Corta la parte que sobresale en la parte superior de la aguja. Antes de comenzar la prueba de tolerancia a la glucosa, prepare la solución de glucosa disolviendo 3,75 gramos de glucosa y 15 mililitros de agua destilada. Establezca un horario con intervalos adecuados entre cada examen de sangre para registrar las lecturas durante el experimento.

A continuación, pese cada ratón después del ayuno para calcular la cantidad adecuada de glucosa para la inyección. Luego, en el banco de trabajo, prepare un temporizador, un chip de glucosa, un glucómetro, una jeringa de insulina y hojas de afeitar. Para medir el nivel de glucosa en sangre, primero inserte un nuevo chip de glucosa en el glucómetro y presione el botón de inicio para establecer el cero.

Luego, levanta al ratón por la parte posterior del cuello y acaricia su cola para asegurarte de que haya suficiente flujo sanguíneo. Usa una hoja de afeitar nueva para cortar un pequeño pedazo de la cola y luego exprime una gota de sangre en el chip de glucosa. Utilizando la técnica de lavado intragástrico, alimente al ratón con glucosa e inmediatamente inicie el temporizador.

Mide la glucosa en diferentes puntos temporales. Para comenzar la prueba de tolerancia a la insulina, prepare 0,25 unidades de solución de insulina humana. Luego, pesa cada ratón después del ayuno para calcular la cantidad adecuada de insulina para la inyección.

A continuación, establezca un horario para registrar las lecturas durante el experimento. Finalmente, después de la inyección de insulina, mida el nivel de glucosa en sangre como se hizo anteriormente. El metabolismo de la glucosa se midió mediante la prueba de tolerancia oral a la glucosa después de la cirugía, después de la administración oral de glucosa en ratones.

Los cambios en el nivel de glucosa en sangre en ratones infundidos con A-C-S-F, o infundidos con el antagonista C-C-L-5, se registran y muestran aquí. También se realizó la prueba de sensibilidad a la insulina y el nivel de glucosa en sangre en ratones infundidos con el antagonista C-C-L-5 solo se redujo ligeramente en comparación con los ratones de control, lo que sugiere deficiencias en la función de la insulina en el metabolismo periférico de la glucosa en ratones tratados con C-C-L-5. Para analizar la activación de la señal de insulina, se evaluó la proteína sustrato del receptor de insulina, o fosforilación I-R-S-1, en el hipotálamo.

En los ratones tratados con el antagonista C-C-L-5 cuando se alimentaron normalmente, la fosforilación de I-R-S-1 se reguló al alza en comparación con el grupo control. Para analizar más a fondo la activación de la señal de insulina, también se evaluaron los niveles de serina 4-7-3 Akt fosforilada y molécula de señalización de la insulina. Posteriormente, la señal de desafío a la insulina A-K-T aumentó en los ratones control tratados con A-C-S-F, pero no en los ratones tratados con antagonistas C-C-L-5.

Una vez que domine la inserción de la bomba micro-osmótica, tomará solo media hora si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que la cabeza del ratón esté ligeramente levantada y que la columna vertebral esté recta sobre el aparato estereotáctico. Esta técnica proporciona al investigador una forma en endocrinología de explorar el efecto de un fármaco, una quimiocina o la función de una proteína en el cerebro del roedor.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar medidas adicionales como la manipulación de la expresión génica con una administración intracerebral de un virus, o crisper 9 para responder preguntas adicionales como ¿cómo participan el C-C-L-5 y el receptor C-C-L-5 en los circuitos de digestión y metabolismo de los alimentos?