Name: Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a separar células de leucemia linfoblástica aguda en distintas fases del ciclo celular mediante elutriación centrífuga. Esta técnica permite estudiar los efectos de compuestos anticancerígenos de manera específica.

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Este trabajo fue financiado por NIH CA109821 (a la TCC). Agradecemos a Beckman-Coulter generosamente fondos para cubrir los costos de publicación y de asistencia técnica en la instalación y operación del sistema de elutriación. Agradecemos a Dr. Fred Falkenburg para proporcionar primaria inicial de todas las culturas.

Nota: este protocolo ha sido optimizado para primaria-todas las células que varían en diámetro de aproximadamente 8 μm (fase G1) a 13 μm (fases G2/M). Así, la centrífuga específicas velocidades y caudales de bomba pueden no ser aplicables a las células con diferentes tamaños. Sin embargo, su caso elutriación parámetros se pueden calcular utilizando la ecuación de tasa de sedimentación. Las células son cultivadas en un medio definido libre de suero como descrito 16 a una densidad óptima de 1-3 x 10 6 células/mL. Con la excepción de la colección de fracciones que se lleva a cabo a 4 ° C utilizando tubos enfriado con hielo, todos los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente y la centrífuga a 20 ° C con una máxima de 24 ° C.
 1. preparación del tampón de elutriación y materiales <ol><li>para reducir la aglutinación de las células, preparar una memoria intermedia de elutriación de Hank &#39; s balanceada (HBSS) una solución salina con rojo de fenol con 2% de suero bovino fetal ( FBS), para proteger las células contra estrés mecánico durante el proceso de elutriación y 1.6 g/L de sal dipotásico ácido 2-naftol-6,8-disulfónico (NDA), que representa el exterior de la célula con carga negativa y reduce la aglutinación.
	<ol><li>Añadir 1,6 g de NDA a un tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Bajo condiciones estériles, añadir 35 mL de HBSS de una botella de 1 L a tubo cónico de 50 mL que contiene el NDA. Agitar el tubo hasta que se disuelva el NDA.</li>
		<li>Usando un filtro de 0.2 μm, transferencia de la NDA disuelta en un nuevo tubo cónico estéril 50 mL. Luego añadir la NDA a la restante 1 L de HBSS.</li>
		<li>Por último, añadir a la HBSS para obtener una concentración final de 2% (v/v) 21 mL FBS. 
		Nota: El buffer de elutriación puede ser preparado y almacenado a 4 ° C hasta la fecha de caducidad en la HBSS, o hasta que haya un cambio importante en el pH como se indica por un amarillamiento del tinte indicador.</li>
	</ol></li> <li>Etiqueta 50 mL tubos cónicos para la recogida de fracciones que hay tubos etiquetados lavan 1 y 2 (W1 y W2), fracciones 1-20 (F1 - F20) y parada.
	<ol><li>Enfriado previamente estos tubos en hielo antes de recoger fracciones.</li>
	</ol></li></ol> 2. Montaje del sistema de elutriación <ol><li>en primer lugar, instale el conjunto de luz estroboscópica en la centrifugadora para que el cable de alimentación se alimenta de la cámara a través del puerto en el lado izquierdo. Asegúrese que la lámpara de flash estroboscópico en el frente de la cámara para que se alinee con la ventana de visualización cuando la centrífuga está cerrada.
	<ol><li>Fijar el conjunto en su lugar primero apretando dos tornillos de cabeza Phillips en los dos agujeros en la parte superior de cada soporte y luego a apretar los tornillos en la parte inferior de cada soporte.</li>
		<li>Enchufe el cable en el puerto de alimentación del strobe en la parte posterior de la centrifugadora.</li>
	</ol></li> <li>a continuación, ajustar el rotor hacia abajo sobre el eje de impulsión de centrífuga y asegure con una llave hexagonal de mango en T. 
	Nota: Si la centrifugadora no es necesario para los propósitos no-elutriación, la Asamblea del estroboscópico y el rotor pueden conservarse en la centrifugadora entre.</li>
	<li>Una vez que el rotor está asegurado, coloque el conjunto de desenganche rápido que contiene la cámara de elutriación, contrapeso, rotación de conjunto del cierre y una placa de montaje en el rotor.
	<ol><li>Empuje hacia abajo uniformemente con una mano en la cámara de elutriación y otra parte en el contrapeso hasta que los pernos en el rotor encajen en los orificios de la placa de montaje.</li>
		<li>Finalmente, fije el cable de acerrojado colocar el pasador en un extremo del cable en el agujero en el ensamblaje del sello rotatorio y lograr la mirilla en el otro lado del cable con uno de los tornillos de cabeza Phillips (mencionados en 2.1.1) sobre el soporte en el lado izquierdo o f la cámara de.</li>
	</ol></li> <li>a continuación, montar el sistema de flujo utilizando una bomba de velocidad variable y tubería a almacenador intermediario de la bomba en la elutriación cámara y recoger buffer que fluye fuera de la cámara de elutriación.
	<ol><li>Inserte el tubo de entrada de tamaño 16 procedente de la bomba de velocidad variable a través del puerto en la parte superior izquierdo de la cámara de la centrífuga que entra en la cámara de.</li>
		<li>Acople un accesorio en el extremo libre de la tubería de entrada e Inserte el accesorio en el agujero de entrada en el lado el ensamblaje del sello rotatorio.</li>
		<li>Insertar el tamaño 16 de salida de la tubería a través del puerto y fije el tubo de transferencia en la parte superior de la rotación del sello conjunto. 
		Nota: El sistema de flujo también puede permanecer montado entre elutriación.</li>
	</ol></li> <li>Por último, encienda la centrifugadora y establecer las especificaciones necesarias para el experimento.
	<ol><li>Cambio el rotor ID.</li>
		<li>Si la centrífuga requiere una entrada de tiempo, establecido por 2 h, que es más que suficiente para completar un elutriación ejecutar.</li>
		<li>Ajustar la temperatura a 20 ° C con una temperatura máxima de 24 ° C.</li>
		<li>Establecer la aceleración de la máximo y la desaceleración para lento.</li>
		<li>Por último, establecer la velocidad de 867 x g.</li>
	</ol></li></ol> 3. Cebado del sistema de elutriación <ol><li>para esterilizar el sistema de elutriación, coloque la tubería del embalse en una botella de plástico de 500 mL que contiene 5% de blanqueador y coloque la tubería de salida a una botella vacía 1 L plástico inútil.
	<ol><li>Encender la bomba y ajustar la velocidad a 25 mL/min y deje que el blanqueador de 5% a fluir a través del sistema de elutriación hasta que se bombea en el tubo de salida hacia la botella de residuos.</li>
		<li>Encender la centrifugadora y permita que venga al máximo señalado velocidad (867 x g) para lanzar las burbujas y la contrapresión.</li>
		<li>Parar la centrífuga. Una vez que el rotor haya dejado de girar, abrir la tapa e inspeccione la cámara en busca de fugas.</li>
		<li>Si no hay fugas, deje que la solución de lejía al flujo a través del sistema durante al menos 5 min</li>
	</ol></li> <li>a continuación, lave el sistema con agua esterilizada como blanqueador puede conducir a la formación de precipitados desde el búfer de elutriación que puede dar lugar a la aglutinación de las células, así como causar daño a las células.
	<ol><li>Lugar la tubería del embalse en una botella de 1 L de autoclave agua y permita que purgar durante al menos 10 min</li>
	</ol></li> <li>Después del lavado con agua, introducir el tampón de elutriación en el sistema. Utilizar un frasco de vidrio de 150 mL que ha sido esterilizado para crear una reserva para el búfer de elutriación y las células.
	<ol><li>Agregar 100 mL de tampón de elutriación a la botella y mover el tubo del depósito a la botella de vidrio para que el tubo está en el fondo muy.</li>
		<li>Inicie la centrifugadora y permitir que el tampón de flujo a través del sistema para eliminar el agua.</li>
		<li>Una vez que la botella de depósito está casi vacía y el agua se enjuaga completamente fuera del sistema, mueva el salida de la tubería de la botella de residuos al depósito para que el buffer es ser reciclado a través del sistema.</li>
	</ol></li> <li>Finalmente, ajuste la ventana de visualización para que la cámara de elutriación puede verse en la velocidad de la corriente.
	<ol><li>Prensa el estroboscópico lámpara de alimentación botón en la parte exterior de la centrifugadora para que la lámpara se enciende. Gire la elutriación kNob también en el exterior de la centrifugadora hasta la izquierda.</li>
		<li>Mientras mira por la ventana, lentamente gire la perilla a la derecha hasta que la cámara de elutriación entra en vista y la luz estroboscópica es en el tiempo con la rotación del rotor. 
		Nota: El sistema de elutriación puede dejarse en este estado hasta que las células están preparadas.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparación de la muestra de células células <ol><li>Conde y alícuota media de 300 a 400 millones en crecimiento en varios tubos cónicos de 50 mL. Desactivación de las células a 1210 x g durante 3 min</li>
	<li>Aspiración de crecimiento los medios de comunicación y resuspender las células en 25 mL de tampón de elutriación transfiriendo hacia arriba y hacia abajo suavemente.</li>
	<li>Para reducir la aglutinación de la célula, las células Pase dos veces por un 25 calibre aguja.
	<ol><li>Utilizando una jeringa de 10 mL elaborar las células y luego acople la aguja de calibre 25 y pasar las células a través de en el interior pared de un tubo cónico estéril 50 mL. Repetir este proceso hasta que hayan pasado los 25 mL a través de la aguja.</li>
		<li>Obtener una nueva aguja y jeringa y repetir el proceso por encima de una vez. 
		PRECAUCIÓN: Las agujas de la jeringa deben ser colocadas en envases de los sostenidos. 
		Nota: Es crítico que las células son empujadas a través de la aguja inmediatamente antes de la introducción al sistema de elutriación para mantener células agrupar a un mínimo.</li>
	</ol></li></ol> 5. Introducción de la muestra de células en el sistema de elutriación y colección de fracciones <ol><li>Introduzca la muestra de células en el sistema de elutriación vertiendo la muestra de células en el depósito que tiene el buffer restante de elutriación reciclaje a través de .
	<ol><li>Que las células entrar en el sistema y alcanzar el equilibrio dentro de la cámara de elutriación. 
		Nota: Este proceso tardará alrededor de 5 minutos y progreso puede ser rastreado por observación de las células al entrar en la cámara a través de la ventana de visualización. Para garantizar todas las células en la cámara, toma una gota de eluyente, coloque en un portaobjetos de vidrio y ve bajo el microscopio. Si la muestra está libre de las células intactas, esto confirma su retención en la cámara de.</li>
	</ol></li> <li>Comenzar a recoger fracciones de una vez todas las células han entrado en la sala y hay un límite distinto en la parte más ancha de la cámara en la que las células están en equilibrio.
	<ol><li>Comenzar moviendo el tubo de salida para el tubo cónico de 50 mL etiquetado como W1. Recoger 50 mL de tampón de elutriación de esta fracción, asegurándose de mantener un ojo en el tanque de depósito y llenar con tampón de elutriación cuando sea necesario. 
		Nota: Para asegurarse de que todas las células han entrado en el sistema, permita que el depósito a ser casi vacío antes de rellenar el depósito de la primera vez. Después de la primera recarga no será necesario esperar el depósito a ser casi vacío. Además, no siempre deje que el tanque se convierten en vacíos como esto creará burbujas y contrapresión en el sistema.</li>
		<li>Una vez que se han recogido 50 mL para W1, cambiar la velocidad a 821 x g y mover el tubo de salida para el tubo cónico etiquetado W2 y simultáneamente recoger más a esta velocidad 50 mL.</li>
		<li>Continuar cambiando la velocidad y la recolección de fracciones como se indica en la tabla 1. Asegúrese de que hay medios en el depósito del tanque y mantienen los tubos cónicos en el hielo en todo momento. Por último, ajustar la ventana girando la perilla a la derecha poco a poco a medida que disminuye la velocidad de.</li>
		<li>Una vez 20 fracciones todos han sido recogidos, parar la centrífuga y recoger 50 mL en el tubo cónico marcado STOP.</li>
	</ol></li></ol> 6. Flushing del sistema de elutriación <ol><li>después de la centrífuga ha detenido totalmente al ras del sistema colocando el tubo reservorio en la botella de 1 L de agua esterilizada y el tubo de salida nuevamente en la botella de residuos.
	<ol><li>Girar a la velocidad de la bomba a 50 mL/min y deje el agua correr por el sistema hasta que se gaste.</li>
	</ol></li> <li>Girar a la bomba, retire la manguera de entrada y salida de la liberación rápida y saque la clavija del cable de anclaje de.
	<ol><li>Retire el conjunto de desenganche rápido del rotor. 
		Nota: Dependiendo de lo que la centrífuga se usará para, el sistema de elutriación puede ahora dejarse como está. De lo contrario, todo el conjunto puede ser derribado en orden inverso como se describió anteriormente. La cámara de elutriación puede retirarse de la Asamblea de liberación rápida y limpia entre tramos mediante un baño de agua ultrasónico. Esto elimina desechos y contaminantes de la pared de la cámara que puede afectar negativamente corre más tarde.</li>
	</ol></li></ol> 7. Análisis de fracciones y colección del G1 o G2/M piscinas.
 Nota: para demostrar la eficacia de elutriación, cada fracción se analiza para el recuento de células, la célula diámetro y contenido de ADN, y piscinas son creadas de células en las fases G1 o G2/M para el análisis de immunoblot, como se describe en Representante de los resultados. Esta sección del protocolo describe cómo crear estas piscinas y prepararlos para su uso experimental.
<ol><li>Spin cada fracción a 2000 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirado de búfer de elutriación.</li>
	<li>Combinar fracciones para obtener una piscina de fase G1 y una piscina de fases G2/M.
	<ol><li>Para el G1 fase piscina, resuspender fracciones que fueron recogidas en el rango de velocidad de 788 g x 661 x g (F1 - F5) en un total de 1 mL de solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL. Para el grupo de fases G2/M, resuspender fracciones que fueron recogidas en el rango de velocidad de 387 x g y g x 333 (F17 - F20).</li>
		<li>Desactivación de células a 2000 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirado apagado PBS.</li>
	</ol></li> <li>Resuspender las células en 10 mL de medio de crecimiento y llevar un conteo de.</li>
	<li>Tomar una alícuota de cada grupo de análisis ADN contenido mediante tinción de yoduro de propidio y flow cytometric análisis 15. 
	Nota: El resto de cada piscina se puede utilizar para experimentos adicionales.</li>
</ol>

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</ol>

Anisha Kothari está actualmente en el Departamento de biología celular y Molecular de St. Jude Children Research Hospital.

Hemos descrito un método para la obtención primaria todas las células en diferentes fases del ciclo celular mediante camuflaje. Bajo condiciones óptimas una población esencialmente pura de células en fase G1 y una población altamente enriquecida de células en las fases G2/M podrían fácilmente obtener en rendimiento excelente, y las células altamente enriquecidas en fase S también pueden obtenerse si se desea. Los resultados aquí presentados se obtuvieron mediante una primaria de que toda cultura (específicamente, ALL-5) ...

Las células cultivadas crecen típicamente asincrónicamente y las células individuales están presentes en diferentes fases del ciclo celular. Algunos organismos presentan ciclos celulares naturalmente sincrónicos o pueden ser sincronizados por estímulos fisiológicos específicos. Por ejemplo, núcleos de plasmodia gigante del limo molde Physarum polycephalum se dividen en una manera altamente sincrónico1y las células de las algas verdes que desmodesmus quadricauda puede ser sincronizado por la alternancia de claros y oscuros periodos2. Mientras que estos organismos ofrecen atributos experimentales únicos, mal modelo las complejidades de las células de mamífero. La capacidad de sincronizar artificialmente las poblaciones de células de mamífero ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regulación del ciclo celular y la base molecular de los puntos de control de ciclo celular. Métodos comunes incluyen privación de suero, bloque química y liberación o explotar características físicas3,4. Retiro de suero a menudo hace que las células a entrar en quietud, y la nueva adición de suero promueve el reingreso del ciclo celular en G1 fase5. Inhibidores químicos incluyen a agentes como timidina exceso o hidroxiurea que bloquean las células en el límite de G1/S o inhibidores de los microtúbulos que suelen detención las células en la fase M3,4. Métodos que aprovechan las características físicas incluyen mitotic shake-off que se puede utilizar para enriquecer las células mitotic puesto que son menos adherentes que la interfase las células6. Sin embargo, todas estas técnicas tienen desventajas potenciales. Por ejemplo, no todos los tipos de la célula mantienen viabilidad en ausencia de suero o la presencia de inhibidores químicos y el rendimiento de las células después de mitotic shake es limitada sin sincronización previa con inhibidores de la mitosis.
A excepción de primeros ciclos celular embrionarios, donde células disminuyen progresivamente de tamaño como reparten7, mayoría avanzando a través del ciclo de las células se someten a fases de crecimiento y ser más grandes. Esta propiedad es aprovechada en la técnica de elutriación centrífuga contracorriente (CCE), que puede ser utilizado para separar las células difieren en tamaño y por lo tanto, en el ciclo celular fase8,9. Durante el CCE, las células están bajo la influencia de dos fuerzas opuestas: la fuerza centrífuga, que conduce las células lejos del eje de rotación y la velocidad del fluido (contraflujo), que impulsa las células hacia el eje de rotación (figura 1). Las células en la cámara de elutriación llegan a una posición de equilibrio donde estas fuerzas son iguales. Los factores clave que dictan la posición de equilibrio son densidad y diámetro de la célula. Como el flujo se aumenta la velocidad de la solución tampón y la fuerza de arrastre de contracorriente compensa la fuerza centrífuga, se establece un nuevo equilibrio, provocando un cambio en la posición de las células dentro de la cámara. Todas las células se desplazan hacia la salida de la cámara, dando lugar a los más pequeños, dejando la cámara en primer lugar, mientras que las células más grandes permanecer dentro de la cámara hasta que la tasa de contracorriente se incrementa lo suficiente para promover su salida. Las células de escape de la cámara de elutriación con aumentos consecutivos en la tasa de contracorriente pueden ser colectadas en fracciones específicas y cada fracción contiene células de crecientes secuencialmente los tamaños. En el lugar de realización de elutriación con aumentos incrementales en tasa de contracorriente, secuenciales disminuciones en la fuerza centrífuga al disminuir la velocidad de centrifugación logrará el mismo resultado. El proceso de elutriación requiere optimización dependiendo del tipo de la célula, elutriación buffer empleadas y el aparato específico utilizado. La tasa de sedimentación de las células en estas condiciones es mejor descrita por la ley de Stokes: SV = [d2(ρ - ρpm) / 18η] .ω2r, donde SV = velocidad de sedimentación; d = Diámetro de la partícula; Ρp = densidad de la partícula; Ρm = densidad de la memoria intermedia; Η = viscosidad del tampón; Ω = velocidad angular del rotor; y r = posición radial de la partícula. Así, SV es proporcional a la densidad y el diámetro de la célula, y puesto que el diámetro se eleva a la potencia segunda, que contribuye más significativamente que la densidad que es generalmente constante a través del ciclo celular.
Una ventaja importante del CCE es que las células no están sujetos a duras condiciones del tratamiento químico o privación nutricional y pueden ser recuperadas en el excelente rendimiento de esencialmente imperturbable. Un requisito es que las células en cuestión se someten a un aumento significativo en el diámetro, de al menos el 30%, ya que atraviesan el ciclo celular. La principal desventaja es el costo de la centrífuga especializada, rotor y accesorios. Sin embargo, la capacidad de preparar las células enriquecidas en las fases del ciclo celular específica por CCE ha facilitado enormemente investigación de ciclo celular en organismos de la levadura a las células mamíferas9,10. Por otra parte, los avances recientes están ampliando usos a la separación de las células de saludables versus tejido canceroso, la separación de diferentes tipos de células en mezclas heterogéneas y a la producción de tipos específicos de la célula para inmunoterapia9.
Nuestro mayor interés ha sido comprender el mecanismo de acción de los microtúbulos a agentes (MTA) como alcaloides de la vinca y taxanos. Estos fármacos fueron pensados para actuar exclusivamente en la mitosis, bloqueo del husillo microtubule función11,12, pero la evidencia reciente sugiere que también puedan dirigir interfase microtúbulos13,14. Nos informó recientemente que las células primarios leucemia linfoblástica aguda (toda) someterse a la muerte tanto en la fase G1 o en los M fase cuando fueron tratados con vincristina y otros MTAs en una manera dependiente del ciclo celular15. La capacidad para separar todas las células en diferentes fases de la célula por CCE fue fundamental para llegar a esta conclusión. En este artículo, describimos los detalles técnicos y ofrecen consejos prácticos para la aplicación de camuflaje para la preparación de primaria todas las células en diferentes fases de la célula.

<table><tbody><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>Frasco de 1 L</td></tr><tr><td>Suero bovino Fetal Plus</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>Frasco de 500 mL</td></tr><tr><td>Ácido 2-napthol-6,8-disulfónico sal dipotásica</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g polvo</td></tr><tr><td>50 mL tubos conciales</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/caja</td></tr><tr><td>Membrana PES 0.22 y micro; unidad de filtro m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/paquete</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI con Elut. No IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td> Centrífuga <td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>compatible con el sistema de elutriación</td></tr><tr><td>JE 5.0 Kit de rotor de elutriador Beckman</td><td>Coulter</td><td>356900</td><td>Kit de rotor que incluye el rotor, la llave hexagonal con mango en T, el conjunto de liberación rápida (sin la cámara de elutriación), el cable de anclaje y el conjunto estroboscópico</td></tr><tr><td>Cámara, estándar, 4 mL, "A"</td> <td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>cámara de elutriación estándar&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cabezal de bomba de carga fácil</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variador Cole-Parmer</td><td></td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm tubo de bomba de silicona curada con platino, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 Precision Glide aguja</td><td>BD</td><td>305127</td><td>estériles agujas de un solo uso</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok jeringa</td><td>BD 309604</td><td></td><td>estériles jeringas de un solo uso</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>tampón de tinción PI/RNasa</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>tampón de tinción de yoduro de propidio/RNasa</td></tr><tr><td>ciclina B1 (GNS1) anticuerpo IgG monoclonal de ratón</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>ciclina D1 (DCS-6) anticuerpo IgG monoclonal de ratón</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR anticuerpo monoclonal de conejo</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) anticuerpo monoclonal de conejo</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG (H+L)-HRP conjugado</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-conejo IgG (H+L)-HRP conjugado</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

La capacidad de sincronizar las células ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regulación del ciclo celular. Técnicas comunes empleadas incluyen privación de suero; productos químicos que detención de células en ciclo celular diferentes fases; o el uso de mitotic shake que explota su adherencia reducida. Sin embargo, todos estos tienen desventajas. Por ejemplo, hambre de suero funciona bien para las células normales pero menos bien por las células del tumor con puestos de control de ciclo celular comprometida debido a la pérdida de supresores activación o tumor oncogen. Del mismo modo, poblaciones de la célula tratada químicamente pueden daño inducido por la droga del puerto y muestran alteraciones relacionadas con el estrés. Una técnica que evita estos problemas es elutriación centrífuga contracorriente (CCE), donde las células son sometidas a dos fuerzas opuestas, la fuerza centrífuga y la velocidad del fluido, que se traduce en la separación de células en base a tamaño y densidad. Como agrandan las células avanzando a través del ciclo por lo general, la CCE puede utilizarse para separar las células en diferentes fases de la célula. Aquí aplicamos esta técnica a las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria. Bajo condiciones óptimas, pueden obtenerse una población esencialmente pura de células en fase G1 y una población altamente enriquecida de células en las fases G2/M en el excelente rendimiento. Estas poblaciones celulares son ideales para estudiar dependiente de ciclo celular mecanismos de acción de drogas contra el cáncer y para otras aplicaciones. También mostramos cómo modificaciones en el procedimiento estándar puede resultan en rendimiento subóptimo y discutir las limitaciones de la técnica. La metodología detallada presentada debe facilitar la aplicación y exploración de la técnica a otros tipos de células.

Primaria todas las celdas (3-4 x 108) fueron objeto de elutriación centrífugo y recogido en dos fracciones del lavado y veinte fracciones principales, como se describe en el protocolo. La tabla 1 muestra datos representativos donde se presenta el número total de células en cada fracción, así como la correspondiente velocidad de rotor. Total rendimiento era típicamente sobre 80%. Medición del diámetro de la célula en fracciones individuales confirmó que diámetro celular aumentad...

Este protocolo describe el uso de elutriación centrífuga para separar las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula.

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células en diferentes fases del ciclo celular mediante elutriación centrífuga. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapéutica del cáncer. Porque el aislamiento de las células en fases separadas, permite la interrogación de los efectos dependientes de la fase de los compuestos anticancerígenos.La principal ventaja de esta técnica es que permite la separación de las células en fases específicas utilizando propiedades físicas, en lugar de perturbaciones químicas. Para iniciar el experimento, instale el conjunto de luz estroboscópica en la centrífuga de modo que el cable de alimentación salga de la cámara a través del puerto de la izquierda. Ajuste la lámpara de flash estroboscópica para que se alinee con la ventana de visualización, cuando la centrífuga esté cerrada.Asegure el ensamblaje en su lugar, apretando dos tornillos de cabeza Phillips, en la parte superior de cada soporte. Y luego apretando los tornillos de mariposa en la parte inferior del soporte. Conecte el cable de alimentación al puerto de alimentación estroboscópica, ubicado en la parte posterior de la centrífuga.A continuación, coloque los rotores directamente en el cubo de accionamiento de la centrífuga y asegúrelo firmemente con una llave hexagonal con mango en T. Luego, coloque el conjunto que contiene la cámara de elutriación, el contrapeso, el conjunto de sello giratorio y una placa de montaje en el rotor. Empuje hacia abajo de manera uniforme, colocando una mano en la cámara de elutriación y la otra mano en el contrapeso, hasta que los pernos del rotor encajen en su lugar.Coloque el pasador, ubicado en un extremo del cable, en el orificio del conjunto de sello giratorio. Y asegure el orificio del ojo, en el otro extremo, con uno de los tornillos de cabeza Phillips, fijados al soporte para conectar el cable de anclaje. Para ensamblar el sistema de flujo, para bombear tampón dentro y fuera de la cámara de elutriación, conecte la tubería de tamaño 16 a una bomba de velocidad variable.Inserte un extremo libre de este tubo a través de un puerto en la parte superior izquierda de la cámara de centrífuga, de modo que ingrese a la cámara. Conecte un accesorio al extremo libre de este tubo y luego inserte el accesorio en el orificio de entrada del conjunto de sello giratorio. Por último, inserte el tubo de salida, a través de un puerto, para conectarlo al tubo de transferencia en la parte superior del conjunto de sello giratorio.Una vez ensamblado el sistema de elutriación, esterilícelo colocando el otro extremo libre del tubo de entrada en una botella de 500 mililitros, llena de lejía al 5%. Y colocando el tubo de salida en una botella de residuos vacía de un litro. A continuación, encienda la bomba y deje que la lejía fluya a través del sistema de elutriación, hasta que se bombee a la botella de desecho.Ahora, encienda la centrífuga y permita que alcance la velocidad máxima designada para liberar las burbujas y la contrapresión. Una vez alcanzada la velocidad establecida, detenga la centrífuga. Una vez que el rotor se haya detenido por completo, abra la tapa e inspeccione la cámara en busca de fugas.A continuación, de manera similar, como se describió anteriormente, deje correr agua estéril a través del sistema durante 10 minutos. Después de enjuagar con agua, reemplace el depósito de agua con una botella de vidrio estéril llena de 100 mililitros de tampón de elutriación. Coloque el tubo de entrada en esta botella, de modo que quede en el fondo.Encienda la centrífuga y permita que el tampón fluya a través del sistema. Después de que la botella del depósito esté casi vacía y el agua se haya eliminado por completo del sistema, mueva el tubo de salida de la botella de residuos al depósito para que el tampón se recicle continuamente a través del sistema. Finalmente, encienda la lámpara estroboscópica y gire la perilla de elutriación hacia el extremo izquierdo.Ahora, ajuste la ventana de visualización girando lentamente la perilla hacia la derecha, de modo que la cámara de elutriación se vea claramente y la luz estroboscópica esté sincronizada con la velocidad del rotor. Prepare la muestra de célula como se describe en el protocolo de texto. Añada las células resuspendidas en el frasco del depósito que contiene el tampón de elutriación de reciclaje.Permitir que las células entren en el sistema y alcancen el equilibrio dentro de la cámara de elutriación. Para asegurarse de que todas las células se retengan en la cámara, tome una gota del eluyente en un portaobjetos de vidrio y obsérvelo bajo un microscopio. Si la muestra está desprovista de células intactas, confirma la retención en la cámara.Una vez que todas las células han entrado en la cámara, y se ve un límite distinto en la parte más blanca de la cámara, que contiene las células y el equilibrio, comienza a recolectar fracciones. Mueva el tubo de salida a un tubo cónico preenfriado de 50 mililitros, etiquetado como W1. Recoja 50 mililitros de tampón de elutriación en este tubo y guárdelo en hielo. Poco después de recolectar la fracción W1, baje la velocidad de la centrífuga a 821 G. Y mueva el tubo de salida al tubo cónico, etiquetado como W2, y recoja 50 mililitros más a esta velocidad.Continúa cambiando la velocidad y recogiendo fracciones. Asegúrese de que haya medio en el tanque de reserva y almacene siempre las fracciones recolectadas en hielo. Después de que se hayan recolectado todas las fracciones, detenga la centrífuga y recoja 50 mililitros en un tubo cónico, etiquetado como tope.Células de pellets recolectadas en cada una de las fracciones, y utilizando análisis posteriores, como citometría de flujo o Western blot, según sea necesario. Se muestra un gráfico lineal que muestra el diámetro medio de las células en fracciones de elutriación sucesivas. Tenga en cuenta que cuanto mayor sea el diámetro de la celda, mayor será el número de fracción en el que eluye.Los resultados del análisis de clasificación de células activadas por fluorescentes muestran el contenido de ADN de las células en cada una de las 20 fracciones de elutriación. Las fracciones tempranas, F1 a F5, contienen casi exclusivamente células con un contenido de ADN 2N que representan células en fase G1. Una mezcla de células en las fases G1 y S, se observó en fracciones intermedias, F6 a F9. Y se observaron células con contenido de ADN 4N, que representan células en G2 a M, a partir de F10.Aquí se muestran los resultados de Western blot de sondear los niveles de proteínas relacionadas con el ciclo celular en fracciones agrupadas de células en la fase G1 y en la fase G2 a M. El grupo G2 a M tenía niveles más altos de fosfo-Rb y ciclina B, en comparación con el grupo G1, como se esperaba. La señal de la ciclina D uno era débil, pero no obstante era detectable en el grupo G1 e indetectable en el grupo G2 a M.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo y asegurarse de que el sistema de elutriación esté ensamblado correctamente y que todos los materiales y soluciones estén preparados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del ciclo celular, los ensayos de viabilidad celular y los inmunoblots, con el fin de interrogar cómo pueden actuar los compuestos terapéuticos de manera dependiente de la fase del ciclo celular.

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Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo (Video) | JoVE Journal

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

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