Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células en diferentes fases del ciclo celular mediante elutriación centrífuga. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapéutica del cáncer. Porque el aislamiento de las células en fases separadas, permite la interrogación de los efectos dependientes de la fase de los compuestos anticancerígenos.

La principal ventaja de esta técnica es que permite la separación de las células en fases específicas utilizando propiedades físicas, en lugar de perturbaciones químicas. Para iniciar el experimento, instale el conjunto de luz estroboscópica en la centrífuga de modo que el cable de alimentación salga de la cámara a través del puerto de la izquierda. Ajuste la lámpara de flash estroboscópica para que se alinee con la ventana de visualización, cuando la centrífuga esté cerrada.

Asegure el ensamblaje en su lugar, apretando dos tornillos de cabeza Phillips, en la parte superior de cada soporte. Y luego apretando los tornillos de mariposa en la parte inferior del soporte. Conecte el cable de alimentación al puerto de alimentación estroboscópica, ubicado en la parte posterior de la centrífuga.

A continuación, coloque los rotores directamente en el cubo de accionamiento de la centrífuga y asegúrelo firmemente con una llave hexagonal con mango en T. Luego, coloque el conjunto que contiene la cámara de elutriación, el contrapeso, el conjunto de sello giratorio y una placa de montaje en el rotor. Empuje hacia abajo de manera uniforme, colocando una mano en la cámara de elutriación y la otra mano en el contrapeso, hasta que los pernos del rotor encajen en su lugar.

Coloque el pasador, ubicado en un extremo del cable, en el orificio del conjunto de sello giratorio. Y asegure el orificio del ojo, en el otro extremo, con uno de los tornillos de cabeza Phillips, fijados al soporte para conectar el cable de anclaje. Para ensamblar el sistema de flujo, para bombear tampón dentro y fuera de la cámara de elutriación, conecte la tubería de tamaño 16 a una bomba de velocidad variable.

Inserte un extremo libre de este tubo a través de un puerto en la parte superior izquierda de la cámara de centrífuga, de modo que ingrese a la cámara. Conecte un accesorio al extremo libre de este tubo y luego inserte el accesorio en el orificio de entrada del conjunto de sello giratorio. Por último, inserte el tubo de salida, a través de un puerto, para conectarlo al tubo de transferencia en la parte superior del conjunto de sello giratorio.

Una vez ensamblado el sistema de elutriación, esterilícelo colocando el otro extremo libre del tubo de entrada en una botella de 500 mililitros, llena de lejía al 5%. Y colocando el tubo de salida en una botella de residuos vacía de un litro. A continuación, encienda la bomba y deje que la lejía fluya a través del sistema de elutriación, hasta que se bombee a la botella de desecho.

Ahora, encienda la centrífuga y permita que alcance la velocidad máxima designada para liberar las burbujas y la contrapresión. Una vez alcanzada la velocidad establecida, detenga la centrífuga. Una vez que el rotor se haya detenido por completo, abra la tapa e inspeccione la cámara en busca de fugas.

A continuación, de manera similar, como se describió anteriormente, deje correr agua estéril a través del sistema durante 10 minutos. Después de enjuagar con agua, reemplace el depósito de agua con una botella de vidrio estéril llena de 100 mililitros de tampón de elutriación. Coloque el tubo de entrada en esta botella, de modo que quede en el fondo.

Encienda la centrífuga y permita que el tampón fluya a través del sistema. Después de que la botella del depósito esté casi vacía y el agua se haya eliminado por completo del sistema, mueva el tubo de salida de la botella de residuos al depósito para que el tampón se recicle continuamente a través del sistema. Finalmente, encienda la lámpara estroboscópica y gire la perilla de elutriación hacia el extremo izquierdo.

Ahora, ajuste la ventana de visualización girando lentamente la perilla hacia la derecha, de modo que la cámara de elutriación se vea claramente y la luz estroboscópica esté sincronizada con la velocidad del rotor. Prepare la muestra de célula como se describe en el protocolo de texto. Añada las células resuspendidas en el frasco del depósito que contiene el tampón de elutriación de reciclaje.

Permitir que las células entren en el sistema y alcancen el equilibrio dentro de la cámara de elutriación. Para asegurarse de que todas las células se retengan en la cámara, tome una gota del eluyente en un portaobjetos de vidrio y obsérvelo bajo un microscopio. Si la muestra está desprovista de células intactas, confirma la retención en la cámara.

Una vez que todas las células han entrado en la cámara, y se ve un límite distinto en la parte más blanca de la cámara, que contiene las células y el equilibrio, comienza a recolectar fracciones. Mueva el tubo de salida a un tubo cónico preenfriado de 50 mililitros, etiquetado como W1. Recoja 50 mililitros de tampón de elutriación en este tubo y guárdelo en hielo. Poco después de recolectar la fracción W1, baje la velocidad de la centrífuga a 821 G. Y mueva el tubo de salida al tubo cónico, etiquetado como W2, y recoja 50 mililitros más a esta velocidad.

Continúa cambiando la velocidad y recogiendo fracciones. Asegúrese de que haya medio en el tanque de reserva y almacene siempre las fracciones recolectadas en hielo. Después de que se hayan recolectado todas las fracciones, detenga la centrífuga y recoja 50 mililitros en un tubo cónico, etiquetado como tope.

Células de pellets recolectadas en cada una de las fracciones, y utilizando análisis posteriores, como citometría de flujo o Western blot, según sea necesario. Se muestra un gráfico lineal que muestra el diámetro medio de las células en fracciones de elutriación sucesivas. Tenga en cuenta que cuanto mayor sea el diámetro de la celda, mayor será el número de fracción en el que eluye.

Los resultados del análisis de clasificación de células activadas por fluorescentes muestran el contenido de ADN de las células en cada una de las 20 fracciones de elutriación. Las fracciones tempranas, F1 a F5, contienen casi exclusivamente células con un contenido de ADN 2N que representan células en fase G1. Una mezcla de células en las fases G1 y S, se observó en fracciones intermedias, F6 a F9. Y se observaron células con contenido de ADN 4N, que representan células en G2 a M, a partir de F10.

Aquí se muestran los resultados de Western blot de sondear los niveles de proteínas relacionadas con el ciclo celular en fracciones agrupadas de células en la fase G1 y en la fase G2 a M. El grupo G2 a M tenía niveles más altos de fosfo-Rb y ciclina B, en comparación con el grupo G1, como se esperaba. La señal de la ciclina D uno era débil, pero no obstante era detectable en el grupo G1 e indetectable en el grupo G2 a M.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo y asegurarse de que el sistema de elutriación esté ensamblado correctamente y que todos los materiales y soluciones estén preparados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del ciclo celular, los ensayos de viabilidad celular y los inmunoblots, con el fin de interrogar cómo pueden actuar los compuestos terapéuticos de manera dependiente de la fase del ciclo celular.