Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

El objetivo general de este experimento es desarrollar un ensayo para estudiar el efecto de moléculas pequeñas en la modulación de la agregación de proteínas mal plegadas de una manera dependiente del tiempo y la dosis. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave para el desarrollo del ensayo celular, y su uso es para técnicas de cribado de alto contenido. La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un método sencillo para detectar y cuantificar la agregación de proteínas que se produce en varios trastornos neurodegenerativos.

La implicación de esta técnica se extiende hacia la potencial terapia de enfermedades neurodegenerativas, como la ELA, ya que propone un método sencillo que permite desarrollar ensayos celulares y realizar cribados de moderadores de moléculas pequeñas. Para iniciar la producción del virus, antes de la transfección de plásmidos, se dividieron las células T HEK-293 al 30 a 40% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros y 10 mililitros de medio de cultivo celular. Incube la placa de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, prepare la solución de transfección de ADN con plásmidos de empaque vector lentiviral, 125 microlitros de cloruro de calcio molar y agregue agua destilada para ajustar el volumen a 500 microlitros. Agregue suavemente 500 microlitros de tampón HEPS de 0,05 molares e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, reemplace el medio de células T HEK-293 con 10 mililitros de medio de cultivo fresco precalentado sin antibióticos mezclado con un mililitro de solución de transfección de ADN.

Incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche. Reemplace el sobrenadante celular con medio de cultivo fresco al día siguiente y vuelva a incubar durante la noche. Finalmente, al día siguiente se cosecha el sobrenadante y se transfiere a un tubo de 15 mililitros.

Para eliminar las células muertas y los residuos, centrifugar el tubo a 500 veces g durante cinco minutos. Para purificar aún más el supernatent, páselo a través de un filtro de 0,45 micrómetros con una jeringa de 60 mililitros. A continuación, dispense inmediatamente el sobrenadante filtrado en alícuotas de un solo uso de 300 microlitros.

Para preparar las células para la transducción, divídalas para infectarlas al 60% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos en dos mililitros de DMAM suplementado con 10% de FBS. Incubar las células en una incubadora a 37 grados centígrados al 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, descongele una alícuota del lentivirus congelado en hielo para cada uso.

Mientras tanto, calentar el medio de cultivo celular que contiene el suero compatible con la línea celular de interés. Una vez que el virus esté completamente descongelado, dilúyalo en DMEM en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, ajuste el volumen a un mililitro con medio sérico reducido.

A continuación, agregue dos microlitros de policeno a un mililitro de virus por medio y mezcle bien pipeteando. Añade un mililitro de esta mezcla a las células e incuba a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, retire el medio que contiene el virus y reemplácelo con DMEM normal suplementado con 10% de FBS y devuelva las células a la incubadora.

Controle el crecimiento celular y cambie el medio cada dos días Cuando las células alcancen la confluencia, expanda cada pocillo de la placa de seis pocillos en una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros. Mueva las placas a la incubadora. Por último, guarde 1,5 veces 10 a la 4ª celda por pocillo y 50 microlitros de DMEM en placas de ensayo de 384 pocillos.

A continuación, compruebe el nivel de expresión de la proteína marcada con YFP bajo el microscopio. Si la expresión muestra una relación señal-ruido igual o superior a tres, prepare el stock de celdas para la línea de celda correspondiente. Para la transferencia de compuestos, en una placa de polipropileno de almacenamiento de 384 pocillos, agregue diluciones en serie de compuestos por la serie estándar de una a tres diluciones.

A continuación, utilizando un manipulador de líquidos equipado con un cabezal capilar de 384, distribuya 0,25 microlitros de inhibidores del proteasoma en placas de ensayo negras de 384 pocillos vacías y de fondo plano. A continuación, siembra 1,5 veces 10 hasta la 4ª celda de estas placas. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.

Antes de obtener imágenes de la línea celular tratada con inhibidores del proteasoma, agregue 10 microlitros de DMEM precalentado con solución de tinción e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la tinción, inicie el software operativo del microscopio automatizado seleccionando la pestaña del microscopio. Primero, seleccione la pestaña de configuración y luego seleccione 20 veces el objetivo en el tipo de placa correcto.

Para permitir un enfoque adecuado con diferentes tipos de placas, asegúrese de que la persona que llama esté configurada con el valor correcto en el objetivo. A continuación, seleccione la exposición uno. Ajusta la altura de enfoque a cero micrómetros y, a continuación, selecciona el enfoque.

Una vez que esté enfocado, exponga la cámara uno. Para optimizar el plano de exposición, ajusta la altura de enfoque y haz clic en tomar altura. Cambie los tiempos de exposición y la potencia del láser para una intensidad máxima de píxeles de aproximadamente 3000 y guarde los parámetros de exposición.

Seleccione la pestaña Definición de experimento, cree un diseño y un subdiseño. A continuación, arrastre y suelte la exposición del diseño, la imagen de referencia, el archivo de recorte sesgado y el subdiseño relevantes. A continuación, guarde el experimento.

Finalmente, seleccione la pestaña de experimento automático y adquiera imágenes. En el caso de las imágenes de dos canales, seleccione primero el algoritmo de software para segmentar los objetos primarios, como los núcleos, el citosol y los agregados. En primer lugar, distribuya 0,25 microlitros de inhibidor del proteasoma disuelto en DMSO al 100% o DMSO en placas de fondo plano de 384 pocillos.

En la misma placa, siembre manualmente 1,5 veces 10 a la 4ª celda por pocillo en 50 microlitros de DMEM. Luego configure la unidad de control ambiental del sistema de microscopio a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Opere el microscopio en modo de fluorescencia de campo amplio y como configuración de software, elija LWD 20 veces el modo objetivo no confocal, cuatro campos por pocillo y un intervalo de captura de una hora.

A continuación, seleccione el algoritmo adecuado para segmentar el objeto principal, como el citosol y los agregados. Ajuste el umbral de fondo y los parámetros de contraste si es necesario. Las líneas celulares probadas transducidas con SOD-1 de tipo salvaje y SOD-1 A4V mutante permanecieron sanas, mostraron altos niveles de expresión y un amplio etiquetado phi a largo plazo, independientemente de la forma de SOD.

El tratamiento con el inhibidor del proteasoma ALLN durante 24 horas promovió la acumulación de agregados de YFP SOD-1 A4V en las células HEK-293, pero no en las células transducidas con SOD-1 Wild Type YFP. Además, hubo niveles muy bajos de agregación en las líneas celulares U2 OS y SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP transducidas con los mismos vectores. Después de sembrar las células en presencia o ausencia de ALLN, se monitorearon para la formación de agregados durante un período de 50 horas.

La formación de agregados de ALLN alcanzó una meseta a las 24 horas y se mantuvo estable durante las siguientes 12 horas. Además, la densidad celular disminuyó significativamente después de 28 horas como resultado del efecto citotóxico de ALLN, mientras que el número de células aumentó en el control negativo tratado con DMSO. Las células YFP SOD-1 A4V cultivadas en presencia de inhibidores del proteasoma durante 24 horas se tiñeron con solución de Hoechst.

La toxicidad relativa para tres inhibidores diferentes del proteasoma se cuantizó midiendo el número de líneas celulares adherentes que permanecían en el pocillo marcado con colorante de Hoechst. El número total de células disminuyó en respuesta al aumento de la dosis de inhibidores de la proteasa. A la inversa, el porcentaje de células que expresan agregados de SOD-1 A4V aumentó con la concentración de inhibidor de la proteasa.

Al realizar este proceso, es importante recordar que la calidad de la celda influirá drásticamente en su resultado. Por lo tanto, es importante determinar que las células están libres de microplasma y están sanas a lo largo de los pasos. Después de este proceso, se puede utilizar otro método de imagen para responder preguntas adicionales sobre la degradación de la proteína o la interacción de la proteína con otras utilizando la transferencia de energía de resonancia.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar las herramientas para probar el destino de la proteína en múltiples células vivas utilizando el análisis de imágenes de alto contenido. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la agregación de proteínas tal como ocurre en modelos celulares simples. También se puede aplicar a otros sistemas, como las neuronas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas específicas del paciente.