Sobreexpresión y Purificación de Humanos Cis -preniltransferasa en Escherichia coli

El objetivo general de este protocolo es sobreexpresar y purificar la cis-preniltransferasa humana optimizada para codones en condiciones no desnaturalizantes y analizar su actividad enzimática. El procedimiento se demuestra con la cis-preniltransferasa eucariota de cadena larga deshidrodolichil difosfato sintasa, o DHDDS. Este método puede avanzar en nuestra comprensión de la síntesis de isoprenoides y proporcionar información clave sobre el mecanismo fisiopatológico de la retinosis pigmentaria relacionada con las mutaciones en el DHDDS.

Las principales ventajas de esta técnica es que es sencilla, rentable y ahorra tiempo. También se puede generalizar para la producción en grandes cantidades de otras proteínas cis-preniltransferasas. Comience este procedimiento con la clonación de una expresión de DHDDS humana, como se describe en el protocolo de texto.

Vuelva a suspender las células en tampón A, un microgramo por mililitro de DNasa I y una mezcla de inhibidores de la proteasa. A continuación, homogeneice las células resuspendidas utilizando un homogeneizador de teflón de vidrio. Interrumpa las células con un microfluidizador o equivalente a 12.000 a 15.000 psi.

A continuación, centrifugar el lisado celular a 40.000 veces g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Recuperar el sobrenadante que contiene la fracción soluble. Cargue el sobrenadante en una columna de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada con cobalto de cinco a 10 milímetros con imidazol de 10 milimolares.

Después de cargar en una máquina de cromatografía líquida rápida de proteínas, realice un lavado a fondo de la columna con tampón A en imidazol de 10 milimolares para reducir la unión de proteínas inespecíficas. Comience el programa FPLC. Eluir las proteínas sobreexpresadas con tampón A suplementado con 250 milimolares de imidazol.

Después de la elución, elimine el imidazol utilizando 53 mililitros de una columna de desalinización preparativa equilibrada con tampón A. Luego, agregue la proteasa TEV marcada con hexahistidina a las proteínas eluidas para eliminar su fusión DHDDS de tiorredoxina marcada con hexahistidina. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, cargue las proteínas escindidas en una columna de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada con cobalto equilibrada con tampón A suplementado con imidazol de cinco milimolares.

Recoja el flujo para eliminar la tiorredoxina marcada con hexahistidina y la proteasa TEV. Concentre el flujo entre tres y cuatro mililitros utilizando un filtro centrífugo cortado de 30 kilodalton de peso molecular. A continuación, cargue la proteína concentrada en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Superdex 200 equilibrada con el tampón A para la purificación final.

Coloque las muestras en un estante de 96 pocillos en un colector de fracciones. La proteína eluye en forma de dímero. Seleccione las fracciones relevantes comparando el perfil de elución con una curva de calibración en columna.

En este punto, evalúe la pureza de la preparación utilizando SDS-PAGE. Por último, determine la concentración de proteínas necesaria para la experimentación posterior y congele rápidamente las alícuotas de proteínas concentradas purificadas en nitrógeno líquido. Guarde las alícuotas a menos 80 grados centígrados hasta su uso.

Para garantizar la capacidad de la proteína para soportar los ciclos de congelación y descongelación, descongele una alícuota de las proteínas congeladas. Centrifugar la alícuota a 21.000 veces g durante 10 minutos para eliminar los agregados insolubles. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante.

A continuación, cargue las proteínas en una columna analítica Superdex 200 preequilibrada con TNXB utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento. Monitorizar la fluorescencia del triptófano para detectar el perfil de elución de la proteína. Asegúrese de tener una curva de calibración válida para la evaluación del peso molecular, que está disponible a través de los fabricantes de columnas de la SEC.

Para asegurar la actividad de la proteína purificada, primero mezcle cinco micromolares de DHDDS purificado con 10 micromolares FPP y 50 micromolares C14 IPP. Iniciar la reacción en el tampón A con cloruro de magnesio 0,5 milimolares a 22 a 30 grados Celsius. Extraiga 15 muestras de microlitros de la reacción a las cero, dos, cuatro y seis horas después del enfriamiento inmediato de la reacción mediante la adición de 15 microlitros de tampón A suplementado con EDTA 20 milimolares.

A continuación, añade un mililitro de 1-butanol saturado de agua y vórtice bien para extraer los productos de la reacción. El protocolo se puede detener aquí y las muestras se pueden guardar para leerlas más tarde. A continuación, agregue el cóctel de centelleo a las muestras.

Utilizando un contador de centelleo, cuantifique los productos de reacción en la fase de butanol que abarca C14 junto con la radiactividad de 15 microlitros de la reacción, lo que representa la radiactividad total. Por último, calcule la incorporación neta de C14 IPP en cada punto de tiempo calculando el porcentaje utilizado de las concentraciones totales de C14 IPP y trace los resultados en función del tiempo. Se espera un aumento en la incorporación neta de C14 IPP con el tiempo.

Aquí se muestran las muestras obtenidas en cada etapa de purificación. Este análisis SDS-PAGE muestra la purificación escalonada de DHDDS, lo que da como resultado un producto altamente purificado. Este cromatograma representa los resultados de la cromatografía analítica de exclusión por tamaño de la enzima purificada, revelando que la proteína solo se observa como un homodímero.

Aquí, la flecha indica el volumen vacío. Un ensayo representativo de actividad dependiente del tiempo revela que la incorporación de C14 IPP aumenta claramente a lo largo de seis horas, lo que verifica que la enzima purificada es funcional. Una vez dominada, esta sencilla preparación se puede hacer en dos o tres días, lo que da como resultado una enzima altamente pura y activa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sobreexpresar y purificar la cis-preniltransferasa humana a partir de E. coli y medir su actividad de manera dependiente del tiempo.