Name: Sobreexpresión y Purificación de Humanos Cis -preniltransferasa en Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a sobreexpresar y purificar la cis-preniltransferasa humana en Escherichia coli bajo condiciones no desnaturalizantes. Este método sencillo permite evaluar la actividad enzimática y avanzar en el estudio de la síntesis de isoprenoides.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por el Centro para la Excelencia en Investigación de la Fundación Israelí de Ciencias (I-CORE) en Biología de las Células Estructurales (1775/12) y la Fundación Israel de Ciencia otorga 1721/16 y 2338/16 (YH), ​​y 825/14 (DK ). El apoyo de la Fundación Fields Estate a DK es muy apreciado. Este trabajo fue realizado por Ilan Edri y Michal Goldenberg en el cumplimiento parcial de los requisitos de la tesis MD de la Facultad de Sackler de Medicina, Universidad de Tel Aviv.

1. Clonación de cis- TP para sobreexpresión en E. coli <ol><li> Obtener el vector de expresión pET-32b, diseñado para la clonación y de alto nivel de expresión de las secuencias de proteínas fusionadas con la proteína 109aa tiorredoxina (TRX) 17, y E. coli con codones optimizados 18 secuencia de longitud completa -PT cis codificación. </li><li> Tener cuidado de tener un TEV-proteasa (tabaco proteasa del virus etch) sitio de escisión (ENLYFQ / G, donde &quot;/&quot; indica el punto de escisión) 9 seguido por un enlazador flexible corto (SGSGSG, para mejorar sitio de escisión de accesibilidad) aguas arriba de los cis -PT ( Figura 1 A ). También, añadir sitios de restricción 5 &#39;y 3&#39; adecuados para la clonación. </li><li> Clonar el constructo de ADN sintetizado en el vector pET-32b usando técnicas de ligadura estándar 10 . </li></ol> 2. SobreexpresarSsión de DHDDS humano en E. coli <ol><li> Transformar E. coli T7 expresa células competentes con la construcción TRD-DHDDS de fusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Plantar las células transformadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante sobre LB-agar bajo condiciones selectivas de ampicilina (200 mg / L). </li><li> Inocular las colonias seleccionadas en 100 ml de medio LB en frascos de 250 ml de cultivos iniciadores con 100 mg / l de ampicilina e incubar durante la noche a 37ºC con agitación constante a 200 rpm. </li><li> Inocular 80 ml del cultivo en dos matraces de 5 L (40 ml por frasco), conteniendo cada uno 1,5 L de medio YT 2x (triptona 16 g / l, extracto de levadura 10 g / l, NaCl 5 g / L) con 100 mg / L de ampicilina. </li><li> Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación constante a 180 rpm hasta alcanzar la DO 600 nm = 0,5. </li><li> Bajar la temperatura a 16 ° C e inducir las células mediante la adición de 0,5 mM isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). EstafaIncubar en las mismas condiciones durante 16-20 h para la expresión de proteínas. </li><li> Se cosechan las células por centrifugación (10.000 x g durante 10 min). Nota: El protocolo se puede pausar aquí; El gránulo de células debe mantenerse a -80ºC hasta la purificación. </li></ol> 3. Purificación de DHDDS humano <ol><li> Resuspender las células en tampón A (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,1%, β-mercaptoetanol 10 mM), ADNasa I 1 μg / ml y una mezcla de inhibidores de proteasa. </li><li> Homogeneizar las células utilizando un homogeneizador de vidrio-Teflón. </li><li> Interrumpir las células utilizando un microfluidizador o equivalente a 12.000 - 15.000 psi [ 11] . </li><li> Centrifugar el lisado celular a 40.000 xg durante 45 minutos a 4 ° C. Recuperar el sobrenadante, que contiene la fracción soluble. </li><li> Cargar el sobrenadante en una columna de 5 - 10 ml de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado con cobalto (Co2 + - IMAC) 12 con 10MM de imidazol, seguido de un lavado a fondo con tampón A y 10 mM de imidazol para reducir la unión de proteínas no específica. </li><li> Eluir las proteínas sobreexpresadas con tampón A suplementado con imidazol 250 mM. </li><li> Eliminar el imidazol usando una columna de desalinización preparativa de 53 ml equilibrada con tampón A. </li><li> Añadir proteasa TEV marcada con 6xHis (1 mg de proteasa TEV por 50 mg de proteína) a las proteínas eluidas para eliminar su proteína de fusión TRX marcada con 6xHis a 4ºC durante la noche. </li><li> Cargar las proteínas escindidas en una columna de Co2 + -IMAC, equilibrada con tampón A suplementado con imidazol 5 mM, para eliminar la proteína de fusión TRX 6x His marcada y la proteasa TEV. </li><li> Recoger el flujo a través de y concentrar a 3 - 4 ml utilizando un 30 kDa de peso molecular de corte del filtro centrífugo. </li><li> Cargar la proteína concentrada en una columna de cromatografía de exclusión de tamaños superdex-200 equilibrada con tampón A para purificación final. La proteína eluye como un dímero (~ 76 kDa). </Li <li> Seleccionar fracciones relevantes comparando el perfil de elución con una curva de calibración de la columna. </li><li> Evaluar la pureza de la preparación usando SDS-PAGE. </li><li> Determinar la concentración de proteína necesaria para la experimentación posterior y congelar por congelación alícuotas de proteínas purificadas y concentradas en nitrógeno líquido y almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 4. Cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC) <ol><li> Para asegurar la capacidad de la proteína de soportar ciclos de congelación-descongelación, descongelar una alícuota de las proteínas congeladas y centrifugar a 21.000 x g durante 10 minutos para eliminar los agregados insolubles. Recoger el sobrenadante. </li><li> Cargar las proteínas en una columna analítica superdex-200 previamente equilibrada con Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,02%, β-mercaptoetanol 10 mM, utilizando un sistema de cromatografía de líquidos de ultra rendimiento 13 , 14 . </li><li> Monitor triptophan fluoreScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) para detectar el perfil de elución eluente de las proteínas. Asegúrese de tener una curva de calibración válida para la evaluación del peso molecular - tales curvas están disponibles a través de los fabricantes de columnas SEC. </li></ol> 5. Cinética enzimática - Actividad 15 , 16 , 17 dependiente del tiempo <ol><li> Para asegurar la actividad de la proteína purificada, se mezcla 5 M de DHDDS purificadas con 10 FPP mu M y 50 M 14 C-IPP para iniciar la reacción en tampón A con 0,5 mM de MgCl 2 en 22 - 30 ° C. Nota: Las condiciones de reacción exactas pueden variar con las preparaciones de cis- TPs diferentes de DHDDS. Por otra parte, la actividad de DHDDS también depende de la temperatura y [Mg 2 + ]. Precaución: 14 C-IPP es radioactivo y debe utilizarse de acuerdo con las regulaciones locales de seguridad radiológica. </Li <li> Retirar muestras de 15 μL de la reacción a 0, 2, 4 y 6 h, después de la extinción inmediata de la reacción mediante la adición de 15 μl de tampón A suplementado con 20 mM de EDTA (hasta una concentración final de EDTA 10 mM). </li><li> Añadir 1 ml de H 2 O-1-butanol saturado y agitar a fondo para extraer los productos de reacción. Nota: El protocolo se puede detener aquí y las muestras se pueden guardar para su posterior lectura. </li><li> Añadir cóctel de centelleo a las muestras y, utilizando un contador de centelleo, cuantificar los productos de reacción en la fase de butanol que abarca 14 C, junto con la radiactividad de 15 μ l de la mezcla de reacción, que representa la radiactividad total. </li><li> Restar las lecturas de fondo medidas usando las muestras de 0 h de cada punto de tiempo y calcular el porcentaje de 14 C-IPP utilizado. </li><li> Calcular la incorporación neta de 14 C-IPP en cada punto de tiempo calculando el porcentaje utilizado del total 14 </Sup&gt; C-IPP, y trazar los resultados en función del tiempo. Se espera un aumento en la incorporación neta de 14 C-IPP con el tiempo. </li></ol>

<ol><li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Prenyltransferase%3A+New+Insights+into+Protein+Glycosylation%2C+Rubber+Synthesis%2C+and+Human+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4615-5901-6_3">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li>
<li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li>
<li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li>
<li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li>
<li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+DHDDS%2C+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase%2C+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li>
<li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li>
<li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/073497509502007P">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized-metal+affinity+chromatography+%28IMAC%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module%3A+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li>
<li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+3%3A1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457(2011).</li>
<li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li>
<li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate%2C+magnesium%2C+and+triton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li>
<li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium%2C+isopentenyl+pyrophosphate%2C+and+farnesyl+thiopyrophosphate%3A+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li>
<li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+the+future+of+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).</li>
<li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+human+glycosylation+disorders%3A+biochemistry+leads+the+charge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems%3A+current+industrial+applications+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21(2014).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí para la purificación de DHDDS humano funcional en células de E. coli es simple y eficiente, permitiendo una sobreexpresión y purificación de la proteína en 3 - 4 días una vez que se dispone de una construcción adecuada. Tales protocolos para la purificación de proteínas son de especial importancia dado los avances en la secuenciación del genoma, que proporcionó gran cantidad de información sobre la genética de muchas enfermedades [ 18] , lo que requiere el desa...

Las preniltransferasas son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación 1 , 2 . Enzimas de tipo Z catalizan la formación de dobles enlaces cis de la reacción de condensación, mientras que las enzimas de tipo E catalizan la formación de trans doble enlace 3. Las cis- priltransferasas (enzimas cis -PT, tipo Z) se clasifican clásicamente de acuerdo con la longitud de su cadena de productos en cadenas cortas (C 15 ), de cadena media (C 50-55 ) y de cadena larga (C 70-120 ) 4 . El DHDDS (deshidrodolichil difosfato sintasa) es un cis- PT de cadena larga eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, un difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP) 1, 5 , 6 . Esto da como resultado la formación de difosfato de deshidrodolicilo, difosfato de polifenilo C 55-100 que sirve como precursor para dolicilpirofosfato, la molécula portadora de glicosilo implicada en la glicosilación de proteínas ligadas al N 1 . Entre los judíos asquenazíes, una mutación no conservadora de sentido erróneo (K42E) en DHDDS da lugar a la retinitis pigmentosa autosómica recesiva 7 , 8 . Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir DHDDS purificado adecuado para estudios mecánicos. Escherichia coli se considera el huésped más conveniente y rentable para la expresión de la proteína recombinante, y por lo tanto es también el huésped más frecuentemente utilizado. Sin embargo, cuando se intenta heterólogamente sobreexpresar proteínas en E. coli , se deben tomar consideraciones específicas de proteínas. Obtener correctamente doblado, activE las proteínas recombinantes de E. coli , no es una cuestión sencilla debido a las distintas propiedades de diferentes proteínas. Se han desarrollado numerosos enfoques para superar estos obstáculos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en E. coli . De nota, un intento previo de sobreexpresar levadura cis- TP sin fusión de proteínas no fue exitosa debido a la insolubilidad completa, incluso en presencia de detergente [ 12] . El protocolo descrito es simple, rentable, ahorrador de tiempo y permite obtener preparados de DHDDS adecuados para estudios mecánicos. Dada la homología de cis -PT entre diferentes especies, sugerimos que este protocolo se puede aplicar para otros eucarióticos cis- TP también.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express&nbsp; lysY&nbsp; Competente&nbsp; E. coli&nbsp; (Alta eficiencia)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Resina de superflujo TALON</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 columna de desalinización&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 aumento 5/150 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-Isopentenyl pirofosfato</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>trans,trans-Farnesil pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

sobreexpresión y purificación de humanos cis -preniltransferasa en escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Las preniltransferasas (PT) son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación. El DHDDS (deshidrodolicil difosfato sintasa) es un cis- PT (que forma enlaces dobles cis de la reacción de condensación) eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS es de importancia biomédica, como una mutación no conservadora (K42E) en la enzima resulta en la retinitis pigmentosa , en última instancia, conduce a la ceguera. Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir grandes cantidades de DHDDS purificado, adecuado para estudios mecánicos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en <eM&gt; E. Coli El protocolo descrito es simple, rentable y ahorrador de tiempo. La homología de cis -PT entre diferentes especies sugiere que este protocolo se puede aplicar para otros eucariotas cis- TP, así como los que participan en la síntesis de caucho natural.

En la Figura 1 se muestra la descripción general del constructo utilizado y el proceso de purificación. Las muestras obtenidas en cada etapa de purificación se muestran en la Figura 2 . Este análisis de SDS-PAGE muestra la purificación por etapas de DHDDS, dando como resultado un producto altamente purificado. La Figura 3 muestra los resultados de la SEC analítica de la enzima purificada, revelando ...

Un protocolo simple para la sobreexpresión y purificación de la cis- preniltransferasa humana optimizada con codones, en condiciones no desnaturalizantes, de Escherichia Coli , junto con un ensayo de actividad enzimática. Este protocolo puede generalizarse para la producción de otras proteínas de cis- preniltransferasa en cantidad y calidad adecuadas para estudios mecánicos.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos Cis -preniltransferasa en Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

El objetivo general de este protocolo es sobreexpresar y purificar la cis-preniltransferasa humana optimizada para codones en condiciones no desnaturalizantes y analizar su actividad enzimática. El procedimiento se demuestra con la cis-preniltransferasa eucariota de cadena larga deshidrodolichil difosfato sintasa, o DHDDS. Este método puede avanzar en nuestra comprensión de la síntesis de isoprenoides y proporcionar información clave sobre el mecanismo fisiopatológico de la retinosis pigmentaria relacionada con las mutaciones en el DHDDS.Las principales ventajas de esta técnica es que es sencilla, rentable y ahorra tiempo. También se puede generalizar para la producción en grandes cantidades de otras proteínas cis-preniltransferasas. Comience este procedimiento con la clonación de una expresión de DHDDS humana, como se describe en el protocolo de texto.Vuelva a suspender las células en tampón A, un microgramo por mililitro de DNasa I y una mezcla de inhibidores de la proteasa. A continuación, homogeneice las células resuspendidas utilizando un homogeneizador de teflón de vidrio. Interrumpa las células con un microfluidizador o equivalente a 12.000 a 15.000 psi.A continuación, centrifugar el lisado celular a 40.000 veces g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Recuperar el sobrenadante que contiene la fracción soluble. Cargue el sobrenadante en una columna de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada con cobalto de cinco a 10 milímetros con imidazol de 10 milimolares.Después de cargar en una máquina de cromatografía líquida rápida de proteínas, realice un lavado a fondo de la columna con tampón A en imidazol de 10 milimolares para reducir la unión de proteínas inespecíficas. Comience el programa FPLC. Eluir las proteínas sobreexpresadas con tampón A suplementado con 250 milimolares de imidazol.Después de la elución, elimine el imidazol utilizando 53 mililitros de una columna de desalinización preparativa equilibrada con tampón A. Luego, agregue la proteasa TEV marcada con hexahistidina a las proteínas eluidas para eliminar su fusión DHDDS de tiorredoxina marcada con hexahistidina. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, cargue las proteínas escindidas en una columna de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada con cobalto equilibrada con tampón A suplementado con imidazol de cinco milimolares.Recoja el flujo para eliminar la tiorredoxina marcada con hexahistidina y la proteasa TEV. Concentre el flujo entre tres y cuatro mililitros utilizando un filtro centrífugo cortado de 30 kilodalton de peso molecular. A continuación, cargue la proteína concentrada en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Superdex 200 equilibrada con el tampón A para la purificación final.Coloque las muestras en un estante de 96 pocillos en un colector de fracciones. La proteína eluye en forma de dímero. Seleccione las fracciones relevantes comparando el perfil de elución con una curva de calibración en columna.En este punto, evalúe la pureza de la preparación utilizando SDS-PAGE. Por último, determine la concentración de proteínas necesaria para la experimentación posterior y congele rápidamente las alícuotas de proteínas concentradas purificadas en nitrógeno líquido. Guarde las alícuotas a menos 80 grados centígrados hasta su uso.Para garantizar la capacidad de la proteína para soportar los ciclos de congelación y descongelación, descongele una alícuota de las proteínas congeladas. Centrifugar la alícuota a 21.000 veces g durante 10 minutos para eliminar los agregados insolubles. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante.A continuación, cargue las proteínas en una columna analítica Superdex 200 preequilibrada con TNXB utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento. Monitorizar la fluorescencia del triptófano para detectar el perfil de elución de la proteína. Asegúrese de tener una curva de calibración válida para la evaluación del peso molecular, que está disponible a través de los fabricantes de columnas de la SEC.Para asegurar la actividad de la proteína purificada, primero mezcle cinco micromolares de DHDDS purificado con 10 micromolares FPP y 50 micromolares C14 IPP. Iniciar la reacción en el tampón A con cloruro de magnesio 0,5 milimolares a 22 a 30 grados Celsius. Extraiga 15 muestras de microlitros de la reacción a las cero, dos, cuatro y seis horas después del enfriamiento inmediato de la reacción mediante la adición de 15 microlitros de tampón A suplementado con EDTA 20 milimolares.A continuación, añade un mililitro de 1-butanol saturado de agua y vórtice bien para extraer los productos de la reacción. El protocolo se puede detener aquí y las muestras se pueden guardar para leerlas más tarde. A continuación, agregue el cóctel de centelleo a las muestras.Utilizando un contador de centelleo, cuantifique los productos de reacción en la fase de butanol que abarca C14 junto con la radiactividad de 15 microlitros de la reacción, lo que representa la radiactividad total. Por último, calcule la incorporación neta de C14 IPP en cada punto de tiempo calculando el porcentaje utilizado de las concentraciones totales de C14 IPP y trace los resultados en función del tiempo. Se espera un aumento en la incorporación neta de C14 IPP con el tiempo.Aquí se muestran las muestras obtenidas en cada etapa de purificación. Este análisis SDS-PAGE muestra la purificación escalonada de DHDDS, lo que da como resultado un producto altamente purificado. Este cromatograma representa los resultados de la cromatografía analítica de exclusión por tamaño de la enzima purificada, revelando que la proteína solo se observa como un homodímero.Aquí, la flecha indica el volumen vacío. Un ensayo representativo de actividad dependiente del tiempo revela que la incorporación de C14 IPP aumenta claramente a lo largo de seis horas, lo que verifica que la enzima purificada es funcional. Una vez dominada, esta sencilla preparación se puede hacer en dos o tres días, lo que da como resultado una enzima altamente pura y activa.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sobreexpresar y purificar la cis-preniltransferasa humana a partir de E. coli y medir su actividad de manera dependiente del tiempo.

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Se presenta un método simplificado para la detección de la expresión de proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli basada en la fusión a la proteína verde fluorescente.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

La coexpresión de proteínas es una poderosa alternativa a la reconstitución in vitro de complejos proteicos, y es de ayuda en la realización de pruebas bioquímicas y genéticas in vivo. En este trabajo se informa sobre el uso de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli para obtener complejos proteicos y ajustar la frecuencia de mutación de las células.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Este es un protocolo rápido y rentable para la producción de proteínas de mamíferos secretadas y glicosiladas y su posterior purificación en un solo paso con rendimientos suficientes de proteína homogénea para la cristalografía de rayos X y otros estudios biofísicos.

Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Biología sintética permite la ingeniería de proteínas con propiedades sin precedentes mediante la inserción co-translational de aminoácidos no-canónico. Aquí, se presenta como una variante espectralmente rojo-cambiado de puesto de un fluoróforo tipo GFP con propiedades espectroscópicas fluorescencia novela, llamado proteína fluorescente de "oro" (GdFP), se produce en e. coli mediante incorporación de presión selectiva (SPI).

Ingeniería 'Oro' de la fluorescencia por presión selectiva incorporación de aminoácidos no canónica y análisis de proteínas por espectrometría de masas y la fluorescencia

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Describimos un método para la caracterización de transportadores de membrana impulsados por protones en preparaciones de vesículas de membrana producidas por la expresión heteróloga en E. coli y lisis de células utilizando una prensa francesa.

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Este artículo describe una metodología para sobreexpresar Nsp15 recombinante, una nucleasa tóxica, en un sistema de expresión C41 (DE3), seguida de la purificación de la proteína marcada utilizando cromatografía de afinidad y exclusión de tamaño. Estos protocolos se pueden adaptar para otras proteínas tóxicas desafiantes.

Sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de Escherichia coli

Aprende a sobreexpresar y purificar la cis-preniltransferasa humana en Escherichia coli bajo condiciones no desnaturalizantes. Este método sencillo permite evaluar la actividad enzimática y avanzar en el estudio de la síntesis de isoprenoides.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos Cis -preniltransferasa en Escherichia coli

Explorar más videos