Name: Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprende a identificar genes de virulencia en Leptospira interrogans mediante secuenciación masiva de transposones en modelo de hámster. Este método permite evaluar el fitness de mutantes in vivo con uso mínimo de animales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por un premio de mérito de asuntos de veteranos (para D.A.H.) y un Instituto Nacional de salud concede R01 AI 034431 (a D.A.H.).

<ol><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li>
<li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+leptospirosis%3A+the+influence+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li>
<li>Marcsisin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+high-throughput+screen+to+identify+Leptospira+mutants+unable+to+colonize+the+carrier+host+or+cause+disease+in+the+acute+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection.</a> J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn-seq%2C+a+high-throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+barriers+to+Borrelia+burgdorferi+dissemination+during+infection+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing.</a> Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).</li>
<li>Wunder, E. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li>
<li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li>
<li>Coutinho, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Leptospira+interrogans+infection+in+hamsters+after+intradermal+and+subcutaneous+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307(2014).</li>
<li>Athanazio, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rattus+norvegicus+as+a+model+for+persistent+renal+colonization+by+pathogenic+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.</a> Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).</li>
<li>Ratet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+bioluminescent+Leptospira+interrogans+in+mice+reveals+renal+colonization+as+a+stealth+escape+from+the+blood+defenses+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359(2014).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+virulence+factors+required+for+respiratory+melioidosis+using+Tn-seq+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods Mol Biol. 859, (2012).</li>
<li>Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+between+Escherichia+coli+and+Leptospira+spp.+as+a+new+genetic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).</li>
<li>Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+parallel+sequencing+to+measure+fitness+of+Leptospira+interrogans+transposon+insertion+mutants+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117(2016).</li>
<li>Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+of+Leptospirapomona+and+growth+of+13+other+serotypes%3A+Fractionation+of+oleic+albumin+complex+and+a+medium+of+bovine+albumin+and+polysorbate+80%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80.</a> Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).</li>
<li>Johnson, R. C., Harris, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pathogenic+and+saprophytic+letospires.+I.+Growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li>
<li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+%28IncW%29+and+RP4+plasmid+%28IncPa%29+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li>
<li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScope%3A+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Database+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021(2009).</li>
<li>Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+microbial+fitness+determinants+by+insertion+sequencing+using+genome-wide+transposon+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries.</a> Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).</li>
<li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+J+%22Spirochetes+in+body+fluids+and+tissues+manual+of+investigative+methods%22">Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods</a>. , 22-23 (1971).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3 (7), (2007).</li>
<li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%3A+disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. 12, 2(2006).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), R86(2010).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+web-based+genome+analysis+tool+for+experimentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists.</a> Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).</li>
<li>McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGenTA%3B+a+Galaxy+implemented+tool+for+complete+Tn-Seq+analysis+and+data+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization.</a> Bioinformatics. , 1367(2017).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fitness+landscapes+of+Vibrio+cholerae+at+important+stages+of+its+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003800(2013).</li>
<li>Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+markers+for+genetic+manipulations+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Pappas, C. J., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+in+Leptospira+spp.+by+Transcription+activator-like+effectors+demonstrates+a+potential+role+for+LigA+and+LigB+in+Leptospira+interrogans+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).</li>
<li>Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+gene+loss+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Selection-driven gene loss in bacteria.</a> PLoS Genet. 8 (6), e1002787(2012).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tn-seq+analysis+of+carbohydrate+utilization+and+vertebrate+infectivity+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).</li>
<li>Ramsey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+genetic+screen+identifies+previously+uncharacterized+Borrelia+burgdorferi+genes+important+for+resistance+against+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species.</a> PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque se presentan los resultados de nuestro experimento piloto para hámster desafiado por vía intraperitoneal con mutantes de L. interrogans 4217, esperamos que piscinas más grandes de mutantes pueden ser defendidos por Tn-SS. Porque la frecuencia de transconjugants es baja (100-200 transconjugants/apareamiento), varios apareamientos son necesarias para generar un número suficiente de mutantes para los grandes experimentos de Tn-Seq. Mantener un gran número de mutantes en cultivos líqui...

Identificación de genes de virulencia de algunas bacterias como Leptospira spp., es difícil debido al número limitado de herramientas genéticas disponibles. Un método comúnmente utilizado es la creación de una colección de mutantes por mutagénesis de transposon al azar seguido de la identificación del sitio de inserción en cada mutante y virulencia pruebas de mutantes de transposon individual en un modelo animal. Este enfoque es lento, costoso y requiere un gran número de animales.
Cuando mutagénesis al azar primero fue desarrollada para el patógeno Leptospira interrogans, genes implicados en virulencia fueron identificados por pruebas individuales mutantes en un modelo animal1. Mutantes se seleccionaron con base en criterios tales como su papel potencial en la señalización o motilidad o su membrana externa prevista o ubicación superficial. Como la mayoría de leptoespiral genes codifican proteínas hipotéticas de función desconocida2, selección de mutantes basan en estos límites de criterio la capacidad para descubrir genes de virulencia leptoespiral novela.
Más recientemente, revisaron las piscinas de mutantes de L. interrogans transposon de infectividad en los modelos de ratón y hámster3. Cada animal fue desafiada con una piscina de hasta 10 mutantes. Infectividad de un mutante lo marcó como positivo si fue detectado por PCR de cultivos obtenidos de sangre y los riñones. Pruebas de PCR fue laborioso, porque requiere una reacción de PCR individual para cada mutante en la piscina. Porque no se cuantificó la frecuencia de cada mutante en las culturas, el enfoque fue parcial hacia la identificación de mutantes altamente atenuadas.
Describimos un transposon secuencia técnica (Tn-Seq), como una estrategia para más eficientemente detectar genes de virulencia. TN-seq consiste en la creación de una biblioteca de mutantes por mutagénesis de transposon seguida de secuenciación masiva en paralelo4,5,6. Brevemente, mutantes de transposon se agruparon inoculados en animales y más tarde recuperados de diferentes órganos (piscinas de salida). El ADN de las piscinas de salida es extraído y digerido con enzimas de restricción o esquilado por sonicación. Se realizan dos rondas de PCR a las uniones de los sitios de inserción de transposones. Este paso permite la adición de los adaptadores necesarios para la secuenciación. Los productos PCR obtenidos son analizados por secuenciación de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón de cada mutante de la piscina junto con su abundancia relativa, que es comparado con la composición inicial de la piscina del mutante.
La principal ventaja de este enfoque es la capacidad de la pantalla al mismo tiempo un gran número de mutantes con un pequeño número de animales. TN-Seq no requiere el conocimiento previo de los sitios de inserción de transposones que aumenta las posibilidades de descubrir nuevas Leptospira-genes específicos implicados en virulencia con menos tiempo y mayor eficiencia. Porque carga leptoespiral en tejidos es relativamente alta en roedores modelos susceptibles a la letal infección (normalmente 104 108 bacterias/g de tejido)7,8,9 , así como anfitriones del depósito 10,11, los tejidos pueden ser analizados directamente sin necesidad de cultivo, reduciendo sesgos debido al crecimiento en vitro .
En los estudios de Tn-Seq con mayoría patógenos bacterianos descritos hasta la fecha, la alta frecuencia de mutagénesis de insertional permite la infección con grandes piscinas que contengan a mutantes colectivamente con inserciones de transposones espaciamiento múltiples dentro de cada gen4 ,12,13,14. TN-Seq también ha sido desarrollado para una bacteria para que la frecuencia de mutagénesis es mucho inferior6. Con Leptospira, una biblioteca de mutantes de transposon puede generarse introduciendo el transposon en un plásmido movilizable por la conjugación de Slamti et al15. Sin embargo, la frecuencia de mutagénesis de transposon de L. interrogans es baja. Cuando el transposon Himar1 fue introducido en un plásmido conjugativos, la frecuencia de transconjugant se informó que solamente 8.5 x 10-8 por receptor de la célula con la cepa Lai de L. interrogans16 y es probable que del mismo modo pobre con más otras cepas de L. interrogans. El protocolo descrito aquí está en parte basado en que se convirtió para Borrelia burgdorferi, en el que la frecuencia de mutagénesis de insertional transposón es también baja6.
Para nuestro experimento piloto con el protocolo17, se realizó mutagénesis de transposon con L. interrogans serovar cepa Manilae L495 debido al éxito de otros grupos en el aislamiento de mutantes de inserción de transposones en la cepa junto con su bajo LD50 (dosis letal) de virulencia1. Se había defendido a 42 mutantes por Tn-Seq y se identificaron a varios candidatos mutantes defectuosos en virulencia, dos de ellos con inserciones en un gen de la adenilato ciclasa de candidato. Prueba individual de los dos mutantes en hámsteres confirmó que eran deficientes en virulencia17.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de kanamicina de Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2,6-diaminopimélico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Espectinomicina diclorhidrato pentahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axio Lab A1 con un condensador de campo oscuro</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy kit de sangre y tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purificación</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick kit de purificación PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 505 Desmembrador sónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2.5" Bocina de copa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Paso 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Desoxinucleotidil transferasa terminal</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Preparación de bibliotecas genómicas, paso 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identificación del lugar de inserción del transposón, paso 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProductos</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>fluorómetro Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>paso 3.6.</td></tr><tr><td>Kit de ensayo Qubit dsDNA HS</td><td>: Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td>, <td>paso 3.6.</td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit life</td><td>technologies</td><td>Q32856</td><td>paso 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Plástico K2 EDTA 2 ml tubos</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>jeringa U-100 con 26G x & frac12; &rdquo; aguja</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>desafío IP, paso 2.2.1.</td></tr><tr><td>Jeringa de punta Luer-Lok de 3 mL BD</td><td>vacutainer</td><td>309657</td><td>Punción cardíaca, paso 2.4.2.</td></tr><tr><td>Aguja de 25G X 5/8"</td><td>BD vacutainer</td><td>305901</td><td>Punción cardíaca, paso 2.4.2.</td></tr><tr><td>Base de vidrio fritado de 25 mm con tapón</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.</td></tr><tr><td>Abrazadera de resorte de aluminio de 25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.</td></tr><tr><td>Embudo de vidrio de borosilcate de 15 ml EMD</td><td>Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.</td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer de brazo lateral de 125 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.</td></tr><tr><td>Filtro de acetato-celulosa VVPP (tamaño de poro 0,1 mm; diámetro 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de leptospira interrogans transposon inserción mutantes durante oro sirios hamster infección

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

En este manuscrito, describimos un transposón (Tn-Seq) técnica para identificar y cuantificar a Leptospira interrogans mutantes alterados en gimnasio durante la infección de hámsters sirios dorados de secuenciación. TN-Seq combina mutagénesis de transposon al azar con el poder de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Los animales se enfrentan con un grupo de mutantes de transposon (entrada piscina), seguido por la recolección de la sangre y los tejidos unos días más tarde para identificar y cuantificar el número de mutantes en cada órgano (piscinas de salida). Las piscinas de salida se comparan con la piscina entrada para evaluar la aptitud en vivo de cada mutante. Este enfoque permite la proyección de un gran número de mutantes en un número limitado de animales. Con pequeñas modificaciones, este protocolo se puede realizar con cualquier modelo animal de la leptospirosis, embalse host modelos como las ratas y la infección aguda como hámsters, así como estudios en vitro . TN-Seq proporciona una poderosa herramienta para pantalla para mutantes con defectos de fitness en vivo y en vitro .

Creación de una biblioteca de mutantes de transposon en L. interrogans por verbal requiere una unidad de filtración, como se muestra en la figura 1. Hemos recuperado 100-200 transconjugants de cada apareamiento.
El sitio de inserción del transposón se identifica en cada mutante por secuenciación del producto PCR generado por PCR semi-random que se dirige al final de los transposones y secue...

Aquí describimos una técnica que combina la mutagénesis de transposon con secuenciación de alto rendimiento para identificar y cuantificar a mutantes de transposon leptoespiral en tejidos después de un desafío de hámsters. Este protocolo puede utilizarse para mutantes de pantalla para la supervivencia y difusión en los animales y también se puede aplicar a estudios en vitro .

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

El objetivo general de esta técnica de secuenciación de transposones de alto rendimiento es identificar y cuantificar mutantes de transposones con defectos de aptitud in vivo e in vitro y, por lo tanto, identificar los genes de Leptospira implicados en la virulencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Leptospira, como la identificación de genes implicados en la colonización, la diseminación y la supervivencia de las bacterias en el huésped. La principal ventaja de esta técnica es que se puede cribar un gran número de mutantes con un número limitado de animales.Aunque este método fue diseñado para examinar la aptitud de los mutantes de Leptospira interrogans en el modelo de hámster con leptospirosis aguda, también se puede aplicar a través de modelos de infección crónica, estudios in vitro y otras cepas de Leptospira. Kritel Lourdault y Karen Evangelista, ambas postdoctoradas de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Primero, ensamble una unidad de filtración.Coloque la base en un matraz Erlenmeyer de brazo lateral de 125 mililitros. Coloque un filtro de celulosa de acetato en la base y sujete un embudo en la base. Conecte la un

high-throughput-parallel-sequencing-to-measure-fitness-leptospira

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Inyección pronuclear de (PN) del cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y sistema CRISPR asociados 9 proteína nucleasa (CRISPR/Cas9) es un método altamente eficiente para la producción de transgénicos hámsters sirios dorados. Adjunto, describimos el protocolo detallado de la inyección del PN para la producción de hamsters de gene knockout con el sistema CRISPR/Cas9.

Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9

Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella;  sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

La hemizigosidad recíproca a través de la secuenciación (RH-seq) es un nuevo y poderoso método para mapear la base genética de una diferencia de rasgos entre especies. Los grupos de hemizygotes son generados por la mutagénesis de la transposon y su estado físico es rastreado a través del crecimiento competitivo usando la secuenciación alta a lo largo de la secuenciación. El análisis de los datos resultantes identifica los genes subyacentes al rasgo.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Aquí, se describe la aplicación de la interferencia CRISPR (CRISPRi) para el silenciamiento de genes específicos en especies de Leptospira. Las células de leptospira se transforman por conjugación con plásmidos que expresan dCas9 (catalíticamente "muerto" Cas9) y un ARN de guía única (sgRNA), responsable del emparejamiento de bases a la diana genómica deseada. Se presentan métodos para validar el silenciamiento génico.

Aplicación de interferencia CRISPR (CRISPRi) para silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira

Este es un método adaptado para identificar factores candidatos de colonización de insectos en un simbionte beneficioso de Burkholderia. El huésped escarabajo está infectado con una biblioteca mutante aleatoria generada a través de la mutagénesis del transposón, y la complejidad de la biblioteca después de la colonización se compara con un control cultivado in vitro.

Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

En este trabajo presentamos una evaluación longitudinal de hámsters dorados infectados por vía intraperitoneal (IP) o intragingival (IG) con L. infantum-Luc mediante imagen bioluminiscente y por PCR. Los hámsters fueron evaluados 1 día después de la infección (1 dpi), 1 semana después de la infección (8 dpi) y 3 semanas después de la infección (22 dpi) y se les practicó la eutanasia a los 50dpi y 8 meses después de la infección.

In vivo Imágenes de hámsters infectados con Leishmania infantum mediante inoculación gingival de amastigotes axénicos que expresan luciferasa

Este protocolo ofrece un flujo de trabajo modular BSL-2 que combina ensayos de biomasa cristal-violeta, cinética de contraste de fase en lapso de tiempo, mapeo confocal 3D/matricial, ultraestructura SEM y un módulo in vivo de infección por hámster para cultivar, cuantificar, caracterizar e investigar el papel funcional de la biopelícula de Leptospira , permitiendo la evaluación estandarizada de mutantes e intervenciones antibiofilm en laboratorios.

Un flujo de trabajo modular para el análisis cuantitativo, estructural y funcional de biopelículas de Leptospira

Aprende a identificar genes de virulencia en Leptospira interrogans mediante secuenciación masiva de transposones en modelo de hámster. Este método permite evaluar el fitness de mutantes in vivo con uso mínimo de animales.

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección (Video) | JoVE Journal

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Explorar más videos